一种猪圆环病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法与流程

1.本发明属于疫苗领域，具体涉及一种猪圆环病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.猪圆环病毒2型(简称pcv2)是断奶仔猪多系统衰竭(pmws)的主要病原。pmws最早发于加拿大，并很快在欧美及亚洲一些国家(包括中国)发生和流行。除pmws外，猪皮炎肾病综合征(pdns)、猪呼吸道疾病综合征(prdc)、增生性坏死性肺炎(pnp)、猪繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与pcv2感染有重要关联，给养猪业造成严重的经济损失。感染pcv2的猪处于严重免疫抑制状态是pmws发生的重要原因，其致病性主要表现为免疫系统损伤，淋巴细胞减少，淋巴结肿大等病变。
3.猪气喘病，又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(简称mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。猪肺炎支原体常与其他病原混合感染，使其感染的严重性加强，是造成养猪业经济损失最重要的疾病之一。
4.副猪嗜血杆菌(简称hps)是猪上呼吸道的一种共栖菌。在转群、断奶后失去母源抗体保护、其他疾病导致免疫力下降时，hps感染表现出浆膜炎、脑膜炎等症状，主要在断奶后和保育期发病。
5.pmws和猪支原体肺炎均属于免疫抑制病，会导致猪群免疫力下降，给hps的致病创造条件，pcv2、mhp、hps这三种抗原常混合感染，造成猪只的发病及死亡，严重影响我国养猪事业的发展。但是，目前市售疫苗中仅有相关单苗或者二联疫苗，存在免疫频率过大，导致猪只应激的问题。另外，由于前期抗生素滥用，导致耐药菌株的出现，使药物治疗趋于无效。因此，开发猪圆环病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗具有重要意义。
6.申请号为cn201210221969.2的专利申请公开了一种疫苗组合物，包含灭活的猪圆环病毒2型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌(灭活的副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型)、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(carbomer)、gel 01(法国scippic)、蜂胶、isa206(法国scippic)、isa760vg(法国scippic)的一种或任意几种的组合。该疫苗组合物打一针即可预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病三种病的目的。但是，该疫苗组合物中的猪肺炎支原体抗原的免疫原性较低，免疫保护能力有待进一步提高。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法。
8.本发明提供了一种三联灭活疫苗，它包含猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗
原、副猪嗜血杆菌4型抗原、副猪嗜血杆菌5型抗原，其中，猪圆环病毒2型抗原的浓度为30-50ug/ml，猪肺炎支原体抗原的浓度为110-130ug/ml，副猪嗜血杆菌4型抗原的浓度为(4-6)
×
108cfu/ml，副猪嗜血杆菌5型抗原的浓度为(4-6)
×
108cfu/ml。
9.进一步地，所述猪圆环病毒2型抗原的浓度为40ug/ml，猪肺炎支原体抗原的浓度为120ug/ml，副猪嗜血杆菌4型抗原的浓度为5
×
108cfu/ml，副猪嗜血杆菌5型抗原的浓度为5
×
108cfu/ml。
10.进一步地，所述猪圆环病毒2型抗原为pcv2 cap蛋白。
11.进一步地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体菌体。
12.进一步地，所述灭活的猪肺炎支原体菌体的制备方法包括以下步骤：将猪肺炎支原体菌株种子接种至培养基培养48～72小时，收获菌液，浓缩，离心，收集沉淀，洗涤，超声破碎，加入灭活剂灭活，即得；优选地，所述超声破碎的功率为20～50w，时间为10～30分钟；所述灭活剂为二乙烯亚胺，灭活剂的终浓度为3mmol/l。
13.进一步地，所述副猪嗜血杆菌4型抗原为灭活的副猪嗜血杆菌4型菌体。
