Toll样受体3在治疗华支睾吸虫性肝纤维化的用途

toll样受体3在治疗华支睾吸虫性肝纤维化的用途
技术领域
1.本发明涉及先天免疫受体toll样受体3（以下简称tlr3）新的医药用途，尤其是公开了toll样受体3在治疗华支睾吸虫性肝纤维化的用途，具体涉及toll样受体3及其激动剂在在治疗华支睾吸虫引起的肝纤维化中的应用，属于生物医学制药技术领域。


背景技术：

2.华支睾吸虫病是由华支睾吸虫（clonorchis sinensis）寄生在人及动物的肝脏胆管引起的一种重要的食源性人兽共患寄生虫病，与肝纤维化、肝硬化和胆管癌密切相关。目前尚无有效防控华支睾吸虫病的商业疫苗，且尚无治疗或逆转华支睾吸虫导致肝纤维化的针对性药物。因此深入认识华支睾吸虫致肝纤维化的致病机理，并基于此开发缓解华支睾吸虫性肝纤维化的药物对华支睾吸虫病的防治至关重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供toll样受体3在治疗华支睾吸虫性肝纤维化的用途，基于tlr3介导的宿主先天免疫在抗华支睾吸虫感染的治疗新用途，并应用tlr3激动剂poly（i:c）对tlr3治疗华支睾吸虫性肝纤维化的作用进行验证。
4.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：建立华支睾吸虫感染致肝纤维化的小鼠模型，检测小鼠存活率、体重及肝内寄生虫数量，于感染的7天、15天及35天收集小鼠肝脏，检测感染小鼠肝脏病变、胆管损伤及肝纤维化变化等指标，探究tlr3治疗华支睾吸虫性肝纤维化的新作用。基于tlr3在华支睾吸虫致病中的作用，并使用tlr3的激动剂poly（i:c）处理华支睾吸虫感染wt小鼠，检测上述指标，验证探讨tlr3治疗华支睾吸虫性肝纤维化的作用。
5.本发明所述的基于tlr3调节的免疫反应对华支睾吸虫致肝纤维化的治疗作用，步骤如下：1. 华支睾吸虫致肝纤维化小鼠模型的建立将野生型（wt）c57bl/6小鼠每组10只，分成6组，分别给予0个、50个、100个、200个、400个、800个囊蚴/只。攻虫当日及攻虫后每天称量并记录小鼠的体重及死亡率，并在攻虫后的7 d、15 d和35 d分别安乐死小鼠，取肝脏进行肝内荷虫量的统计，以确定建立华支睾吸虫致小鼠肝纤维化的囊蚴感染数量。结果发现，以200个囊蚴/鼠对c57bl/6小鼠感染华支睾吸虫后，小鼠肝内成虫回收率平均为13%-15%，感染率为100%，小鼠死亡率平均为40%。感染35天后出现明显的肝纤维化症状，可以作为后续试验中华支睾吸虫致肝纤维化小鼠模型建立的感染量。
6.2. tlr3缺失小鼠感染华支睾吸虫肝脏纤维化情况检测建立华支睾吸虫致肝纤维化wt及tlr3缺失（tlr3-/-）小鼠模型，pbs处理的小鼠作为阴性对照。在感染后每天称量并记录小鼠的体重及死亡率，并在攻虫后7d、15d、35 d分别安乐死小鼠，分离肝脏并进行肝内荷虫量的统计。通过elisa、western blot、病理切片、免
疫组化及masson染色法观察华支睾吸虫感染的wt和tlr3-/-小鼠的肝脏病变及肝纤维化情况，探究tlr3作为治疗华支睾吸虫性肝纤维的治疗靶标的可能性。通过华支睾吸虫外分泌产物刺激分离的小鼠胆管上皮细胞，探究tlr3治疗华支睾吸虫性肝纤维化的机制。结果发现，tlr3通过调节erk/p38蛋白磷酸化，抑制il-6表达，降低炎症反应。与wt感染小鼠相比，华支睾吸虫感染的tlr3-/-小鼠体重大幅降低，死亡率由平均40%升高到50%，肝内寄生虫回收率由最高15%升高到20%。tlr3-/-小鼠感染华支睾吸虫后，肝组织损伤严重，肝内炎症增加。胆管周围肌成纤维细胞活化持续性增加，胶原沉积更为明显；在感染35 d时，汇管区完全被沉积的胶原包裹，而且胶原已经延伸到肝脏实质，形成大面积的肝纤维化。tlr3可以作为华支睾吸虫性肝纤维化治疗的靶向蛋白。
