一种用于改善脱发的外泌体复合制剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于改善脱发的外泌体复合制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.毛发脱落最关键的器官是毛囊，脱发的直接原因在于毛囊的退化，处于休止期，毛囊萎缩，毛囊细胞逐渐凋亡，导致头发脱落。因此，恢复毛囊活性，刺激毛囊再生尤为关键。目前治理脱发中医治疗如中医中的针灸治疗，但是中医治理较慢，过程麻烦，导致副作用累积。西医可以快速治疗，但是西医很多方面受到限制，如药物依赖性强，停药容易导致脱发复发。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于改善脱发的外泌体复合制剂及其制备方法与应用，本发明提供的外泌体复合制剂能够提高毛囊活性，刺激毛囊再生，增强毛囊细胞的分化能力，使毛囊进入生长期，从而能够显著改善脱发问题。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种用于改善脱发的外泌体复合制剂的制备方法，包括如下步骤：
7.3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液的制备：将原代脐带间充质干细胞进行传代培养，将传代培养后的脐带间充质干细胞进行3d细胞培养，获得3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液；
8.毛囊干细胞裂解物溶液的制备：取人体枕部毛发制备原代毛囊干细胞，将原代毛囊干细胞进行传代培养，然后进行细胞裂解，获得毛囊干细胞裂解物溶液；
9.将3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液、毛囊干细胞裂解物溶液、生姜发酵液和迷迭香发酵液按照质量比10～20:10～15:1～3:2～4混合均匀。
10.另一方面，一种用于改善脱发的外泌体复合制剂，由上述制备方法获得。
11.第三方面，一种上述用于改善脱发的外泌体复合制剂在制备防脱发的产品中的应用。
12.本发明的有益效果是：
13.本发明外泌体复合制剂中采用本发明制备的3d培养脐带间充质干细胞外泌体和毛囊干细胞裂解物及胶原蛋白，既能够为生长期毛囊细胞提供营养物质，又能够促进毛囊干细胞的分化，提高毛囊活跃度，刺激退行期及休止期的毛囊向生长期转化，再添加刺激头皮血管，增强局部血液循环的生姜发酵液，富含大量的抗氧化剂，对抗自由基的迷迭香发酵液以及氨基酸与多种维生素，从而促进头皮毛囊周围血管的循环和形成，进而达到更好的
生发固发效果。
附图说明
14.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
15.图1为本发明实施例实施例4组小鼠相对于空白对照和对比例1～3组小鼠的毛囊形态图，a为空白组，b为实施例4组，c为对比例1组，d为对比例2组，e为对比例3组。
具体实施方式
16.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
17.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
18.鉴于现有药物难以改善脱发问题，本发明提出了一种用于改善脱发的外泌体复合制剂及其制备方法与应用。
19.本发明的一种典型实施方式，提供了一种用于改善脱发的外泌体复合制剂的制备方法，包括如下步骤：
20.3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液的制备：将原代脐带间充质干细胞进行传代培养，将传代培养后的脐带间充质干细胞进行3d细胞培养，获得3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液；
21.毛囊干细胞裂解物溶液的制备：取人体枕部毛发制备原代毛囊干细胞，将原代毛囊干细胞进行传代培养，然后进行细胞裂解，获得毛囊干细胞裂解物溶液；
22.将3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液、毛囊干细胞裂解物溶液、生姜发酵液和迷迭香发酵液按照质量比10～20:10～15:1～3:2～4混合均匀。
