一种疫苗冻干耐热保护剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及疫苗保护剂技术领域，特别是一种疫苗冻干耐热保护剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(ped)、猪传染性胃肠炎(tge)和猪轮状病毒病是我国猪群中危害最严重的三种病毒性腹泻病，三种病原可感染所有日龄的猪只，均可引起呕吐、水样腹泻和脱水等症状。对10日龄以内仔猪的危害尤为严重，发病率和病死率高，可达100％。发病后没有有效的治疗办法，目前唯一的手段是用疫苗进行预防接种。猪流行性腹泻(ped)、猪传染性胃肠炎(tge)和猪轮状病毒病活疫苗以及大多数兽用活疫苗产品使用常规冻干保护剂。常规保护剂主要成分为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单、配制简便、易溶性良好，但热稳定性和保护功能差，产品的保存条件较为苛刻，大多需要在-15℃以下保存。在疫苗生产、运输以及使用过程中，如果冷链系统控制不当，疫苗保存环境温度升高，常常导致疫苗效力下降或失效，造成免疫失败。发达国家早在20世纪80年代就开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热保护剂生产活疫苗，但由于保护剂的研究和应用均属于专利资料，各国都处于保密状态，耐热冻干保护剂比常规的冻干保护剂更周到地考虑了具有生物活性的制品在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响，通过添加填充剂、防冻剂、抗氧化剂、酸碱调整剂、缓冲剂、羟基中和剂、低分子化合物、高分子化合物等，确保病毒在2～8℃条件下，保存期可达24个月以上，效价无明显下降，因而其保护性能要比传统保护剂更为优良，从而使活疫苗的储存、运输和使用更方便、经济。随着我国规模化养殖的飞速发展，防疫质量是其中的关键问题，活疫苗的冷链运输及储存温度要求非常高，控制不好直接影响疫苗质量，耐热保护剂的研制开发显得尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的是要解决现有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)因冷链运输控制不好而影响疫苗质量的问题，提供一种疫苗冻干耐热保护剂及其制备方法和应用。
4.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
5.本发明的第一个目的是要提供一种疫苗冻干耐热保护剂，所述疫苗冻干耐热保护剂用于猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗，由以重量百分比的以下组分组成：
[0006][0007]
余量为注射用水。
[0008]
优选地，所述疫苗冻干耐热保护剂，由以重量百分比的以下组分组成：
[0009][0010]
余量为注射用水。
[0011]
本发明的第二个目的是要提供上述疫苗冻干耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
s1、按重量百分比取明胶、脑心浸液、胰蛋白胨、海藻糖、蔗糖、硫代硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30、葡聚糖、甘露醇和注射用水，将明胶、脑心浸液、胰蛋白胨、海藻糖、蔗糖、硫代
硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30、葡聚糖、甘露醇依次溶解到占待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积3/5的沸腾的注射用水中，待全部溶解后加入注射用水至溶液体积为待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积的4/5，然后于116℃下灭菌处理25分钟，得到保护剂a；
[0013]
s2、按重量百分比取甘氨酸、谷氨酸钠、l-精氨酸，将甘氨酸、谷氨酸钠、l-精氨酸依次溶解在占待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积1/10的常温注射用水中，待完全溶解后，加入注射用水至溶液体积为待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积的1/5；然后使用0.22微米除菌滤芯过滤，收集滤液即为保护剂b；
[0014]
s3、将保护剂a降至常温后和保护剂b充分混合，制成疫苗冻干耐热保护剂。
[0015]
本发明的第三个目的是要提供一种疫苗冻干耐热保护剂在制备猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活冻干疫苗中的应用，包括：取所述疫苗冻干耐热保护剂与猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗抗原按体积2:3充分搅拌混合并控温，待混合液温度升至20℃后分装，经真空冷冻干燥处理得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活冻干疫苗。
[0016]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017]
本发明的疫苗冻干耐热保护剂，各组分相互作用，提高猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗冻干过程中对温度的耐受性，减少效力损失，冻干前后病毒损失率不超过0.2个滴度。
[0018]