7.3. tlr3激动剂处理对华支睾吸虫感染wt小鼠肝脏纤维化治疗情况检测建立华支睾吸虫致小鼠肝纤维化模型，在感染囊蚴前8 h对小鼠按照100
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g/只的剂量经腹腔注射tlr3激动剂poly（i:c）溶液，并于华支睾吸虫感染小鼠后的第10 d及第20 d分别再次给予同等剂量的poly（i:c）经腹腔注射处理。统计小鼠的死亡率，体重变化及肝内荷虫量。并通过elisa、病理切片、免疫组化及masson染色法观察华支睾吸虫感染小鼠的肝脏病变、炎症反应、肌成纤维细胞活化及肝纤维化情况。结果显示，与未处理组小鼠相比，tlr3激动剂处理小鼠肝脏中tlr3表达量显著升高，并阻断华支睾吸虫感染引起小鼠死亡、减少肝脏荷虫量、大幅提升感染小鼠体重，并减轻了华支睾吸虫感染所致的肝脏病变、炎症及胆管病变；减少华支睾吸虫引起的肝脏肌成纤维细胞的活化数量，缓解肝脏纤维化。这些结果表明tlr3激动剂治疗刺激tlr3高表达，帮助机体降低由华支睾吸虫感染诱导的肝脏炎症反应及损伤，大幅缓解华支睾吸虫性肝纤维化，提高小鼠的生存率。
8.本发明的积极效果在于：公开了toll样受体3在治疗华支睾吸虫性肝纤维化的用途，并通过使用tlr3激动剂缓解华支睾吸虫性肝纤维化。实验证明，tlr3高表达调控宿主erk/p38信号通路磷酸化，抑制il-6的分泌，从而降低华支睾吸虫感染导致的肝脏炎症损伤，降低肝纤维化；ttlr3激动剂处理进一步证实tlr3高表达阻断华支睾吸虫感染引起小鼠死亡、减少肝脏荷虫量，减轻了华支睾吸虫感染所致的肝脏病变、炎症及胆管病变；减少华支睾吸虫引起的肝脏肌成纤维细胞的活化数量，缓解肝脏纤维化。tlr3作为未来开发治疗和预防华支睾吸虫性肝纤维化的新药物和疫苗靶点，均有较好的应用前景。
附图说明
9.图1为本发明中建立小鼠肝纤维化模型中小鼠感染囊蚴数量筛选结果；图2为本发明中华支睾吸虫感染致肝纤维化小鼠模型肝脏胶原蛋白沉积情况；图3为本发明中wt小鼠及tlr3缺失小鼠感染华支睾吸虫后小鼠体重、死亡率、肝内tlr3表达及荷虫量变化情况；图4为本发明中wt小鼠及tlr3缺失小鼠感染华支睾吸虫后小鼠肝脏病变及炎症损伤情况；图5为本发明中wt小鼠及tlr3缺失小鼠感染华支睾吸虫后小鼠肝脏肌成纤维细胞活化及胶原沉积情况；图6为本发明中tlr3激活调控宿主免疫反应的机制；
图7本发明tlr3激动剂处理对华支睾吸虫感染小鼠体重、死亡率、肝内荷虫量的改善情况；图8为本发明tlr3激动剂处理对华支睾吸虫感染小鼠肝脏病变及炎症反应的改善情况；图9为本发明tlr3激动剂处理对华支睾吸虫感染小鼠肝脏中肌成纤维细胞活化及胶原沉积的改善情况。
具体实施方式
10.通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
11.实施例1华支睾吸虫致肝纤维化小鼠模型的建立及tlr3调节华支睾吸虫致肝纤维化的机制1. 囊蚴感染数量的筛选将野生型（wt）c57bl/6小鼠每组10只，分成8组，分别给予0个、50个、100个、200个、400个、800个囊蚴/只。攻虫当日及攻虫后每天称量并记录小鼠的体重及死亡率，并在攻虫后的7 d、15 d和35 d分别安乐死小鼠，取肝脏进行肝内荷虫量的统计（结果如图1）；2. wt小鼠纤维化模型的建立确定攻虫数量之后，200个囊蚴/只鼠灌胃接种华支睾吸虫囊蚴，以100
