包含间充质干细胞和水凝胶的组合物及其应用的制作方法

包含间充质干细胞和水凝胶的组合物及其应用
1.本技术要求申请日为2021/10/26的中国专利申请2021112499379的优先权。本技术引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
2.本发明属于干细胞组织工程学领域，具体涉及一种包含间充质干细胞和水凝胶的组合物及其应用。


背景技术：

3.瘘管是通常不连接的器官或血管之间的异常连接或通道，可以在身体的不同部位形成。造成瘘管的原因包括创伤、外科手术、医疗并发症和疾病。
4.肛瘘是一种肛门直肠的常见病与多发病。正确查找和彻底封闭内外口、减少复发与括约肌功能保护是肛瘘手术治疗成功的关键，肛门功能保护是保证术后患者生活质量的重要前提。肛瘘常常由肛门周围感染引起，局部炎症大量破坏了周围组织及其干细胞，导致局部组织修复能力明显下降；加之由于手术切开引流创面大，疼痛剧烈，术后创面的愈合较慢；并且传统肛瘘手术不同程度地损伤肛门括约肌，导致肛门失禁发生率较高，患者生活质量明显下降。因此，肛瘘微创外科治疗技术成为国内外专家研究的热点，催生了各种微创手术如生物蛋白胶、肛瘘栓、干细胞肛瘘治疗等。虽然这些微创手术一定程度上减轻了手术痛苦、提高了手术成功率并有保护肛门括约肌的作用，但依旧有较高的复发率和各方面的局限性。
5.间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌健、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，医学界称之为“万用细胞”。间充质干细胞来源方便：骨髓、脂肪组织、脐带和胎盘组织、外周血等都可以取材，其中来源于健康脐带组织的脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，ucmsc)因取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，具有较强免疫调控作用的同时又没有配型、排异等问题，是最具临床应用前景的多能干细胞。
6.所有亲水性或水溶性的高分子聚合物，通过物理或化学交联，都可以形成水凝胶。水凝胶拥有网格状的三维结构，并且能够吸收大量水发生溶胀却不会溶于水。科学家利用这一特性将干细胞与水凝胶结合，来修复损伤组织，他们认为水凝胶是干细胞移植的理想介质，可以帮助干细胞在体内存活。根据不同的目的和使用方法，有丰富的水凝胶材料种类可供选择，如壳聚糖、海藻酸钠和明胶等。同样，根据不同病例的不同情况，可以对特定水凝胶配方进行修改，既方便又能达到个性化治疗的目的。同时，水凝胶作为一种生物相容性组织，在起到细胞支架和与组织连接的桥梁作用的同时，可以延缓干细胞及其分泌物在体内被降解的过程，构建一个缓释系统，使干细胞在体内长期维持有效浓度，从而提高治疗效果。研究表明，干细胞在生理系统中对伤口愈合和组织修复的治疗作用主要是通过分泌外
泌体的方式发挥其功能，而水凝胶形成的三维网络能够模拟正常机体的微环境，给干细胞提供一个利于黏附、分化和增殖的粗糙表面，且能诱导干细胞的旁分泌系统，刺激干细胞分泌外泌体，从而增强对干细胞组织进行治疗和修复的能力。而胶原蛋白作为临床非常成熟的生物材料，在组织再生工程中早已得到广泛的应用，具有良好的生物相容性、低免疫原性、降解性和安全便捷等优点。
7.干细胞在治疗各种疾病方面拥有巨大潜能，脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，adsc)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，目前已经在临床上有了丰富的应用(ceccarelli s,et al.,immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells:the cutting edge of clinical application.front cell dev biol.2020；8:236)。日本武田制药(takeda)于2021年1月10日宣布，已向日本厚生劳动省提交了一份申请，生产和销售darvadstrocel(即cx601)。适应症为非活动性/轻度活动性管腔克罗恩病(crohn’s disease，cd)成人患者的复杂肛瘘。