23.在一些实施例中，采用无血清培养基对原代脐带间充质干细胞重悬并进行培养，然后消化细胞并进行传代培养。当细胞融合度达到80～90％时，消化细胞并进行传代培养。无血清培养基优选为αmem或dmem/f12，包含氨基酸、维生素、葡萄糖、核苷、无机盐等。
24.在一些实施例中，收集第3代及以上脐带间充质干细胞，加入微载片进行3d细胞培养。所述加入微载体的数量按45～50万细胞/片进行投放。
25.在一些实施例中，3d细胞培养过程中，培养当天进行间隔启动模式进行培养，第二天开始改用恒速模式进行培养。间隔启动模式中，先在30～40rpm的转速条件下培养4～6min，然后在0rpm的转速条件下培养55～65min，进行若干次循环。恒速模式进行培养中，转速为35～45rpm。
26.在一些实施例中，将3d细胞培养的上清液进行离心处理，将离心处理获得的清液进行超速离心法提取3d培养脐带间充质干细胞外泌体。
27.在一些实施例中，采用dpbs重悬3d培养脐带间充质干细胞外泌体沉淀获得3d培养
脐带间充质干细胞外泌体溶液。3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液的浓度优选为8～18mg/ml。
28.3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液的制备，优选过程如下：
29.(a)获取健康供者新鲜脐带，剥离华通氏胶，切成大小均一的组织块，加培养基，得到原代脐带间充质干细胞；
30.(b)采用无血清培养基对原代脐带间充质干细胞重悬并进行培养，待细胞融合度达到80％-90％后，消化细胞进行传代培养；
31.(c)收集第3代脐带间充质干细胞悬液计数，加入微载片，进行3d动态培养，当天计为day0；
32.(d)3d动态培养day0选用间隔启动模式，day1改用恒速模式；
33.(e)收集day4的3d培养上清液，离心去除3d微载体和细胞碎片，获得的上清液采用超速离心法提取脐带间充质干细胞外泌体；
34.(f)采用dpbs重悬3d培养脐带间充质干细胞外泌体沉淀，获得所述3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液。
35.在一些实施例中，将人体枕部毛发的毛囊组织进行消化、离心，获得原代毛囊干细胞。
36.在一些实施例中，采用无血清培养基对原代毛囊干细胞进行培养，然后消化细胞并进行传代培养。当细胞融合度达80～90％时，消化细胞进行传代培养。
37.在一些实施例中，收集第3代及以上毛囊干细胞，通过冻融使细胞裂解。较为具体地，将收集的毛囊干细胞离心，去除清液后，加入pbs，进行反复冻融。冷冻温度为-25～-18℃，融化温度为40～45℃。细胞裂解后添加pbs调节浓度，毛囊干细胞裂解物溶液的浓度优选为5～15mg/ml。
38.毛囊干细胞裂解物溶液的制备，优选过程如下：
39.(a)获取人体枕部毛发，将毛囊组织进行消化、离心，得到原代毛囊干细胞；
40.(b)采用无血清培养基对原代毛囊干细胞进行培养，待细胞融合度达80～90％后，消化细胞进行传代培养；
41.(c)收集第3代毛囊干细胞，离心，弃掉上清，加入2～4ml pbs，-20℃和42℃反复冻融，使细胞裂解，得到所述毛囊干细胞裂解物溶液。
42.在一些实施例中，生姜发酵液的制备过程为：将粉碎后的生姜灭菌后，接种混合菌液进行发酵，发酵后进行过滤除菌即得。较为具体地，将粉碎后的生姜置于发酵罐中，蒸汽加热至沸腾后加灭菌蒸馏水定容，接种混合菌液进行发酵。发酵温度优选为36～38℃，发酵时间优选为48～50h。所述无菌蒸馏水定容体积为发酵罐装液量的60～70％，所述发酵混合菌液的体积不低于定容后混合液的2％。过滤除菌的微孔滤膜为0.22μm。所述混合菌为由地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、乳酪杆菌组成。地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、乳酪杆菌的质量比为1～4:0.5～2:0.5～2，优选为2:1:1。
