一种抗大口黑鲈蛙虹彩病毒的中药组合物及其应用

1.本发明涉及水产动物疾病防治领域，具体涉及一种抗大口黑鲈蛙虹彩病毒的中药组合物及其应用。


背景技术：

2.大口黑鲈(micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖鱼类，因其肉质鲜美，深受国人喜爱，目前其在我国的年产量约为50万吨，有着“第五大家鱼”之称。但近年来，随着养殖密度的不断提高以及养殖环境的恶化，病害暴发日益严重，严重影响了产业的发展。其中，养殖阶段危害最大的是体表溃疡综合征，其病原为大口黑鲈蛙虹彩病毒(largemouth bass virus, lmbv)，它可造成养殖阶段大口黑鲈的大量死亡，死亡率可达70%以上。
3.疫苗一直以来是病害防控的重要利器，在人类以及动物的疫病防控中起着举足轻重的作用。水产动物疫病研究历经一个多世纪的发展，在我国取得了长足的进步，但因水产动物本身的特性决定了水产动物疫苗具有注射免疫操作复杂，容易产生应激，免疫效果相对较差等缺点。中草药自然来源广、安全性高、残留低、不易引起药源性疾病和产生耐药性，对环境污染也少。因此，中草药在水产养殖中对抗感染性疾病具有很大的优势和应用前景。
4.然而，以往中草药在水产疾病的研究中，主要局限在中草药的粉未或粗提取物，存在着有效成分含量低、原料用量大、疗效慢等缺点。鉴于此，有必要研究与开发活性高的中草药有效部位的新组方用于预防和治疗水产疾病药物尤为重要。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种抗大口黑鲈蛙虹彩病毒的中药组合物，该中药组合物对感染大口黑鲈蛙虹彩病毒的鲈鱼具有明显的保护和治疗作用。
6.本发明是通过以下技术方案实现：一种抗大口黑鲈蛙虹彩病毒的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由五倍子提取物、石榴皮有效部位、山竹壳提取物和黄芩有效部位按质量比为1-5:1-5:1-5:1-5组成。
7.优选的，五倍子提取物、石榴皮有效部位、山竹壳提取物和黄芩有效部位的质量比为1:1:1:1。
8.五倍子为漆树科植物盐肤木属植物叶上的虫瘿，产自广西桂林，属于“肚倍”。五倍子的主要有效成分是单宁酸。经研究，五倍子50%乙醇提取物中总鞣质含量较高，因此，优选的，所述五倍子提取物为50%乙醇提取物，五倍子提取物中总鞣质含量大于60%。
9.山竹壳是将新鲜山竹果实，除去果肉，烘箱60℃烘干得到。山竹壳提取物中主要的有成分类型为xanthones，经研究，山竹壳70%乙醇提取物中xanthones含量较高，因此，优选的，所述山竹壳提取物为70%乙醇提取物, 山竹壳提取物中α-mangostin含量大于15%。
10.本发明的五倍子提取物和山竹壳提取物可以通过将原料经醇提取后过滤、浓缩、干燥即得。
11.优选的，所述石榴皮有效部位的制备方法，具体包括如下步骤：（1）取干燥石榴皮，粉碎，加入10-16倍量的体积浓度为50-60%的乙醇浸泡1-2小时，再加热回流提取1-2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，减压浓缩干燥，得石榴皮提取物；（2）将石榴皮提取物用水超声溶解，缓慢吸附于大孔树脂5，静置过夜，分别用水、50%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱部位，即得石榴皮有效部位。
12.优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂为dm301大孔树脂。
13.石榴皮中含有丰富的鞣质类成分，对其生物活性起着重要作用。通过dm301大孔树脂对其提取物进行分离纯化，得到50%醇洗部位；其中的鞣质含量从提取物中的22.6%增加到有效部位的49.2%，其重量为提取物的37.1%。而水洗以及95%醇洗部位的鞣质含量都低于10%。因此，我们选择石榴皮的50%醇洗部位作为其有效部位。