8.国内尚无相关专利，但已有adsc治疗克罗恩肛瘘相关疾病的临床试验(yang zhang,et al.autologous adipose-derived stem cells for the treatment of complex cryptoglandular perianal fistula:a prospective case-control study.stem cell research&therapy(2020)11:475)。2020年由周春根等发表的文章中显示，与传统的切开拔线治疗相比，adsc是一种可行有效的治疗克罗恩瘘管的方法。可保护患者肛门功能、减轻疼痛、恢复快、耐受性好、提高围手术期生活质量。
9.2021年由arthur berger等人发表的文章(arthur berger,et al.local administration of stem cell-derived extracellular vesicles in a thermoresponsive hydrogel promotes a pro-healing effect in a rat model of colo-cutaneous post-surgical fistula.nanoscale.2021jan 7；13(1):218-232)中显示，来自于干细胞和基质细胞(stroma cell，sc)的细胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)，包括外泌体、微泡和囊小体，是细胞以组成型或诱导型释放的纳米大小(直径40-5000nm)的亚细胞膜封闭实体，有望促进组织愈合。实验也证实了ev的多效性效应。
10.2014年由a.beraru团队发表的文章(a beraru,et al.,efficacy of periurethral injections of polyacrylamide hydrogeland quality of life of patients with urinary incontinence due to sphincter deficiency(iue-is).prog urol.2014jun；24(8):501-10)中，他们对80例括约肌功能不全患有严重尿失禁的女性采用了bulkamid发明的新型治疗方案，即在尿道外周注射聚丙烯酰胺水凝胶。在随后的随访时间内，每位患者平均随访18.6
±
5.3个月，有60％的患者总体情况评分得到改善，注射部位无脓肿或感染，没有针对所使用产品的并发症，水凝胶注射针对女性尿失禁是一种安全有效的方案，手术简单不会造成并发症，从而提高患者生活质量。
11.2021年由e.piantanida等人发表的文章(e.piantanidaah,et al.,nanocomposite hyaluronic acid-based hydrogel for the treatment of esophageal fistulas.materials today bio volume 10,march 2021,100-109)中，开发了一种基于透明质酸(hyaluronic acid，ha)的可注射纳米复合水凝胶来研究其长期促进愈合的能力。ha是自然界中功能最丰富的大分子之一，是天然细胞外基质的重要组成部分，对伤口愈合有重要的作用。实验证实了透明质酸水凝胶的原位注射有利于治疗，手术便捷，恢复快。
12.综合上述资料，可知采用干细胞/水凝胶治疗肛瘘论具有创伤小、无括约肌损伤、疼痛轻、修复快、复发率低、住院时间短等特殊优势，安全性与有效性得到了初步认证，其优势是目前手术与微创等传统治疗方法所不具备的。
13.虽然国外已有darvadstrocel，但单一的adsc悬浮液治疗肛瘘存在一个缺点：darvadstrocel仅注射于瘘管壁和瘘口，不对瘘管进行处理，从而不能使干细胞最大限度的得到利用。另外，国内干细胞治疗肛瘘领域研究存在例数少、随访时间短、术后评估不够完善等问题，且研究方向较多依赖于自体移植的adsc，需要多次手术，则会增加患者痛苦，且自体干细胞数量有限，也存在不能使用的风险。