43.在一些实施例中，迷迭香发酵液的制备过程为：将粉碎后的迷迭香灭菌后，接种混合菌液进行发酵，发酵后进行过滤除菌即得。较为具体地，将粉碎后的迷迭香置于发酵罐中，蒸汽加热至沸腾后加灭菌蒸馏水定容，接种混合菌液进行发酵。发酵温度优选为36～38℃，发酵时间优选为48～50h。所述无菌蒸馏水定容体积为发酵罐装液量的60～70％，所述
发酵混合菌液的体积不低于定容后混合液的2％。过滤除菌的微孔滤膜为0.22μm。
44.在一些实施例中，将3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液、毛囊干细胞裂解物溶液、生姜发酵液和迷迭香发酵液按照质量比10～20:10～15:1～3:2～4:58～77混合均匀。
45.在一些实施例中，将生姜发酵液和迷迭香发酵液加入至生理盐水中混合均匀获得混合溶液，将3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液、毛囊干细胞裂解物溶液与混合溶液混合均匀获得外泌体复合制剂。
46.本发明的另一种实施方式，提供了一种用于改善脱发的外泌体复合制剂，由上述制备方法获得。
47.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述用于改善脱发的外泌体复合制剂在制备防脱发的产品中的应用。
48.本发明的产品可以为药物，也可以为洗漱用品(如洗发水)。
49.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
50.实施例1
51.一种3d培养脐带间充质干细胞外泌体溶液制备方法，包括以下步骤：
52.(1)获取健康供者新鲜脐带(脐带组织取自当地三甲医院妇产科，产妇及其家属已签署知情同意书，并同意捐赠)，剥离华通氏胶，切成大小均一的组织块，均匀铺在培养皿中，加完全培养基(基础培养液dmem/f12，添加5％elitegro
tm-advanced-gmp grade货号：epagmp-500，elitecell)，得到原代脐带间充质干细胞。
53.(2)用无血清培养基(dmem/f12培养基)重悬原代脐带间充质干细胞，将细胞在5％ co2，37℃培养箱中静置培养，当细胞融合度达到85％时，吸弃原培养液，加入重组细胞消化液tryple
tm express室温消化，进行传代培养。
54.(3)收集第3代脐带间充质干细胞悬液计数，加入完全培养基和微载片(50万细胞/片)，进行3d动态培养(3d动态培养系统购于华龛生物)，当天计为day0。
55.(4)3d动态培养day0选用间隔启动模式，35rpm 5min，0rpm 1h，进行24次循环；day1改用恒速模式,40rpm。
56.(5)收集day4的3d培养上清液，以3000g
×
g离心30min去除3d微载体和细胞碎片，然后以10000
×
g离心45min去除较大的囊泡，再以100000
×
g离心70min获得上脐带间充质干细胞外泌体沉淀。
57.(6)采用dpbs重悬3d培养脐带间充质干细胞外泌体沉淀，得到10mg/ml的脐带间充质干细胞外泌体溶液。
58.实施例2
59.一种毛囊干细胞裂解物溶液的制备方法，包括如下步骤：
60.(1)获取人体枕部毛发(约100单位)，剪取毛发根部，获得毛囊组织，采用胶原酶对毛囊组织进行消化、离心，得到原代毛囊干细胞。
61.(2)采用无血清培养基(dmem/f12培养基)对原代毛囊干细胞进行培养，待细胞融合度达85％后，消化细胞进行传代培养。
62.(3)收集第3代毛囊干细胞，离心，弃掉上清，加入3ml pbs，-20℃和42℃反复冻融，
使细胞裂解，得到毛囊干细胞裂解物溶液。
63.(4)在pbs中加入毛囊干细胞裂解物溶液，使其均匀分布，得到10mg/ml的毛囊干细胞裂解物溶液。
64.实施例3
65.一种生姜和迷迭香发酵物溶液的制备方法，包括如下步骤：
66.(1)将生姜和迷迭香分别进行粉碎处理，得到粉碎物料。
67.(2)将粉碎物料分别置于发酵罐中，蒸汽加热至沸腾后加灭菌蒸馏水定容至发酵罐装液量的65％，接种2％的混合菌液(地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、乳酪杆菌的质量比为2:1:1)，37℃、发酵48h。