14.优选的，所述黄芩有效部位的制备方法，具体包括如下步骤：（1）取干燥黄芩，粉碎，加入12-16倍量的体积浓度为60-70%的乙醇浸泡1-2小时，再加热回流提取1-2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，减压浓缩干燥，得黄芩提取物；（2）将黄芩提取物用水超声溶解，缓慢吸附于大孔树脂，静置过夜，分别用水、70%乙醇、95%醇进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱部位，即得黄芩有效部位。
15.优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂为hpd100大孔树脂。
16.黄芩为唇行科植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)的根，黄芩中含有丰富的黄酮类成分，是其发挥药理作用的主要成分。通过hpd100大孔树脂对其提取物进行分离纯化，得到70%醇洗部位；其中总黄酮的含量从提取物中的43.8%提高到有效部位的78.3%，其重量为提取物的50%。而其它水洗部位和95%醇洗部位的总黄酮含量分别为7.9%和7.0%。因此，我们选择黄芩的70%醇洗部位作为其有效部位。
17.本发明另一方面还提供了上述中药组合物在制备预治大口黑鲈蛙虹彩病毒病药物中应用。
18.本发明另一方面还提供了一种防治大口黑鲈蛙虹彩病毒病药物，以上述所述的抗大口黑鲈蛙虹彩病毒的中药组合物作为有效成分。
19.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：本发明通过有效部位的筛选，以五倍子提取物、石榴皮有效部位、山竹壳提取物和黄芩有效部位配伍组方，经体内抗病毒活性实验结果表明，本发明制备得到的中药组合物对感染大口黑鲈蛙虹彩病毒的鲈鱼具有明显的保护和治疗作用，可开发成为新的预治大口黑鲈蛙虹彩病毒病药物。
具体实施方式
20.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方
式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
21.【五倍子提取物的制备】称取干燥五倍子10 kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度为50%乙醇浸泡2小时，再加热回流2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得五倍子提取物干样品6.5 kg，提取率65%。采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定了五倍子提取物中总鞣质含量,结果表明其鞣质含量高达72%。
22.【山竹壳提取物的制备】称取干燥山竹壳10kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度70%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得山竹壳提取物干样品1.7 kg，提取率为17%，通过hplc法测得在山竹壳提取物中α-mangostin的含量为20.5%。
23.【石榴皮有效部位的制备】称取干燥石榴皮10 kg，粉碎，加入15倍量的体积浓度50%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得石榴皮提取物干样品4.1 kg，提取率为41%,采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定其鞣质含量为22.6%；将石榴皮提取物用水超声溶解，缓慢吸附于dm301大孔树脂柱，静置过夜，分别用水、50%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱部位作为石榴皮有效部位，采用中国药典通则2202的鞣质含量测定法测定其鞣质含量为49.2%。
24.【黄芩有效部位的制备】称取干燥黄芩10 kg, 粉碎，加入15倍量的体积浓度70%乙醇浸泡2小时，再加热回流提取2小时，过滤，药渣重复提取1次，合并滤液，旋蒸减压浓缩，60℃真空干燥，得黄芩提取物干样品3.3 kg，提取率为33%，通过紫外分光光度法测得总黄酮含量为43.8%；将黄芩提取物用水超声溶解，缓慢吸附于hpd100大孔树脂柱，静置过夜，分别用水、70%乙醇、95%醇进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱部位作为黄芩有效部位，通过紫外分光光度法测得总黄酮含量为78.3%。