技术实现要素：

14.本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少可以有效治疗瘘管的间充质干细胞凝胶的组合物的缺陷，提供一种包含间充质干细胞和水凝胶的组合物及其应用。本发明的组合物可以通过注射或者填充在瘘管部位，可以提高治疗效果，降低了手术难度和次数。
15.本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
16.本发明的第一方面提供了一种包含间充质干细胞和水凝胶的组合物，所述间充质干细胞分散在所述水凝胶中。
17.本发明一些实施方案中，所述间充质干细胞包括一种或多种间充质干细胞，和/或其分泌物。
18.在本发明一些较佳实施方案中，所述分泌物为细胞外囊泡(extracellular vesicle)。
19.在本发明一些更佳实施方案中，所述细胞外囊泡选自外泌体、微囊泡和囊小体。
20.本发明一些实施方案中，所述水凝胶包含胶凝剂，所述胶凝剂选自天然胶凝剂和合成胶凝剂。
21.本发明中，所述胶凝剂可根据外界刺激分为传统水凝胶和敏感水凝胶，包含但不限于：化学物质响应型(包括ph等)，物理因素响应型(包括温度、光照、电场、磁场、声场、压力等)和生物信号响应型(包括酶、葡萄糖、三磷酸腺苷等)。
22.本发明中，所述胶凝剂可按键合方式分为物理水凝胶(可逆凝胶)和化学水凝胶(不可逆凝胶)。
23.在本发明一些较佳实施方案中，所述胶凝剂选自胶原蛋白、明胶、透明质胶、壳聚糖、透明质酸、纤维蛋白、海藻酸、纤维素、琼脂糖、葡聚糖、瓜胶、蛋白质、乙二醇、丙烯酸及其衍生物、丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酸羟乙酯及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物以及聚甲基丙烯酸及其衍生物中的一种或多种。
24.在本发明一些更佳实施方案中，所述胶凝剂选自胶原蛋白(collagen,col)、甲基丙烯酰化明胶(methacrylated gelatin,gelma)及其衍生物、甲基丙烯酰化i型胶原及其衍生物、甲基丙烯酰化ii型胶原及其衍生物、甲基丙烯酰化壳聚糖及其衍生物(methacrylated carboxymethyl chitosan，cmcsma)、以及甲基丙烯酰化i型海藻糖及其衍生物、甲基丙烯酰化透明质酸(methacrylated hyaluronic acid,hama)及其衍生物、甲基丙烯酰化丝素蛋白和甲基丙烯酰化肝素中的一种或多种。
25.在本发明以较佳实施方案中，不同配方水凝胶可为以hama为主体的水凝胶，简称为hgel：
26.h1：hama 0.1％～0.3％，gelma 1％～30％；h2：hama 0.3％～0.5％，gelma1％～30％；h3：hama 0.5％～1％，gelma 1％～30％；h4：hama 1％～2.5％，gelma 1％～30％。
27.不同配方水凝胶还可为以cmcsma为主体的水凝胶，简称为cgel：
28.c1：cmcsma 0.25％～0.5％，gelma 1％～30％；c2：cmcsma 0.5％～1％,gelma 1％～30％；c3：cmcsma 1％～2％,gelma 1％～30％；c4：cmcsma2％～5％,gelma 1％～30％。
29.所述水凝胶较佳地还包含助剂，所述助剂选自引发剂、交联剂和加速剂中的一种或多种。
30.其中，所述引发剂可为本领域常规，优选地选自光引发剂2959(2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮)、光引发剂lap(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂)和核黄素中的一种或多种。
[0031]
所述交联剂可为本领域常规，较佳地为n,n-亚甲基双丙烯酰胺。
[0032]
所述加速剂可为本领域常规，较佳地为四甲基乙二胺(temed)。
[0033]