68.(3)发酵结束后，用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，分别得到所述生姜发酵物溶液和迷迭香发酵物溶液。
69.实施例4
70.一种外泌体复合制剂的制备方法，步骤如下：
71.(1)将3质量份实施例3的生姜发酵液与2质量份实施例3的迷迭香发酵液，加入至66质量份的生理盐水中，搅拌均匀，得到混合液。
72.(2)将20质量份实施例1的3d脐带间充质干细胞外泌体溶液和10质量份实施例2的毛囊干细胞裂解物溶液加入至步骤(1)的混合液中，搅拌均匀，获得外泌体复合制剂。
73.对比例1
74.一种外泌体复合制剂的制备方法，步骤如下：
75.将20质量份实施例1的3d脐带间充质干细胞外泌体溶液和加入至80质量份的生理盐中，搅拌均匀，获得外泌体复合制剂。
76.对比例2
77.一种外泌体复合制剂的制备方法，步骤如下：
78.(1)将3质量份实施例3的生姜发酵液与2质量份实施例3的迷迭香发酵液，加入至86质量份的生理盐水中，搅拌均匀，得到混合液。
79.(2)将10质量份实施例2的毛囊干细胞裂解物溶液加入至步骤(1)的混合液中，搅拌均匀，获得外泌体复合制剂。
80.对比例3
81.一种外泌体复合制剂的制备方法，步骤如下：
82.(1)将3质量份实施例3的生姜发酵液与2质量份实施例3的迷迭香发酵液，加入至76质量份的生理盐水中，搅拌均匀，得到混合液。
83.(2)将20质量份实施例1的3d脐带间充质干细胞外泌体溶液加入至步骤(1)的混合液中，搅拌均匀，获得外泌体复合制剂。
84.实验例1
85.本实验例为实施例4和对比例1～3的外泌体复合制剂对脱发影响的研究：
86.1.建立小鼠脱毛实验动物模型
87.45只清洁级近交系昆明小鼠，雌雄各半；用石蜡/松香的混合物(1:1)热融化后，涂于小鼠背部，待凝固且变硬之后揭去致昆明小鼠脱发动物模型；用清洁医用棉签蘸取咪喹莫特乳膏均匀涂抹在小鼠背部脱毛皮肤上，涂于小鼠背部2cm
×
2cm区域，每次涂抹量约
0.3g；每隔一天涂抹一次，持续两周后，小鼠背部给药部位没有形成新的毛发，即建模成功。
88.2.动物分组
89.选取建模成功的小鼠40只，随机平均分为5组，每组雌雄各半。
90.3.给药方式
91.选取4组小鼠分别给药实施例4和对比例1～3的外泌体复合制剂，第5组小鼠作为空白对照涂抹等体积生理盐水；给药方式为在形成的脱毛区涂抹外泌体复合制剂，每次涂抹量为0.5ml，每隔一天涂抹一次；持续给药四周。
92.4.结果
93.(1)对毛发生长长度的影响：
94.给药结束后，各组分别取5只小鼠，在给药区域内，随机拔取5根毛发并测量长度，计算每组小鼠毛发的平均长度，结果如表1所示。
95.表1各组小鼠毛发的平均长度
96.组别毛发长度(mm)空白对照3.5实施例410.7对比例14.9对比例25.4对比例36.8
97.由表1可知：实施例4组小鼠相对于空白对照和对比例1～3组小鼠的毛发长度增长明显(p《0.05)。
98.(2)毛囊形态学观察
99.给药结束后，各组分别取5只小鼠，脱臼处死；剪取给药区域0.5cm
×
0.5cm皮肤标本，进行he染色。显微镜下观察毛囊形态，结果如图1所示。
100.由图1可知：实施例4组小鼠皮肤毛囊形态良好，毛乳头较大，黑色素明显，毛囊活跃度高；对照组毛囊密度较低，黑色素减少，多为退行期细胞。
101.(3)毛囊密度观察
102.给药结束后，各组分别取5只小鼠，脱臼处死；剪取给药区域0.5cm
×
0.5cm皮肤标本，光学显微镜下(
×
100)观察视野中毛囊数量并计算每组小鼠毛囊平均数，结果如表2所示。
103.表2各组小鼠单位视野下的平均毛囊数量
104.组别毛囊数量(个)空白对照36实施例475对比例156对比例261对比例354
105.由表2可知：与对比例1～3相比较，实施例4组小鼠毛囊细胞数目显著增加(p《0.05)。
106.综上所述：本发明外泌体复合制剂可显著促进脱发模型小鼠毛发的生长，通过实
施例4与对比例1～3相比，本发明外泌体复合制剂通过3d脐带间充质干细胞外泌体联合毛囊干细胞裂解物、生姜发酵物和迷迭香发酵物能够提高毛囊活跃度，刺激退行期及休止期的毛囊向生长期转化，从而促进毛发生长，改善脱发。
107.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。