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)结合本发明的疫苗冻干耐热保护剂后耐老化程度高，37℃放置15天，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.2～0.3个滴度，2～8℃条件下可存放36个月，滴度无明显下降，说明本发明解决了常规保护剂活疫苗因冷链运输控制不好影响疫苗质量的问题。
[0019]
本发明的疫苗冻干耐热保护剂的原料成本低、配制方法简单、可实现工业大规模生产。
具体实施方式
[0020]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
[0021]
以下实施例所用的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗为猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)抗原，来自吉林正业生物制品股份有限公司生产，其余各组分或原料无特别限定的，可直接市购，本实施例不再记载其具体来源。
[0022]
实施例1
[0023]
一种疫苗冻干耐热保护剂，用于猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗，由以重量百分比的以下组分组成：
[0024]
明胶0.8％、脑心浸液5.5％、胰蛋白胨4.5％、海藻糖8％、蔗糖2.5％、硫代硫酸钠2％、聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)1％、葡聚糖0.5％、甘露醇0.4％，甘氨酸0.3％、谷氨酸钠0.05％、l-精氨酸0.25％，余量为注射用水。
[0025]
上述疫苗冻干耐热保护剂的制备方法如下：
[0026]
s1、按重量百分比取明胶、脑心浸液、胰蛋白胨、海藻糖、蔗糖、硫代硫酸钠、聚乙烯
吡咯烷酮k30、葡聚糖、甘露醇和注射用水，将明胶、脑心浸液、胰蛋白胨、海藻糖、蔗糖、硫代硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30、葡聚糖、甘露醇依次溶解到占待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积3/5的沸腾的注射用水中，待全部溶解后加入注射用水至溶液体积为待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积的4/5，然后于116℃下灭菌处理25分钟，得到保护剂a；
[0027]
s2、按重量百分比取甘氨酸、谷氨酸钠、l-精氨酸，将甘氨酸、谷氨酸钠、l-精氨酸依次溶解在占待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积1/10的常温注射用水中，待完全溶解后，加入注射用水至溶液体积为待配制疫苗冻干耐热保护剂总体积的1/5；然后使用0.22微米除菌滤芯过滤，收集滤液即为保护剂b；
[0028]
s3、将保护剂a降至常温后和保护剂b充分混合，制成疫苗冻干耐热保护剂。
[0029]
实施例2
[0030]
与上述实施例1的不同在于：所述疫苗冻干耐热保护剂由以重量百分比的以下组分组成：
[0031]
明胶0.6％、脑心浸液6.5％、胰蛋白胨3.5％、海藻糖6％、蔗糖3％、硫代硫酸钠2.5％、聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)0.6％、葡聚糖0.6％、甘露醇0.3％，甘氨酸0.4％、谷氨酸钠0.03％、l-精氨酸0.2％，余量为注射用水。
[0032]
实施例3
[0033]
与上述实施例1的不同在于：所述疫苗冻干耐热保护剂由以重量百分比的以下组分组成：
[0034]
明胶1％、脑心浸液4.5％、胰蛋白胨3.5％、海藻糖10％、蔗糖2％、硫代硫酸钠1.5％、聚乙烯吡咯烷酮(pvpk30)1.2％、葡聚糖0.4％、甘露醇0.5％，甘氨酸0.2％、谷氨酸钠0.06％、l-精氨酸0.3％，余量为注射用水。
[0035]
对比例
[0036]
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)常规保护剂，包括以下重量组分：明胶10％,、蔗糖40％，余量补注射用水。配制方法：称取配制总体积的3/5注射用水，将明胶、蔗糖依次溶解，待上种试剂完全溶解后再进行下个试剂的溶解，待全部溶解后余量补注射用水，116℃高压灭菌20分钟，即得对比例保护剂。
[0037]
实施例4
[0038]
上述疫苗冻干耐热保护剂主要用于猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)冻干保存，分别取上述实施例1、实施例2和实施例3制得的疫苗冻干耐热保护剂与猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)抗原按体积2:3充分搅拌混合并控温，待混合液温度升至20℃后分装，3.5ml/瓶；对比例常规保护剂与猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)抗原按1：7混合配苗分装，2.4ml/瓶；然后立即经真空冷冻干燥处理得猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活冻干疫苗。
[0039]
分别取实施例4制备的冻干疫苗作为样品进行如下检测：
[0040]
⑴
性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
[0041]
⑵
无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无菌生长。
[0042]
⑶
支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无支原体生长。
[0043]
⑷
外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无外源病毒污染。
[0044]
⑸
