平卧菊三七提取物及其发酵提取物的制备和应用的制作方法

1.本发明涉及植物提取物和日化领域，尤其涉及一种平卧菊三七提取物和发酵提取物的制备和应用。


背景技术：

2.平卧菊三七(gynura procumbens(lour.)merr)为菊科菊三七属植物，药食兼用，含有多酚、三萜、黄酮等多种功能活性成分，具有祛斑美白、抗氧化、抗炎、抗过敏、抗病原微生物等功效，民间常将其嫩茎叶作蔬菜食、作茶饮，以根或全草入药，清热解毒，用于牙痛、跌打伤痛、咽喉肿痛、痈肿疮疖等症状的治疗，2012年5月平卧菊三七被我国卫生部批准为新资源普通食品(原卫生部公告2012年第8号)。虽然其传统药食价值较高，但截止目前，对平卧菊三七功效成分和作用机制的研究开发尚不够深入，尤其在日化领域内的实际应用几乎空白，在国家药品监督管理局最新发布的《已使用化妆品原料目录(2021年版)》的8972种已使用化妆品原料中，平卧菊三七及其提取物相关制品均未列入其中，因此，本发明的技术成果为我国化妆品产业提供了一种新原料。
3.皮肤中的黑色素含量是决定皮肤色泽的主要因素，在黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素，因此抑制酪氨酸酶活性可以减少多巴转化成多巴醌，从而限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着，达到美白祛斑的目的。但常用的美白祛斑方法普遍存在较明显的不良反应，例如酪氨酸酶抑制剂氢醌及其衍生物、维a酸，黑色素转运抑制剂烟酰胺、具有黑素细胞抗增殖及毒性作用的壬二酸、各种有机酸皮肤化学剥脱剂、糖皮质激素等常用美白祛斑成分均易引起皮肤刺激、过敏和炎症反应等副作用，长期或过量使用会对皮肤屏障功能造成严重损伤。因此，在祛斑美白的同时减少其刺激性，在保证功效的前提下降低不良反应发生率，同时兼有皮肤舒缓功效，是目前美白祛斑类功效成分研发亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种兼具皮肤美白祛斑和舒缓功效的平卧菊三七提取物和发酵提取物的制备和应用，其主要功效成分为总多酚和总三萜。该提取物和发酵提取物具有显著的酪氨酸酶抑制能力、dpph自由基清除能力和透明质酸酶抑制能力，可添加于皮肤外用剂中，具有美白祛斑、抗氧化、抗皮肤老化、敏感肌护理、舒缓皮肤等作用，安全无毒，使用简单，提取与制备的工艺方法环保、易于实施，应用前景广阔，是优良的天然植物化妆品新原料。
5.本发明所采用的技术方案如下：
6.1.平卧菊三七提取物，由下述方法制备而得：
7.1.1取平卧菊三七全株的干燥品(含水量≤15％)，用20～35倍量的纯水，恒温25～45℃浸泡8～24h；优选的，用22～35倍量的纯水，恒温28～45℃浸泡12～24h。
8.1.2浸泡结束后，进行超声波破碎提取。超声参数如下：超声总时间15～40min、超
声输出功率300～1000w、超声工作时间5～15s、超声间隔时间5s；优选的，超声参数如下：总时间18～40min、输出功率320～1000w、工作时间8～15s、间隔时间5s。
9.1.3超声提取完成后出料静置4h，虹吸上清液，调节体系ph值5.0～6.8；优选的，调节体系ph值5.1～6.8。
10.1.4用壳聚糖～卡拉胶组合的絮凝方法去除前述步骤制得的上清液中的植物蛋白、鞣质和植物胶等杂质。具体絮凝方法如下：取1％壳聚糖溶于1.5～2.5％的柠檬酸水溶液中，溶胀24h后备用，配制1％卡拉胶水溶液保持温度60～70℃备用。先往前述步骤制得的上清液中搅拌加入壳聚糖溶液，加入量为上清液重量的4.5～13％，混合均匀后静置半小时后搅拌加入卡拉胶溶液，加入量为直至出现絮状沉淀、液体澄清为止；优选的，壳聚糖溶液加入量为上清液重量的5～13％，卡拉胶溶液加入量为上清液重量的2.5～8％。
11.1.5将含有絮状物的前述待澄清液体静置分离或离心分离，取澄清液将其用0.45μm板框过滤，取过滤液减压浓缩至7倍干燥品重量，即制得平卧菊三七提取物。
12.2.平卧菊三七发酵提取物，由下述方法制备而得：
13.2.1取平卧菊三七全株的干燥品(含水量≤15％)，加入5～20倍重量纯水和0.1～0.5倍重量酵母菌，发酵设置温度25～45℃、搅拌转速2～50rpm、时间10～24h，经灭菌、过滤取得滤液，补足纯水至加入量，即可制得发酵物；优选的，加入6～20倍重量纯水和0.15～0.5倍重量酵母菌，发酵设置温度27～45℃、搅拌转速4～50rpm、时间12～24h，经121℃灭菌20min、200目过滤取得滤液，补足纯水至加入量，即可制得发酵物。