本发明一些实施方案中，所述胶凝剂为甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酸酯化透明质酸的组合、或甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖的组合。
[0034]
本发明中，所述间充质干细胞的来源为人脐带组织、人脐带血、人胎盘、人脂肪组织、人骨髓、人牙髓、人宫血或由胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞；所述间充质干细胞具有多向分化潜能和自我更新的能力。
[0035]
优选地，所述间充质干细胞的来源为人脐带组织、人脐带血或人胎盘。
[0036]
本发明的人脐带间充质干细胞(hucmsc)，是取自于胚胎脐带，无需多次手术获取细胞，无伦理问题，来源广泛，易采集，易扩增；其是一种更原始的msc群，具有更强的增殖能力、更强和更多向的分化能力；其表面有更低的hla-abc(经典人类白细胞抗原ⅰ类抗原)和hla-dr表达；同时能分泌gm-csf、g-csf等一些其他干细胞无法分泌的因子，促进组织再生。
[0037]
本发明的人脐带间充质干细胞(hucmsc)具有特定的表面标志物cd73+、cd90+、cd105+、cd34-、cd45-、cd14-、cd19-等(dominici m,le blanc k,mueller i,slaper-cortenbach i,marini f,krause d,deans r,keating a,prockop dj,horwitz e.minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.the international society for cellular therapy position statement.cytotherapy.2006；8(4):315-7)。
[0038]
在本发明一些实施方案中，所述组合物还包括辅助药物。
[0039]
在本发明一较佳实施方案中，所述辅助药物选自免疫抑制剂、止痛剂和抗感染剂的一种或多种。
[0040]
所述免疫抑制剂可缓解异体植入时的免疫排斥反应。所述免疫抑制剂例如包括麦考酚酸类药物、糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制药物、环孢素、他克莫司、西罗莫司和依维莫司。
[0041]
所述止痛剂可帮助治疗瘘管部位的炎症或疼痛。所述止痛剂例如包括：非甾体药物、阿片类激动剂或水杨酸盐。
[0042]
所述抗感染剂可用于防止使用所述组合物治疗的部位的感染。所述抗感染剂例如
包括：抗寄生虫药物、抗厌氧菌药物、氨基糖苷类抗生素、抗真菌药物、头孢菌素类抗生素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素、青霉素类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素和四环素类抗生素。
[0043]
本发明的第二方面提供一种制备如第一方面所述的组合物的方法，所述方法包括：将所述间充质干细胞与所述水凝胶在溶媒中混合，即得。
[0044]
当所述水凝胶的胶凝剂为胶原蛋白时，所述混合的温度为30～37.5℃。
[0045]
当所述水凝胶的胶凝剂为甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酸酯化透明质酸、或甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖时，所述混合的条件为365～405nm光照。
[0046]
本领域技术人员应当理解，所述溶媒用于形成分散的细胞形式，并且不影响细胞的生长或细胞活力，对宿主无毒性；所述溶媒选自复方电解质注射液、生理盐水、pbs和基础培养基。
[0047]
所述生理盐水可为本领域常规的0.85～0.9％氯化钠水溶液。
[0048]
所述基础培养基可为本领域常规用于细胞培养的基础培养基。
[0049]
在本发明一较佳实施方案中，所述溶媒为复方电解质注射液。
[0050]