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l无菌pbs灌饲小鼠作为空白对照。感染后每天收集小鼠粪便，分别于感染后7 d、15 d和35 d安乐死小鼠，分离肝脏进行总rna提取和马松染色，小鼠肝纤维化情况如图2所示；3. 荧光定量pcr（rt-pcr）检测tlr3的表达情况使用trizol试剂分离细胞/及肝组织总rna，使用一步法gdna反转试剂盒合成cdna。rt-pcr中使用的所有引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成；严格按照使用说明书使用荧光染料faststart universal sybr green master（rox）进行rt-pcr体系的配制；rt-pcr程序分为三个步骤：95℃ 1 min；然后95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，重复30个循环；之后，72℃ 10 min；引物如下：tlr3-f
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cgcagttcagcaagctattg ；tlr3-r
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tcttcgcaaacagagtgcat ；β-actin-f
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tgctgtccctgtatgcctct；β-actin-r
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ggtctttacggatgtcaacg；mrna的表达水平分析使用β-actin作为内参基因。通过收集荧光信号自动分析熔解曲线，采用22-δδct
公式计算mrna的相对表达量，其中δδct代表ct（样本）-ct（对照）；每个样品都进行了3次重复测试，最终分析所用的数据来自于3个独立的实验；tlr3表达情况见图3a；4. tlr3调节华支睾吸虫致肝纤维化的机制分离华支睾吸虫胞外囊泡，刺激胆管上皮细胞，收集细胞总蛋白，western blot检测免疫调节相关通路蛋白磷酸化水平。收集培养上清，检测细胞因子表达情况。发现，宿主细胞tlr3识别华支睾吸虫胞外囊泡中的dsrna，从而激活tlr3的高表达，通过降低ekr和p38
通路的过度磷酸化，降低il-6和tnf-α的表达（图3）。
12.试验例1以下实验表明本发明用于华支睾吸虫性肝纤维化的效果评估1. tlr3缺失小鼠感染华支睾吸虫后体重、死亡率、肝内荷虫量变化情况按照上述方法建立华支睾吸虫致小鼠肝纤维模型，每天记录小鼠体重，死亡率，并于感染的35天计数感染小鼠肝内寄生虫数量。华支睾吸虫感染小鼠的体重明显下降，并在感染后20 d体重开始缓慢上升。华支睾吸虫感染的 tlr3-/-小鼠体重降低更为明显（图4a）。对感染小鼠的死亡率监测显示，华支睾吸虫感染的tlr3-/-小鼠的死亡率是50%，显著高于华支睾吸虫感染的wt小鼠的40%（图4b）。对感染小鼠肝内寄生虫进行统计分析，结果显示华支睾吸虫感染的tlr3-/-小鼠肝内寄生虫数（35条）显著高于wt小鼠（27条）。此外我们发现tlr3-/-小鼠肝内成虫数量（20条）与wt小鼠（13条）相比显著增加 （图4c）（p《0.001）。
13.2. tlr3缺失对华支睾吸虫感染小鼠的肝脏损伤和炎症反应的影响我们对感染华支睾吸虫的wt小鼠和tlr3-/-小鼠的肝脏剖检病变，肝组织病理切片及胆管上皮细胞形态进行了观察，pbs处理小鼠作为阴性对照。与野生型小鼠相比，tlr3缺失小鼠肝脏病变加重，可见明显突起的条索状胆管结缔组织，肝肿大，肝脏结节更为明显。pbs对照组小鼠肝脏无病变（图5a）；pbs处理的小鼠肝脏组织形态完整，边界清晰。相比之下，在华支睾吸虫感染7 d、15 d和35 d时，wt和tlr3-/-小鼠肝脏出现坏死灶，坏死灶周围及门静脉周围聚集大量炎症细胞。与wt小鼠相比，感染华支睾吸虫的tlr3-/-小鼠肝脏炎症更为严重，在感染7 d时即出现大量的坏死灶，并在感染15 d及35 d时观察到明显的肌成纤维细胞围绕胆管的聚集，胆管中有阻塞的虫体（图5b）。