14.进一步地，所述副猪嗜血杆菌5型抗原为灭活的副猪嗜血杆菌5型菌体。
15.进一步地，所述三联灭活疫苗还包含佐剂，佐剂与4种抗原总量的质量比为1：(8-10)，优选为1：9。
16.进一步地，所述佐剂选自15a、isa201、gel02中的一种或两种以上的混合物，优选为gel02。
17.本发明还提供了上述三联灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：将猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌4型抗原、副猪嗜血杆菌5型抗原和佐剂混合均匀，即得。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.1.与市售猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗(重组杆状病毒cp08株+jm株)，猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗(sh株+4型js株+5型zj株)相比，本发明提供的猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(4型、5型)三联灭活疫苗免疫后产生的抗体没有降低。但是，于此同时，本发明提供的三联灭活疫苗可做到一针四防，减少免疫次数及应激，切实解决养猪业的难题。
20.2.与参考申请号为cn201210221969.2的专利申请记载的制备方法获得的对照三联灭活疫苗相比，本发明提供的三联灭活疫苗中的猪肺炎支原体抗原的免疫原性明显提高，免疫保护能力明显提高。
21.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
23.图1：三联灭活疫苗制备流程示意图。
24.图2：表达cap蛋白sds-page结果。
25.图3：表达cap蛋白电镜检测结果。
具体实施方式
26.以下实施例和实验例中所用的试剂和原料，未特别说明的均为市售品。
27.实施例1：制备猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(4型、5型)三联四价灭活疫苗
28.制备流程示意图如图1所示。
29.1.抗原制备
30.1.1pcv2抗原制备
31.根据genebank猪圆环2型病毒cap蛋白序列合成相应的密码子优化的基因序列(基因序列为(seq id no.1)：atgacgtatccaaggaggcgtttccgcagacgaagacaccgcccccgcagccatcttggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgttaccgctggagaaggaaaaatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccatcggttatactgtcaagaaaaccacagtcagaacgccctcctggaatgtggacatgatgagatttaatattaatgactttcttcccccaggagggggctcaaaccccctcactgtgccctttgaatactacagaataaggaaggttaaggttgaattctggccctgctccccaatcacccagggtgacaggggagtgggctccactgctgttattctagatgataactttgtaacaaaggccaatgccctaacctatgacccctatgtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccggtactttaccccaaaacctgtccttgatgggacaatcgattacttccaacccaataacaaaagaaatcaactctggctgagactacaaactactggaaatgtagaccatgtaggcctcggcactgcgttcgaaaacagtatatacgaccaggactacaatatccgtataaccatgtatgtacaattcagagaatttaatcttaaagaccccccacttaaccctaagtaa)，纯化后与pfastbacdual载体连接转化至top10感受态细胞中，将测序正确的表达供体质粒pfast2d-cap转化到dh10bac感受态细胞，蓝白斑筛选并鉴定阳性菌落，再将鉴定成功的重组杆粒转染入sf9细胞，获得重组杆状病毒bac-cap。将构建的猪圆环病毒2型cap蛋白杆状病毒表达载体按moi＝0.2接种highfive细胞，27℃培养9日，收获细胞培养物，经8000rpm离心15分钟收集上清，上清液经离子交换纯化收集洗脱液，用0.22um滤器过滤，得到pcv2 cap蛋白溶液。