本发明中，所述溶媒为本领域公知的药学上可接受的载体、稀释液、缓冲液等溶剂。所述溶媒应当是无菌的，可在稳定的条件下生产、存储和运输。
[0051]
本发明的第三方面提供一种如第一方面所述的组合物在制备治疗瘘管的治疗剂中的应用。
[0052]
在本发明一较佳实施方案中，所述瘘管选自克罗恩疾病引发的瘘管，自身免疫缺陷引发的瘘管，外伤、手术或感染造成的瘘管。
[0053]
在本发明一更佳实施方案中，所述瘘管为肛瘘，例如为复杂性肛瘘。
[0054]
在本发明一些实施方案中，所述复杂性肛瘘为非活动性/轻度活动性管腔克罗恩病的复杂腔周瘘；例如，当瘘管对至少一种常规疗法或生物疗法无疗效时，只能在瘘管修复后使用。
[0055]
在本发明一较佳实施方案中，所述治疗剂选自再生组织生物制剂、喷雾剂、植入物或填充剂。
[0056]
在本发明一更佳实施方案中，所述再生组织生物制剂为注射细胞制剂。
[0057]
在本发明一些实施方案中，所述注射细胞制剂为注射细胞悬液和/或注射细胞凝胶制剂。
[0058]
本发明的第四方面提供一种治疗瘘管的方法，所述方法包括向受试者的瘘管部位注射或填充如第一方面所述的组合物。
[0059]
所述瘘管的优选限定如第三方面所述。
[0060]
所述向受试者的瘘管部位注射或填充是在全部麻醉或局部麻醉的手术环境下进行。
[0061]
在本发明一较佳实施方案中，所述间充质干细胞配制为合适浓度和体积的细胞悬液，通过注射器以小囊泡的形式注射到单个或多个内部开口周围的组织中。
[0062]
在本发明另一较佳实施方案中，所述间充质干细胞和水凝胶混合配制成细胞凝胶制剂，通过注射器注射到瘘管管腔内，并等待37℃下固化或用蓝光进行光照固化。
[0063]
所述注射是指向清创后的瘘口及瘘管壁注射所述细胞悬液或细胞凝胶制剂。
[0064]
对瘘道进行干细胞凝胶的填充，可以更多、更全面地使植入剂接触整个瘘管组织，而不仅仅局限于内瘘口和瘘管壁。在组织刷的强烈搔刮下，破坏瘘管上皮，再加以复合植入剂的填充，形成瘘管壁之间的连续性。而胶原蛋白/胶凝剂为天然高分子材料，可以作为干细胞生长的支持，并且具有一定的组织修复作用，可以加快瘘管组织再生和瘘管愈合。
[0065]
本发明中加入天然胶凝剂和/或合成胶凝剂作为干细胞的辅料，利用胶原蛋白和光敏胶凝剂37℃固化/405nm蓝光固化的特性，可以将干细胞均匀分散且固定，避免分布不均、流失、凝集成团等情况从而导致浓度改变、影响治疗结果等问题，即可最大限度地利用干细胞，得到符合希望的结果，同时也能适应复杂瘘道的形状，保证均一性，减小结果偏差。并且，胶原蛋白/光敏胶凝剂在注射或填充后固化，能够与复杂瘘道的形状更加匹配，提高了腔内操作的便利性和稳定性，同时胶原蛋白/光敏胶凝剂作为细胞外基质(extracellular matrix，ecm)重要组分，固化成型后构建的3d局部微环境更加有利于干细胞黏附和生长。而胶原蛋白/光敏胶凝剂作为临床非常成熟的生物材料，在组织再生工程中早已得到广泛的应用，能够自然降解和促进组织再生修复。
[0066]
本发明的第五方面提供一种如第一方面所述的组合物在制备体内微环境模拟系统中的应用。
[0067]
所述体内微环境模拟系统可为本领域常规，例如是指通过各种因素的相互作用模拟与样本来源一致的体内组织环境的系统。
[0068]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0069]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0070]
本发明的积极进步效果在于：
[0071]
(1)本发明的组合物将间充质干细胞与水凝胶进行配合，可有效促进瘘管愈合，达到与传统手术治疗方法相比相当甚至更优的效果，大大降低了手术难度和次数，同时也减小了创面、减轻了围手术期患者的不适感、缩短了病程、提高了治愈率、降低了复发率。
[0072]
(2)本发明采用天然高分子聚合物的水凝胶，使间充质干细胞在凝胶骨架上保持良好的增殖率、存活率，同时保持抗炎因子和外泌体的分泌；使用间充质干细胞，解决了干细胞使用的伦理问题、来源的局限性，并降低了操作的技术难度，同时对于自体干细胞而言，也避免了多次手术带来的疼痛。
[0073]