对华支睾吸虫感染后小鼠胆管病变进行观察，结果显示pbs对照组小鼠胆管上皮细胞排列整齐有序、胆管壁有清晰的层次结构，未见增生及变形。wt感染小鼠出现胆管扩张，胆管上皮细胞增生，管腔变形，无法维持正常形态。与wt感染小鼠相比，tlr3-/-小鼠胆管增生、扩张更为严重，并且出现增生性小胆管，提示tlr3缺失后，华支睾吸虫引起的胆管病变进一步加剧（图5c）；肝脏hai评分，tlr3-/-小鼠评分显著高于wt小鼠 （图5d）（ p《0.05, p《0.05, p《0.05）；通过elisa方法检测tlr3对华支睾吸虫感染宿主肝脏炎症介质的调控作用。结果显示，与wt小鼠相比，华支睾吸虫感染tlr3-/-小鼠肝脏中il-6（图5e）（p《0.001, p《0.001, p《0.001）、tnf-α（图5f）（p《0.001, p《0.001, p《0.001）、il-4（图5g）（p《0.05, p《0.01, p《0.05）的表达显著增加。然而，ifn-γ 的表达显著降低（图5h）（p《0.001, p《0.001, p《0.001）。
14.3. tlr3缺失对华支睾吸虫引起的肝肌成纤维细胞活化及肝纤维化的影响通过masson染色法观察华支睾吸虫感染的wt和tlr3-/-小鼠的肝纤维化情况，pbs处理的小鼠作为阴性对照。对照组小鼠肝脏无胶原沉积。与此形成鲜明对比的是，华支睾吸虫感染的wt和tlr3-/-小鼠的胆管周围胶原纤维持续积累。与wt小鼠相比，感染华支睾吸虫的tlr3-/-小鼠在感染7 d时胆管周围胶原沉积更为明显；感染15 d时，胆管周围胶原面积急剧增加，并形成明显的纤维桥连；在感染35 d时，汇管区完全被沉积的胶原包裹，而且胶原已经延伸到肝脏实质，形成大面积的肝纤维化（图6a）。使用image j对小鼠肝纤维化进行定量分析，结果显示tlr3缺失导致华支睾吸虫性肝纤维化急剧恶化，胶原纤维沉积面积显著
增加（p《0.001, p《0.001, p《0.001）。这些结果提示tlr3可以减少华支睾吸虫引起的肝纤维化（图6b）；免疫组化对肝脏中α-sma蛋白进行检测以确定华支睾吸虫感染后肝脏中肌成纤维细胞的数量及位置。结果显示，华支睾吸虫感染能够显著激活宿主肝脏中的肌成纤维细胞活化，活化的肌成纤维细胞主要分布于胆管周围（图6c、d）（p《0.001, p《0.001, p《0.001）。与wt小鼠相比，在感染的7 d、15 d和35 d，tlr3缺失小鼠肝脏中α-sma蛋白表达量显著升高，提示tlr3缺失增强了肌成纤维细胞的活化（图6c）。image j对小鼠肝脏中α-sma阳性面积进行定量分析结果显示，与wt小鼠相比，在感染后的15 d及35 d，tlr3缺失后小鼠肝脏中α-sma阳性面积增加（图6d）（p》0.05, p《0.01, p《0.001）。
15.4. tlr3激动剂治疗方案的实施按照上述方法建立华支睾吸虫致小鼠肝纤维模型，在感染囊蚴前8 h对小鼠经腹腔注射100
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g只poly（i:c）溶液，并于华支睾吸虫感染wt小鼠后的第10 d及第20 d分别再次给予poly（i:c）100
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g/只腹腔注射处理。
16.5. tlr3高表达对感染小鼠体重、肝内寄生虫数量及生存率的影响从灌胃囊蚴当日，每日同一时间进行称量和记录，并每日记录小鼠死亡情况。tlr3激动剂poly （i:c）处理小鼠显著提高了tlr3在小鼠感染肝脏中的表达（图 6a）。tlr3高表达的小鼠体重显著高于未处理组小鼠（图 7a）。华支睾吸虫感染wt小鼠急性期死亡率平均为40%，tlr3高表达小鼠全部存活，完全阻断了由华支睾吸虫引起的急性期死亡（图 7b）。在感染的7 d、15 d、35 d，安乐死小鼠，并取肝脏，观察并记录小鼠肝脏病变情况。tlr3高表达能够显著减少华支睾吸虫感染小鼠肝内寄生虫数量，由平均31条减少为平均8条（图 7c）（p《0.001），并且tlr3高表达组小鼠体内成虫数量明显减少（图 7c）（p《0.001）。