32.表达的cap蛋白的氨基酸序列为(seq id no.2)：mtyprrrfrrrrhrprshlgqilrrrpwlvhprhryrwrrkngifntrlsrtigytvkkttvrtpswnvdmmrfnindflppgggsnpltvpfeyyrirkvkvefwpcspitqgdrgvgstavilddnfvtkanaltydpyvnyssrhtitqpfsyhsryftpkpvldgtidyfqpnnkrnqlwlrlqttgnvdhvglgtafensiydqdyniritmyvqfrefnlkdpplnpk。
33.表达的cap蛋白sds-page电泳结果见图2，表达蛋白大小为28kda左右。透射电镜分析，表达cap蛋白形成vlps结构(图3)。hplc检测纯化后蛋白纯度为88.9％，目的蛋白含量为212ug/ml。
34.1.2 mhp抗原制备
35.将猪肺炎支原体菌株(ah菌株)种子按10％(v/v)接种比例接种到含20％的血清和3mg/ml的葡萄糖的friis培养基内，37℃培养48～72小时，当培养基颜色变至黄色，ph值在6.8左右时收获菌液。将制备的ah菌株全菌体培养物经300kda中空纤维浓缩后，经10000转/分钟离心30分钟，收集沉淀用pbs反复洗涤3次。将浓缩纯化后的菌液经超声系统破碎(超声功率：20～50w，时间：10～30分钟)，并添加终浓度为3mmol/l的bei(中文全称：二乙烯亚胺)在37℃灭活24小时，灭活结束以终浓度为3mmol/l的硫代硫酸钠终止灭活，得到mhp溶液，于
2～8℃保存。
36.用bca总蛋白测定方法检测总蛋白含量为10.8mg/ml。
37.1.3 hps 4型抗原制备
38.将副猪嗜血杆菌4型菌株(hy菌株)种子按2％(v/v)接种于含10％新生牛血清、0.01％的nad的tsb培养基中，经37℃，180～200转/分钟、溶氧控制30％左右，发酵培养8～12小时，当od
600
值≥2.0时收获发酵培养物。收获菌液经10000转/分钟离心30分钟，收集菌体沉淀用pbs复溶，调整菌体浓度至(2.5～4)
×
109cfu/ml。向复溶后的菌液加入终浓度为0.4％甲醛溶液，经37℃120～150转/分钟灭活24～48小时，得到hps 4型溶液，备用。
39.1.4 hps 5型抗原制备
40.将副猪嗜血杆菌5型菌株(cx菌株)种子按2％(v/v)接种于含10％新生牛血清、0.01％的nad的tsb培养基中，经37℃，180～200转/分钟、溶氧控制30％左右，发酵培养8～12小时，当od
600
值≥2.0时收获发酵培养物。收获菌液经10000转/分钟离心30分钟，收集菌体沉淀用pbs复溶，调整菌体浓度至(2.5～4)
×
109cfu/ml。向复溶后的菌液加入终浓度为0.4％甲醛溶液，经37℃120～150转/分钟灭活24～48小时，得到hps 5型溶液，备用。
41.2.三联灭活疫苗的配制方法
42.取上述pcv2 cap蛋白溶液、mhp溶液、hps 4型溶液和hps 5型溶液，与gel02佐剂混合均匀，控制gel02佐剂与4种抗原的质量比为1：9，配制得到终浓度含40ug/ml pcv2 cap蛋白、120ug/ml mhp菌体、5
×
108cfu/ml灭活的hps 4型菌体和5
×
108cfu/ml灭活的hps 5型菌体的三联四价灭活疫苗。
43.为了证明本发明的有益效果，提供以下实验例。
44.实验例1：mhp抗原的免疫原性测试
45.1.疫苗制备
46.比较本发明实施例1制备三联灭活疫苗的方法与cn201210221969.2制备三联灭活疫苗的方法可以看出，两者的主要区别在于在制备mhp溶液时的方法不同，例如cn201210221969.2未进行超声纯化处理。
47.因此，本实验制备了未超声纯化处理的mhp溶液：将猪肺炎支原体菌株(ah菌株)种子按10％(v/v)接种比例接种到含20％的血清和3mg/ml的葡萄糖的friis培养基内，37℃培养48～72小时，当培养基颜色变至黄色，ph值在6.8左右时收获菌液。将制备的ah菌株全菌体培养物经300kda中空纤维浓缩后，经10000转/分钟离心30分钟，收集沉淀用pbs反复洗涤3次。将浓缩纯化后的菌液中添加终浓度为0.3％(v/v)的甲醛，在37℃灭活24小时，灭活结束后得到mhp溶液，于2～8℃保存。
48.然后取pcv2 cap蛋白溶液、未超声纯化处理的mhp溶液、hps 4型溶液和hps 5型溶液，与gel01佐剂混合均匀，控制gel01佐剂与4种抗原的质量比为1：9，配置得到终浓度含20ug/ml pcv2 cap蛋白、1