14.2.2调节发酵物ph值5.0～6.8；优选的，调节体系ph值5.1～6.8。
15.2.3用壳聚糖～卡拉胶组合的絮凝方法去除前述步骤制得的发酵物中的植物蛋白、鞣质和植物胶等杂质。具体絮凝方法如下：取1％壳聚糖溶于1.5～2.5％的柠檬酸水溶液中，溶胀24h后备用，配制1％卡拉胶水溶液保持温度60～70℃备用。先往前述步骤制得的发酵物中搅拌加入壳聚糖溶液，加入量为发酵物重量的4.5～13％，混合均匀后静置半小时后搅拌加入卡拉胶溶液，加入量为直至出现絮状沉淀、液体澄清为止；优选的，壳聚糖溶液加入量为发酵物重量的5～13％，卡拉胶溶液加入量为发酵物重量的2.5～8％。
16.2.4将含有絮状物的前述待澄清液体静置分离或离心分离，取澄清液将其用0.45μm板框过滤，取过滤液减压浓缩至7倍干燥品重量，即制得平卧菊三七发酵提取物。
17.平卧菊三七提取物在制备化妆品中的应用，可用作美白祛斑、抗氧化、抗皮肤老化、修护、敏感肌护理、舒缓功效的活性成分。平卧菊三七提取物的用量为0.01％～30％。
18.平卧菊三七发酵提取物在制备化妆品中的应用，可用作美白祛斑、抗氧化、抗皮肤老化、修护、敏感肌护理、舒缓功效的活性成分。平卧菊三七发酵提取物的用量为0.01％～30％。
19.本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
20.本发明提供了一种兼具皮肤美白祛斑和舒缓功效的平卧菊三七提取物和发酵提取物的制备和应用，其主要功效成分为总多酚和总三萜。该提取物和发酵提取物具有显著的酪氨酸酶抑制能力、dpph自由基清除能力和透明质酸酶抑制能力，可添加于皮肤外用剂中，具有美白祛斑、抗氧化、抗皮肤老化、修护、敏感肌护理、舒缓皮肤等作用，安全无毒，使用简单，提取与制备的工艺方法环保、易于实施，应用前景广阔，是优良的天然植物化妆品新原料。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式作进一步地详细描述。
22.实施例1：平卧菊三七提取物制备。
23.取平卧菊三七全株的干燥品(含水量≤15％)，用32倍量的纯水，恒温35℃浸泡16h。浸泡结束后，进行超声波破碎提取。超声参数如下：总时间30min、输出功率450w、工作时间10s、间隔时间5s。超声提取完成后出料静置4h，虹吸上清液，调节体系ph值5.1～6.8。配制2％的柠檬酸水溶液，加入1％壳聚糖溶胀24h后备用，另配制1％卡拉胶水溶液保持温度60～70℃备用。先往前述步骤制得的上清液中搅拌加入壳聚糖溶液，加入量为上清液重量的5～13％，混合均匀后静置半小时后搅拌加入卡拉胶溶液，加入量为上清液重量的2.5～8％，直至出现絮状沉淀、液体澄清为止。将含有絮状物的前述待澄清液体离心分离，取澄清液将其用0.45μm板框过滤，取过滤液减压浓缩至7倍干燥品重量，即制得平卧菊三七提取物。
24.平卧菊三七提取物活性物含量测定：
25.总多酚含量测定方法：t/ahfia005-2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》。结果：总多酚含量1329.4mg/l。
26.总三萜含量测定方法：《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》(2020年版)第二部分功效成分/标志性成分检验方法二十、保健食品中总三萜的测定。结果：总三萜含量：0.222g/100g。
27.实施例2：平卧菊三七提取物酪氨酸酶抑制试验。
28.试验原理：在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在ph6.8的磷酸溶液中可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的样品可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化评估样品对酪氨酸酶活性的抑制作用，本试验方法为体外法，适用于评估宣称通过抑制酪氨酸酶活性而达到美白祛斑效果的样品。
29.试验方法：t/shrh 015-2018《化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法》
30.试验结果表：
31.名称样品处理单位试验结果p值平卧菊三七提取物稀释成5％水溶液％90.035
±
0.612＜0.05平卧菊三七提取物稀释成15％水溶液％92.426
±
6.788＜0.05阴性对照(纯水)/％-4.407
±
1.429/阳性对照(曲酸，纯度≥98.5％)纯水稀释至0.05％％92.229
±