17.6. tlr3高表达治疗对感染小鼠肝脏病变及肝组织损伤的影响通过剖检结合病理切片观察感染小鼠肝脏病变及组织损伤情况。与未处理组小鼠相比，tlr3高表达小鼠肝脏病变程度明显减轻，在感染的7 d未见明显的肝脏病变，未见明显肝肿大或胆汁淤积现象，感染15 d时出现轻微的出血点，感染35 d时有轻微的纤维病变（图8a）。
18.与未处理组小鼠相比，tlr3高表达组小鼠病理变化显著缓解（图8b）（p《0.05, p《0.01, p《0.001）。tlr3高表达组小鼠肝脏炎性反应明显降低，在感染后第7 d肝脏内未见炎性病理变化，无炎性细胞聚集及坏死灶出现（p《0.05）；感染15 d时，仅出现少量炎性细胞聚集（p《0.01），未见坏死灶和明显胆管扩张；感染35 d后，肝脏病理变化增加，炎性细胞数量增加，相较于wt小鼠，病变和炎症反应仍较轻（图8b）（p《0.001）。
19.免疫组化观察感染华支睾吸虫后小鼠胆管变化，结果显示，wt小鼠感染华支睾吸虫后胆管上皮细胞细胞膨大，管腔显著扩张，胆管上皮细胞增生、变性, 胆管中有发育不同阶段的华支睾吸虫（图8c）。tlr3高表达组小鼠不同感染时间肝胆管病变与未处理组相比均有明显改善，感染7 d及15 d几乎无胆管病变的发生，胆管形态较为规整，结构清晰，仅在感染35 d时出现轻微的上皮细胞增生变性（图8c）。肝脏hai评分，tlr3高表达组小鼠评分显著低于wt小鼠 （图8d）（p《0.05, p《0.01, p《0.001）；取肝脏，置于50 ml离心管中，使用剪刀将肝组织剪成小块，加入3 ml无菌pbs，并使用组织匀浆器将肝组织彻底研磨破碎。收集上清，使用elisa检测试剂盒对il-4、il-6、
ifn-γ、tnf-α和tgf-β1的表达进行检测。elisa检测结果显示，tlr3高表达显著降低了小鼠肝脏中il-6（p《0.001, p《0.001, p《0.001）、tnf-α（p《0.001, p《0.001, p《0.001）、il-4（p《0.01, p《0.01, p《0.05）的表达，并促进ifn-γ 的表达（p《0.001, p《0.001, p《0.001）（图8e-h）。
20.7. tlr3高表达对感染小鼠肝脏肌成纤维细胞活化及胶原蛋白沉积情况观察取小鼠肝脏，福尔马林固定，石蜡包埋肝组织进行的α-sma免疫组织化学分析。光学显微镜观察蛋白表达情况，并通过image-pro plus软件对蛋白表达水平进行数字化分析。我们通过免疫组化检测肝脏活化的成纤维细胞标志蛋白α-sma。结果显示，华支睾吸虫感染引起wt小鼠肝脏肌成纤维细胞的大量活化。tlr3高表达显著降低了华支睾吸虫导致的肝脏肌成纤维细胞的活化（图9a）。统计分析显示，相比未处理组，在华支睾吸虫感染35 d时tlr3高表达小鼠肝脏中α-sma阳性细胞的面积35 d减少了25.73%（图9b）（p》0.05, p《0.01, p《0.001）。
21.通过马松染色对感染小鼠肝脏中胶原蛋白沉积情况进行检测。马松染色前序处理与免疫组化染色相同，经二甲苯脱蜡后梯度酒精水化，严格按照solarbio公司马松染色试剂盒说明书制作马松染色切片，光学显微镜观察小鼠肝纤维化程度。马松染色结果显示，与未处理组小鼠相比，tlr3高表达小鼠肝脏纤维胶原沉积情况得到显著改善。在感染的7 d和15 d后，tlr3高表达小鼠肝脏几乎无胶原沉积（图9c、d）（p《0.05, p《0.001）；感染35 d，胆管周围出现胶原纤维化沉积，但与处理组相比显著降低（图9c、d）（p《0.001）。这些结果表明tlr3高表达帮助机体降低由华支睾吸虫感染诱导的肝纤维化中胶原的沉积。