×
108ccu/头份mhp、1
×
109cfu/头份hps 4型和1
×
109cfu/头份hps 5型的三联四价灭活疫苗，作为对照三联灭活疫苗。
49.2.评估免疫后mhp抗体水平
50.取本发明实施例1制备的三联灭活疫苗与上述对照三联灭活疫苗分别免疫3头仔猪，每头2.0ml。首次免疫后21日按相同剂量加强免疫一次，分别于一免后21日和二免后21日所有试验猪采血进行mhp抗体检测，检测结果见表1。
51.结果显示，利用本发明实施例1配制的三联灭活疫苗免疫后产生的mhp抗体水平显著高于对照三联灭活疫苗。
52.表1 mhp攻毒保护结果
[0053][0054]
3.攻毒后mhp肺脏病变指数减少率
[0055]
取本发明实施例1制备的三联灭活疫苗与上述对照三联灭活疫苗分别经颈部肌肉注射3～4周龄pcv2、mhp、hps 4型、hps 5型抗原抗体阴性仔猪5头，2.0ml/头。疫苗首次免疫后21日按相同剂量相同途径加强免疫一次。设立不免疫对照组5头。二免后21日，各气管内注射猪肺炎支原体检验用强毒jx株组织毒5.0ml。攻毒后连续观察28日，剖检所有试验猪，分别观察肺组织左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶的背面和腹面发生胰样肉变的实变的平均肺面积占该肺叶面积的百分比。按猪支原体肺炎肺脏病变指数28分记分标准判定，与攻毒对照组相比，免疫组肺脏病变指数减少率不低于60％，判为免疫攻毒保护。mhp攻毒后免疫保护结果见表2。
[0056]
表2 mhp攻毒保护结果
[0057][0058][0059]
结果显示，利用本发明实施例1配制的三联灭活疫苗免疫攻毒后肺脏病变指数减少率远高于对照三联灭活疫苗。
[0060]
实验例2：三联灭活疫苗制备的筛选实验
[0061]
1.佐剂筛选
[0062]
参照实施例1的方法，分别采用15a、isa201、gel02佐剂进行猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(4型、5型)三联灭活疫苗配制，使每种佐剂制备疫苗含相同量抗原。具体配制信息如下表3。筛选12头21日龄左右pcv2、mhp、hps 4型、hps 5型抗原抗体阴性仔猪，随机分成4组，每组3头。每种佐剂疫苗分别免疫3头仔猪，每头2.0ml。首次免疫后21日按相同剂量加强免疫一次，分别于一免后21日和二免后21日所有试验猪采血进行pcv2抗体、mhp抗体、hps 4型和hps 5型抗体检测。检测结果见表4。
[0063]
对比抗体检测结果及疫苗剂型，显示gel02佐剂制备疫苗在抗体产生期和二免后抗体水平较高且该疫苗通针性极好。
[0064]
表3疫苗配制及免疫信息
[0065][0066]
表4疫苗免疫后抗体检测结果
[0067][0068]
2.抗原配比及相容性研究
[0069]
按照实施例1的方法，使用gel02佐剂制备猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌(4型、5型)三联灭活疫苗，同时制备相同抗原含量的单苗。具体配制信息如下表5。筛选15头21日龄左右pcv2、mhp、hps 4型、hps 5型抗原抗体阴性仔猪，随机分成5组，每组3头。每种疫苗分别免疫3头仔猪，每头2.0ml。首次免疫后21日按相同剂量加强免疫一次，分别于一免后21日和二免后21日所有试验猪采血进行pcv2抗体、mhp抗体、hps 4型和hps 5型抗体检测。检测结果见表6。
[0070]
结果显示，制备的多联灭活疫苗各抗原产生的抗体均不低于对应单苗，说明各抗原相容性好。
[0071]
表5疫苗配制及免疫信息
[0072]
[0073][0074]
表6疫苗免疫后抗体检测结果
[0075][0076]
实验例3：疫苗安全性检验
[0077]
按照实施例1的方法，用gel02佐剂制备终浓度含40ug/ml pcv2 cap蛋白、120ug/ml mhp、5
×
108cfu/ml hps 4型和5
×
108cfu/ml hps 5型的三联四价灭活疫苗，经腹腔注射balb/c小鼠10只，每只0.5ml，另设10只为不免疫对照组，连续观察10日。安检检验结果见表7。
[0078]
结果显示：制备疫苗免疫小鼠注射部位疫苗吸收良好，免疫组精神、采食无异常，体重增长与对照组基本一致。
[0079]
表7安全检验
[0080]
[0081][0082]
实验例4：疫苗效力检验
[0083]
按照实施例1的方法，用gel02佐剂制备终浓度含40ug/ml pcv2 cap蛋白、120ug/ml mhp、5
×
108cfu/ml hps 4型和5
×