0.986＜0.05
32.表1
33.试验结论：试验样品测试结果见表1，阳性对照酪氨酸酶抑制率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，酪氨酸酶抑制率为90.035％，当样品稀释成15％水溶液时，酪氨酸酶抑制率为92.426％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有美白祛斑效果。
34.实施例3：平卧菊三七提取物dpph自由基清除能力试验。
35.试验原理：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称dpph)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使dpph乙醇溶液光吸收减弱。dpph乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价试验样品清除自由基的能力，即抗氧化活性的大小。
36.试验方法：t/shrh 006-2018《化妆品-自由基(dpph)清除实验方法》
37.试验结果表：
[0038][0039][0040]
表2
[0041]
试验结论：试验样品测试结果见表2，阳性对照dpph自由基清除率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，dpph自由基清除率平均值为60.933％，当样品稀释成15％水溶液时，dpph自由基清除率平均值为84.587％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有抗氧化功效。
[0042]
实施例4：平卧菊三七提取物透明质酸酶抑制试验。
[0043]
试验原理：透明质酸酶是透明质酸的特异性裂解酶，是过敏反应的参与者，与肥大细胞释放组胺等有强相关性。试验样品是否具有舒缓功效，可以利用透明质酸酶抑制率来判断，透明质酸酶抑制率越高则反映该物质舒缓效果越强，反之则越弱。
[0044]
试验方法：样品预处理后与透明质酸酶等溶液进行显色反应，用紫外分光光度计测定波长为528 nm处吸光度值，计算透明质酸酶抑制率。
[0045]
试验结果表：
[0046]
名称样品处理单位试验结果p值平卧菊三七提取物稀释成5％水溶液％32.031
±
0.563＜0.05平卧菊三七提取物稀释成15％水溶液％49.651
±
0.687＜0.05阴性对照(纯水)/％-4.664
±
0.312/阳性对照(甘草酸二钾,纯度≥98％)纯水稀释至3％％59.671
±
0.380＜0.05
[0047]
表3
[0048]
试验结论：试验样品测试结果见表3，阳性对照透明质酸酶抑制率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，透明质酸酶抑制率为32.031％，当样品稀释成15％水溶液时，，透明质酸酶抑制率为49.651％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有舒缓功效。
[0049]
实施例5：平卧菊三七发酵提取物制备。
[0050]
取平卧菊三七全株的干燥品(含水量≤15％)，加入10倍重量纯水和0.3倍重量酵母菌，发酵设置温度35℃、搅拌转速5rpm、时间24h，经121℃灭菌20min、200目过滤取得滤液，补足纯水至加入量，即可制得发酵物。调节发酵物ph值5.1～6.8。配制2％的柠檬酸水溶
液，加入1％壳聚糖溶胀24h后备用，另配制1％卡拉胶水溶液保持温度60～70℃备用。先往前述步骤制得的发酵物中搅拌加入壳聚糖溶液，加入量为发酵物重量的5～13％，混合均匀后静置半小时后搅拌加入卡拉胶溶液，加入量为发酵物重量的2.5～8％，直至出现絮状沉淀、液体澄清为止。将含有絮状物的前述待澄清液体静置分离或离心分离，取澄清液将其用0.45μm板框过滤，取过滤液减压浓缩至7倍干燥品重量，即制得平卧菊三七发酵提取物。
[0051]
平卧菊三七发酵提取物活性物含量测定：
[0052]
总多酚含量测定方法：t/ahfia005-2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》。结果：总多酚含量1156.2mg/l。
[0053]
总三萜含量测定方法：《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》(2020年版)第二部分功效成分/标志性成分检验方法二十、保健食品中总三萜的测定。结果：总三萜含量：0.293g/100g。