(3)本发明采用的胶原蛋白和光敏胶凝剂都可用于促进细胞在瘘管微环境下调控干细胞的分化进程，促进瘘管部位组织再生和愈合，解决了单一干细胞应用的局限性，提高了干细胞的存活率、延长复合植入物在治疗位的停留及作用时间、减轻复合植入物对组织局部的炎症刺激。
附图说明
[0074]
图1为实施例1结果示意图。
[0075]
图2为实施例3增殖率结果示意图。
[0076]
图3为实施例3迁移率结果示意图。
[0077]
图4为实施例6愈合时间结果示意图。
[0078]
图5为实施例6愈合程度结果示意图。
[0079]
图6为实施例6mri结果示意图；
[0080]
图中：a为治疗前，b为溶媒组，c为高剂量组，d为胶原蛋白+高剂量组，e为胶原蛋白+中剂量组，f为胶原蛋白+低剂量组。
[0081]
图7为实施例6组织学切片染色结果示意图。
[0082]
图8为实施例6组织学切片染色分组结果示意图；
[0083]
图中：a为第1天，b为第14天，c为第30天。
[0084]
图9为实施例2透射电镜观察结果示意图。
[0085]
图10为实施例2粒径检测结果示意图。
[0086]
图11为实施例2表面标志物鉴定结果示意图。
[0087]
图12为实施例4保留及释放实验结果示意图。
[0088]
图13为实施例4体外细胞炎症实验结果示意图。
[0089]
图14为实施例8瘘道愈合结果示意图。
具体实施方式
[0090]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0091]
表1生物材料和试剂
[0092][0093]
[0094]
本领域公知，基础培养基中加入fbs和三抗形成完全培养基。
[0095]
实施例1脐带组织来源间充质干细胞的干细胞表征
[0096]
(1)将hucmsc在完全培养基中进行培养；
[0097]
(2)取hucmsc进行hla-dr、cd14、cd19、cd31、cd34、cd44、cd45、cd73、cd90、cd166的细胞表征检测，结果如图1所示。
[0098]
由图1可知，培养的hucmsc细胞hla-dr、cd14、cd19、cd31、cd34、cd45表达率均为阴性，cd44、cd73、cd90、cd166表达率均为阳性，符合脐带间充质干细胞的特征。
[0099]
实施例2脐带组织来源间充质干细胞的外泌体鉴定
[0100]
1、外泌体的分离和鉴定
[0101]
对实施例1中的hucmsc按照文献(肖漓等，《脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定》，《中华细胞与干细胞杂志：电子版》2016年第4期236-239页)用外泌体提取试剂盒对上清液进行外泌体提取和相关鉴定，并将得到的无菌外泌体悬液置于-80℃冰箱保存、备用。
[0102]
2、鉴定结果
[0103]
(1)透射电镜观察外形，见图9。
[0104]
(2)用纳米颗粒跟踪分析仪进行粒径检测(nta)，见图10。
[0105]
(3)表面标志物cd63、cd81和tsg101的鉴定，见图11。
[0106]
由鉴定结果可知，所获得的外泌体符合细胞外囊泡的特征。
[0107]
实施例3胶原蛋白溶液(a剂-1)的制备
[0108]
(1)沉降率和存活率：用醋酸溶解胶原蛋白，浓度分别为10、7.5、5、2.5和1mg/ml，并用氢氧化钠调节ph至7.0，加入基础培养基补充体积，后以适当浓度加入adsc，分别进行沉降实验和培养实验，以calcine-am/pi共染色法对死活细胞染色来观察结果，结果如表2所示。
[0109]
表2胶原蛋白试验结果
[0110][0111]
(2)增殖率实验：取适量adsc细胞，离心后加入配好的a剂-1，混匀后放入96孔板中，培养时间分别为1、3、7、14和21天。在设定的时间点，进行cck-8染色实验，测od450后对应标准曲线，算出细胞数目，再进一步算出增殖率，结果如图2所示。
[0112]
(3)迁移率：取适量adsc细胞，离心后分别加入配好的a剂-1，混匀后加入transwell中，下室分别为基础培养基、基础培养基+10％ fbs、基础培养基+100ng/ml ccl-5；迁移时间为72小时。在设定的时间点，进行cck-8染色实验，测od450后对应标准曲线，算出细胞数目，再进一步算出迁移率，如图3所示。