108cfu/ml hps 5型的三联四价灭活疫苗，经颈部肌肉注射3～4周龄pcv2、mhp、hps 4型、hps 5型抗原抗体阴性仔猪20头，2.0ml/头。疫苗首次免疫后21日按相同剂量相同途径加强免疫一次。设立不免疫对照组20头。二免后21日进行攻毒保护效力检验。
[0084]
1.pcv2部分
[0085]
二免后21日，免疫组和对照组随机挑选5头，用pcv2检验用强毒zj/c株攻毒，每头滴鼻1.0ml、颈部肌肉注射2.0ml。攻毒后14日，扑杀，取肺脏和腹股沟淋巴结进行病毒分离和免疫组化。任一组织pcv2免疫组化阳性或病毒分离阳性，判为发病。肺脏和腹股沟淋巴结免疫组化和病毒分离均为阴性，判为保护。pcv2攻毒保护结果见表8。攻毒对照组5/5发病，免疫组4/5保护。
[0086]
表8 pcv2攻毒保护结果
[0087][0088]
2.mhp部分
[0089]
二免后21日，免疫组和对照组随机挑选5头，各气管内注射猪肺炎支原体检验用强毒jx株组织毒5.0ml。攻毒后连续观察28日，剖检所有试验猪，分别观察肺组织左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶的背面和腹面发生胰样肉变的实变的平均肺面积占该肺叶面积的百分比。按猪支原体肺炎肺脏病变指数28分记分标准判定，与攻毒对照组相比，免疫组肺脏病变指数减少率不低于60％，判为免疫攻毒保护。mhp攻毒后免疫保护结果见表9。免疫组肺脏病变减少69.2％，保护。
[0090]
表9 mhp攻毒保护结果
[0091][0092]
3.hps 4型部分
[0093]
二免后21日，免疫组和对照组随机挑选5头，各腹腔注射副猪嗜血杆菌4型hy株3.0ml(含6.0
×
109cfu)。攻毒后连续观察14日出现以下任一项即可判为发病：
①
死亡；
②
体温升高至40.5℃及以上，并至少持续2日；
③
出现精神沉郁、喜卧、食欲减退、呼吸困难、跛行等临床症状；
④
剖检可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎等)、关节炎、肺脏表面或腹腔内有纤维素性渗出物。反之则判为保护。hps 4型攻毒后免疫保护结果见表10。攻毒对照组5/5发病，免疫组5/5保护。
[0094]
表10 hps 4型攻毒保护结果
[0095][0096][0097]
4.hps 5型部分
[0098]
二免后21日，免疫组和对照组随机挑选5头，各腹腔注射副猪嗜血杆菌5型cx株
3.0ml(含6.0
×
109cfu)。攻毒后连续观察14日出现以下任一项即可判为发病：
①
死亡；
②
体温升高至40.5℃及以上，并至少持续2日；
③
出现精神沉郁、喜卧、食欲减退、呼吸困难、跛行等临床症状；
④
剖检可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎等)、关节炎、肺脏表面或腹腔内有纤维素性渗出物。反之则判为保护。hps 5型攻毒后免疫保护结果见表11。攻毒对照组5/5发病，免疫组4/5保护。
[0099]
表11 hps 5型攻毒保护结果
[0100][0101]
实验例5：与市售疫苗效力对比
[0102]
按照实施例1的方法，用gel02佐剂制备终浓度含40ug/ml pcv2 cap蛋白、120ug/ml mhp、5
×
108cfu/ml hps 4型和5
×
108cfu/ml hps 5型的三联四价灭活疫苗。
[0103]
对比市售疫苗：猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗(重组杆状病毒cp08株+jm株)购自国药集团动物保健股份有限公司；猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗(sh株+4型js株+5型zj株)购自普莱柯生物工程股份有限公司。
[0104]
筛选15头21日龄左右pcv2、mhp、hps 4型、hps 5型抗原抗体阴性仔猪，随机分成3组，每组5头。每种疫苗分别免疫5头仔猪，每头2.0ml。首次免疫后21日按相同剂量加强免疫一次，分别于一免后21日和二免后21日所有试验猪采血进行pcv2抗体、mhp抗体、hps 4型和hps 5型抗体检测。检测结果见表12。制备三联灭活疫苗免疫后产生的抗体均不低于现市售多联灭活疫苗。
[0105]
表12疫苗免后抗体检测结果
[0106][0107]
综上，本发明提供了一种猪圆环病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及其制备方法，该三联灭活疫苗可做到一针四防，减少免疫次数及应激，切实解决了养猪业的难题。