鉴别检验用rpmi 1640维持液或dmem维持液将1头份疫苗(1ml)作1000倍稀释，与猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)3种特异性阳性血清的混合液(各阳性血清中和抗体效价均应不低于1:128，比例为1:1:1)等量混合，置37℃中和1小时，分别接种已长成良好单层的st、vero、marc-145细胞培养瓶(规格为25ml)各4瓶，0.6ml/瓶。同时设st、vero、marc-145正常细胞对照各4瓶；设弱毒华毒株、弱毒cv777株、nx株三个病毒对照各4瓶，各接种病毒液每瓶0.3ml。置37℃、含5％培养箱中培养5～7日，逐日观察并记录cpe。阳性血清中和病毒组和正常细胞对照组均应不出现cpe，病毒对照组均应出现cpe。
[0045]
⑹
安全检验用3～5日龄健康易感仔猪4头，各经后海穴位接种疫苗10头份(按瓶签注明头份用无菌生理盐水将疫苗稀释为1头份/ml)，连续观察14日。试验猪均无不良反应。
[0046]
⑺
效力检验
[0047]
病毒含量测定
[0048]
①
猪传染性胃肠炎病毒含量的测定用rpmi1640维持液将疫苗稀释成1头份/ml，与pedv、porv特异性阳性血清混合液(中和抗体价均为1:32，比例为1:1)等量混合，置37℃温箱中和1小时，作10倍系列稀释，取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
4个稀释度，分别接种已长成良好st细胞单层的96孔培养板(接毒前用不含胰酶的rpmi 1640维持液洗3遍)，每个稀释度接种8孔，l0μl/孔，加入rpmi1640维持液90μl/孔，置37℃、含5％co2培养箱中培养5～7日，逐日观察并记录cpe，按reed-muench法计算tcid
50
，头份病毒含量应≥10
5.0
tcid
50
。
[0049]
②
猪流行性腹泻病毒含量的测定用rpmi1640维持液将疫苗稀释成1头份/ml，与tgev、porv特异性阳性血清混合液(中和抗体价均为1:32，比例为1:1)等量混合，置37℃温箱中和1小时，作10倍系列稀释，取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
4个稀释度，接种已生长良好vero细胞单层的96孔培养板(接毒前用不含胰酶的rpmi 1640维持液ii洗3遍)，每个稀释度接种8孔，l0μl/孔，加入rpmi1640维持液90μl/孔，置37℃、含5％co2培养箱培养5～7日，逐日观察并记录细胞病变(cpe)，按reed-muench法计算tcid
50
，头份病毒含量应≥10
5.0
tcid
50
。
[0050]
③
猪轮状病毒含量测定用dmem维持液将疫苗稀释成1头份/ml，加入终浓度为20μg/ml的胰酶，置37℃温箱处理1.5小时，与tgev、pedv特异性阳性血清混合液(中和抗体价均为1:32，比例为1:1)等量混合，置37℃温箱中和1小时，作10倍系列稀释，取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
4个稀释度，接种已长成良好marc-145细胞单层的96孔培养板(接毒前用0.01mol/l、ph值7.2的pbs洗3次)，每个稀释度接种8孔，l0μl/孔，加入dmem维持液90μl，置37℃、含5％co2培养箱培养5～7日，逐日观察并记录cpe，按reed-muench法计算tcid
50
，头份病毒含量应≥10
5.0
tcid
50
。
[0051]
⑻
剩余水份测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，各样品剩余水份均≤3.5％。
[0052]
⑼
真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，各样品真空度均合格。
[0053]
⑽
非洲猪瘟病毒核酸检验按现行《中国兽药典》附录进行测定，非洲猪瘟病毒核酸应为阴性。
[0054]
使用实施例1制备的疫苗冻干耐热保护剂制成的冻干疫苗和使用对比例常规保护剂制成的冻干疫苗在不同条件和放置不同时间病毒含量情况，单位是lgtcid
50
/头份。
[0055]
⑴
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+
弱毒cv777株+nx株)冻干前后毒价变化如表1所示。
[0056]
表1
[0057][0058]
从表1结果可以看出，采用本发明的耐热保护剂疫苗在冻干过程的保护性能略优于常规保护剂疫苗，重复3次试验猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒冻干病毒冻干损失均在0.2滴度以内。
[0059]
⑵
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)耐老化实验和保存期实验
[0060]
将使用实施例1制备的疫苗冻干耐热保护剂制成的冻干疫苗和使用对比例常规保护剂制成的冻干疫苗，分别置37℃和2～8℃保存，定期取出若干瓶，检测病毒含量变化情况，其结果见表2表3。
[0061]
表2
[0062]
[0063][0064]
表3
[0065]
[0066][0067]
由表2可知，常规保护剂疫苗通过3次重复实验数据可以看出在37℃耐热15天，病毒含量降低2.3～2.5个滴度，使用实施例1制备的疫苗冻干耐热保护剂制成的冻干疫苗损失在0.3个滴度以内。
[0068]
由表3可知，常规保护剂疫苗通过3次重复实验数据可以看出在2～8℃保存36个月，病毒含量降低1.8～2.3个滴度，使用实施例1制备的疫苗冻干耐热保护剂制成的冻干疫苗损失在0.3个滴度以内。
[0069]
综上所述，本发明的疫苗冻干耐热保护剂能有效提高传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株)的保存期。
[0070]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。