[0113]
结果：1-7.5mg/ml的胶原蛋白的沉降率、存活率、迁移率和增殖率均能满足实验目的要求，即少沉降、》90％存活、有增殖和迁移情况，约5mg/ml浓度的胶原的存活率和迁移率效果最好。
[0114]
实施例4水凝胶(a剂-2和a剂-3)的制备
[0115]
(1)将甲基丙烯酰化明胶与甲基丙烯酰化透明质酸用溶媒(含0.1％(m/v)lap的基础培养基)分别稀释至如表3所示的浓度，即得a剂-2；将甲基丙烯酰化明胶与甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖用溶媒(含0.1％(m/v)lap的基础培养基分别稀释至如表4所示的浓度，即得a剂-3。
[0116]
(2)hucmsc在水凝胶中的沉降率和存活率与实施例3相同。
[0117]
表3 hucmsc在水凝胶a剂-2中的沉降实验、存活实验结果
[0118]
hamagelma沉降率存活率《0.1％《1％无法成胶100％存活0.1％～2.5％1％～30％无沉降》95％存活》2.5％》30％无法溶解—
[0119]
表4 hucmsc在水凝胶a剂-3中的沉降实验、存活实验结果
[0120]
cmcsmagelma沉降实验存活率《0.25％《1.5％无法成胶100％存活0.25％～5％1.5％～30％无沉降》95％存活》5％》30％浓度过高—
[0121]
(3)脐带来源间充质干细胞的外泌体在水凝胶中的保留及释放实验
[0122]
取实施例2中的外泌体与a剂-2和a剂-3混合制备成胞外囊泡浓度为0.5μg/μl的不同配方水凝胶(以hama为主体的水凝胶简称为hgel，h1：hama 0.1％～0.3％，gelma 1％～30％；h2：hama 0.3％～0.5％，gelma1％～30％；h3：hama 0.5％～1％，gelma 1％～30％；h4：hama 1％～2.5％，gelma 1％～30％。以cmcsma为主体的水凝胶简称为cgel，c1：cmcsma0.25％～0.5％，gelma 1％～30％；c2：cmcsma 0.5％～1％,gelma 1％～30％；c3：cmcsma 1％～2％,gelma 1％～30％；c4：cmcsma2％～5％,gelma 1％～30％。)置于transwell的上室，下室加基础培养基，按照day1、2、5、10取样，bca蛋白测定法检测下室释放胞外囊泡浓度。
[0123]
结果见图12，显示胞外囊泡能在水凝胶内保留2天以上。
[0124]
(4)脐带来源间充质干细胞外泌体的体外细胞炎症实验
[0125]
取大鼠巨噬细胞系raw264.7按1x105个/ml接种在六孔板内，待稳定贴壁后，按表5进行刺激和治疗，每组分别在第1、3、7天取细胞对tnf-α、il-6、il-4、il-10的mrna进行rt-qpcr处理和分析。
[0126]
结果见图13(图中所显示的所有数据均有显著性差异)，显示水凝胶与干细胞/胞外囊泡组合均能提高il4因子的表达，对细胞炎症有显著的抑制效果。
[0127]
表5
[0128][0129][0130]
注：hgel和cgel分别为实施例4(3)保留实验中的h4和c4配方。
[0131]
实施例5用于治疗瘘管干细胞悬液(b剂-1)胞外囊泡混悬液(b剂-2)的制备
[0132]
取实施例1中培养的hucmsc消化离心后，用溶媒(基础培养基)稀释，获得干细胞悬液，并分别重悬为高剂量(5
×
106个/ml)、中剂量(1
×
106个/ml)、和低剂量(0.2
×
106个/ml)
三组为实验组进行体内实验。
[0133]
取实施例2获得的胞外囊泡用溶媒稀释，获得胞外囊泡混悬液，并分别重悬为不同剂量进行体内实验。
[0134]
实施例6脐带组织来源间充质干细胞复合胶原蛋白制剂对肛瘘模型恢复的影响
[0135]
本实施例使用胶原蛋白溶液a剂-1与干细胞悬液b剂-1。
[0136]
本实施例实验流程分为三个阶段：
[0137]
(1)大鼠建模：参照meredith flacs,md,maxime collard,md,sabrina doblas,phd,magaly zappa,md,phd,dominique cazals-hatem,md,l