25.实施例1：将五倍子提取物100g、石榴皮有效部位100g、山竹壳提取物100g和黄芩有效部位100g混合，得到中药组合物ⅰ。
26.实施例2：将五倍子提取物50g、石榴皮有效部位50g、山竹壳提取物100g和黄芩有效部位100g混合，得到中药组合物ⅱ。
27.实施例3：将五倍子提取物80g、石榴皮有效部位50g、山竹壳提取物120g和黄芩有效部位160g混合，得到中药组合物ⅲ。
28.对比例1：将五倍子提取物100g、山竹壳提取物100g和黄芩有效部位100g混合，得到中药组合物ⅳ。
29.实施例4：体内抗病毒活性实验：
一、材料与方法1.1 病毒大口黑鲈蛙虹彩病毒，tcid
50
为10
9.28
/ml，由浙江省淡水水产研究所制备、鉴定及提供（参见：oral vaccination with recombinant pichia pastoris expressing iridovirus major capsid protein elicits protective immunity in largemouth bass (micropterus salmoides)）。
30.1.2 实验鱼试验用健康大口黑鲈由浙江省淡水水产研究所八里店基地提供，试验用鲈鱼为该场自繁自育，平均规格为30g/尾左右，鲈鱼的规格整齐，鳞片和鳍条完整、体色正常、无畸无伤，游动和摄食正常，购入前随机从池塘中捕出5尾，对鳃和鳍条镜检无寄生虫；肝、肾用tsa平皿细菌分离培养结果无细菌感染，肝、肾组织pcr方法检测未检出蛙虹彩病毒；血液蛙虹彩病毒抗体检测为阴性。
31.1.3 饲料基础饲料购自天邦饲料有限公司宁波分公司。饲料的粗蛋白含量≥28.5%,粗脂肪≥3.0%,粗纤维≤10.0%,粗灰分≤18.0%,总磷≥0.5%,水分≤120.0%,赖氨酸≥1.5%。
32.试验饲料为在基础饲料的基础上再分别添加0%、0.1%、0.3%和0.6%的实施例1制备得到的中药组合物ⅰ药物，分别为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，在基础饲料的基础上添加0.1%的对比例1制备得到的中药组合物ⅳ药物，作为对照组。简单地说，在基础日粮中加入不同含量的药物水溶液，混合均匀，干燥，即得不同的试验饲料。临时配制使用，所有试验饲料均储存在4℃冰箱中，备用。
33.1.4 饲养管理试验用健康大口黑鲈在实验室控温养殖水槽中暂养2周，随后将初始体重约为25.0
±
2g的大口黑鲈随机分为空白对照组、低、中、高剂量组、对照组5个试验组，每组设3个重复，每个平行10尾鱼。分别饲喂含0%、0.1%、0.3%、0.6%中药组合物ⅰ、0.1%的中药组合物ⅳ的试验饲料。每天9点和17点饲喂试验饲料，每次饲喂量约为鱼体重的2-3%。为保持饲养条件，每天吸污换水（换水量不超过水体1/3）以确保水质，24h连续充气增氧，期间保持水温25
±
1℃，ph=8.5，溶解氧不低于6mg/l。
34.1.5 体内药效实验将分好组的健康大口黑鲈分别采用相应的饲料喂养5d，随后进行攻毒试验。每尾腹腔注射100μl的5
×
tcid
50
的lmbv病毒液攻毒后每天投喂含药物饲料，并每天观察记录鱼死亡情况，连续观察14天，统计死亡录，计算药物对实验鱼的保护率，结果如表1所示。
35.；表1喂食5天后感染大口黑鲈蛙虹彩病毒鲈鱼的死亡率和保护率
如表1所示，通过饲喂含0.1%、0.3%、0.6%的中药组合物ⅰ的饲料，对攻毒大口黑鲈蛙虹彩病毒后，其高、中、低剂量组的保护率分别为13.3%、23.3%、36.7%，而空白对照组则全部死亡，说明本发明中药组合物ⅰ对感染大口黑鲈蛙虹彩病毒的鲈鱼具有一定的保护作用，且存在一定的浓度依赖关系。
36.通过饲喂含0.1%的对比例制备得到的中药组合物ⅳ的饲料，虽然对感染大口黑鲈蛙虹彩病毒的鲈鱼具有一定的保护作用，但其保护作用有限。由此表明，本发明的中药组合物各组分之间具有协同增效作用。