[0054]
实施例6：平卧菊三七发酵提取物酪氨酸酶抑制试验。
[0055]
试验方法：t/shrh 015-2018《化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法》
[0056]
试验结果表：
[0057]
名称样品处理单位试验结果p值平卧菊三七发酵提取物稀释成5％水溶液％91.275
±
0.403＜0.05平卧菊三七发酵提取物稀释成15％水溶液％94.107
±
1.634＜0.05阴性对照(纯水)/％-4.407
±
1.429/阳性对照(曲酸，纯度≥98.5％)纯水稀释至0.05％％92.229
±
0.986＜0.05
[0058]
表4
[0059]
试验结论：试验样品测试结果见表4，阳性对照酪氨酸酶抑制率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，酪氨酸酶抑制率为91.275％，当样品稀释成15％水溶液时，酪氨酸酶抑制率为94.107％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有美白祛斑效果。
[0060]
实施例7：平卧菊三七发酵提取物dpph自由基清除能力试验。
[0061]
试验方法：t/shrh 006-2018《化妆品-自由基(dpph)清除实验方法》
[0062]
试验结果表：
[0063]
名称样品处理单位试验结果p值平卧菊三七发酵提取物稀释成5％水溶液％87.291
±
1.033＜0.05平卧菊三七发酵提取物稀释成15％水溶液％93.132
±
0.357＜0.05阴性对照(纯水)/％-0.825
±
0.012/阳性对照(维生素e，纯度≥96％)95％乙醇稀释至0.1％％82.203
±
1.235＜0.05
[0064]
表5
[0065]
试验结论：试验样品测试结果见表5，阳性对照dpph自由基清除率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，dpph自由基清除率平均值为87.291％，当样品稀释成15％水溶液时，dpph自由基清除率平均值为93.132％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有抗氧化功效。
[0066]
实施例8：平卧菊三七发酵提取物透明质酸酶抑制试验。
[0067]
试验方法：样品预处理后与透明质酸酶等溶液进行显色反应，用紫外分光光度计
测定波长为528nm处吸光度值，计算透明质酸酶抑制率。
[0068]
试验结果表：
[0069]
名称样品处理单位试验结果p值平卧菊三七提取物稀释成5％水溶液％37.138
±
0.451＜0.05平卧菊三七提取物稀释成15％水溶液％52.247
±
0.310＜0.05阴性对照(纯水)/％-4.664
±
0.312/阳性对照(甘草酸二钾,纯度≥98％)纯水稀释至3％％59.671
±
0.380＜0.05
[0070]
表6
[0071]
试验结论：试验样品测试结果见表6，阳性对照透明质酸酶抑制率》50％，反应体系有效。当样品稀释成5％水溶液时，透明质酸酶抑制率为37.138％，当样品稀释成15％水溶液时，，透明质酸酶抑制率为52.247％，与阴性对照相比均具有显著性差异(p《0.05)，表明样品具有舒缓功效。
[0072]
实施例9：平卧菊三七提取物在制备美白精华液中的应用。
[0073]
含10wt％平卧菊三七提取物的美白精华液配方如表7所示：
[0074][0075]
表7
[0076]
表7配方中各组分按以下工艺进行制备：
[0077]
(1)首先按上述表格中的组分名称和重量称取各组分投入搅拌锅；(2)将a相中8种组分混合搅拌至完全溶解；
[0078]
(3)搅拌加入b相，至各组分混合均匀、完全溶解，出料。
[0079]
实施例10：平卧菊三七发酵提取物在制备舒缓面霜中的应用。
[0080]
含15wt％平卧菊三七发酵提取物的舒缓面霜配方如表8所示：
[0081][0082]
表8
[0083]
表8配方中各组分按以下工艺进行制备：
[0084]
(1)首先按上述表格中的组分名称和重量称取各组分；
[0085]
(2)将a相各组分混合后加热至82℃，搅拌均匀；
[0086]
(3)将b相各组分混合搅拌至全部溶解并加热至82℃；
[0087]
(4)将b相加入a相，于真空乳化锅中3000rmp均质5min，搅拌冷却至40℃，出料。
[0088]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。