é
on maggiori,md,phd,yves panis,md,phd,xavier treton md,phd,eric ogier-denis,phd.preclinical model of perianal fistulizing crohn’s disease.original research article—basic science中记载的方法对大鼠进行tnbs灌肠(肠炎)+肛门穿孔(肛瘘)
[0138]
(2)治疗：共分为五组，其中对照组一组，即溶媒组(3例)；实验组四组，包括：干细胞高剂量组(5
×
106个/ml)(图中用“细胞h”或“细胞高”表示)3例、5mg/ml胶原蛋白+干细胞高剂量组(5
×
106个/ml)(图中用“胶+细胞h”表示)(4例)、5mg/ml胶原蛋白+干细胞中剂量组(1
×
106个/ml)(图中用“胶+细胞m”表示)(4例)和5mg/ml胶原蛋白+干细胞低剂量组(0.2
×
106个/ml)(图中用“胶+细胞l”表示)(3例)，参照tihomir georgiev hristov&h.guadalajara&m.d.herreros&a.l.lightner&e.j.dozois&m.garc
í
a-arranz&d.garc
í
a-olmo.astep-by-step surgical protocol for the treatment of perianal fistula with adipose-derived mesenchymal stem cells.journal of gastrointestinal surgery.中记载的方法对肛瘘进行治疗。
[0139]
(3)效果评估：
[0140]
a.外周血流式细胞术免疫检测：分别于治疗后第1、14、30天进行；
[0141]
b.mri影像学检测：分别于治疗前和治疗后第42天进行；
[0142]
c.组织学切片染色：治疗后第45天为终点进行。
[0143]
结果：
[0144]
1)实验组治疗后的外口愈合时间均短于对照组，且高浓度细胞组优于低浓度组，加胶组优于不加胶组，其中5mg/ml胶原蛋白+干细胞高剂量组(5
×
106个/ml)组与对照组有显著性差异，如图4所示。
[0145]
2)mri显示的瘘道愈合情况中，实验组愈合程度均优于对照组，且高浓度细胞组优于低浓度组，加胶组优于不加胶组，且均存在显著性差异，如图5和图6所示。
[0146]
(3)外周免疫情况中，实验组的免疫恢复情况优于对照组，且高浓度细胞组优于低浓度组，加胶组优于不加胶组，组间存在显著性差异，如图7和8所示。
[0147]
本领域技术人员公知，当水凝胶对体外细胞存活率和迁移率的影响已知时，可以合理预期水凝胶对干细胞在体内具有类似的影响趋势。
[0148]
实施例7脐带组织来源间充质干细胞复合水凝胶对体内肛瘘模型恢复的影响
[0149]
本实施例使用水凝胶a剂-2与干细胞悬液b剂-1。
[0150]
实验步骤参见实施例6。
[0151]
实施例8脐带组织来源间充质干细胞胞外囊泡复合水凝胶对体内肛瘘模型恢复的影响
[0152]
本实施例使用水凝胶a剂-2与胞外囊泡混悬液b剂-2。
[0153]
实验步骤参见实施例6。实施例7和8共分为6组，其中对照组一组，即溶媒组(4例)；实验组四组，包括：5mg/ml胶原蛋白+干细胞高剂量组(5
×
106个/ml)(图中用“col+hucmsc”表示)(4例)、水凝胶+干细胞高剂量组(5
×
106个/ml)(图中用“hgel+hucmsc”表示)4例、水凝胶+胞外囊泡高剂量(1
×
107个hucmsc细胞胞外囊泡提取量)(图中用“hgel+ev-h”表示)4例、水凝胶+胞外囊泡中剂量(5
×
106个hucmsc细胞胞外囊泡提取量)(图中用“hgel+ev-m”表示)4例和水凝胶+胞外囊泡低剂量(2
×
106个hucmsc细胞胞外囊泡提取量)(图中用“hgel+ev-l”表示)4例。
[0154]
瘘道愈合度见图14，结果显示水凝胶与干细胞/胞外囊泡的组合治疗效果优于对照(手术缝合)组。
[0155]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。