当归补血汤在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别的涉及当归补血汤在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是全球人口死亡主要原因之一，严重危害人类生命健康。近年来免疫治疗取得了令人瞩目的临床疗效，为肿瘤治疗领域带来了新曙光。尤其是pd1/pdl1免疫检查点抑制剂等为代表的免疫治疗药物的大量临床使用，因其广泛的抗肿瘤作用，已经延长了众多瘤种的生存期。免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitors，icis)疗法通过阻断被肿瘤细胞劫持的免疫抑制通路(如pd-l1/pd-1和ctla-4/b7-1)来重新活化t细胞，重新激活机体的免疫系统对肿瘤细胞的识别与清除能力，具有疗效好，反应持久的优势，开创了肿瘤治疗的新时代。免疫检查点抑制剂已经成为恶性黑色素瘤、肾细胞癌等在内的多种恶性肿瘤的标准治疗方法。但并非所有患者均可从治疗中获益，接受免疫检查点抑制剂单药治疗的患者总体客观缓解率仅有20％左右，并且即便是在一些初始免疫治疗反应良好的患者中，还可通过获得性抵抗导致复发，免疫检查点抑制剂对晚期肿瘤患者疗效欠佳也是当前亟待解决的临床问题。临床数据还表明，经治前合并贫血(肿瘤相关性贫血)的肿瘤患者难以从pd1/pd-l1抗体治疗中获益，常出现治疗抵抗；经治前血红蛋白水平则是肿瘤患者pd1/pd-l1抗体治疗疗效的独立预测指标，患者对免疫检查点药物的抵抗或耐药是当前亟需解决的临床瓶颈问题。因此，如何增强免疫检查点抑制剂的疗效显得尤为关键。
3.为了解决上述问题，亟需开发增效免疫检查点抑制剂功效的联合策略。目前主流的联合策略包括手术、化疗、放疗、靶向治疗等治疗手段与icis的联合疗法，可产生协同作用，增强icis的持久性和疗效，克服icis的响应率低的问题。如发明专利cn106963948a公开了阿帕替尼和pd-1抑制剂联合使用的用途，说明书记载的动物实验数据证明，两者的联用对于结肠癌的治疗具有显著作用。发明专利cn105960415a公开了阿西替尼和pd-1抑制剂联合使用的用途，说明书记载的临床试验方案显示，两者的联用预计对于肾细胞癌具有显著的治疗作用。尽管这些联合疗法可在一定程度上提高icis的疗效和响应率，但通常毒性也会随之增加，毒副作用较大，增加不良反应发生率，降低患者的生理机能和生活质量。
4.免疫检查点抑制剂促进免疫细胞(特别是cd8
+
t细胞)对肿瘤的杀伤作用从而改善了t细胞的耗竭状态是其能发挥疗效的关键。但若肿瘤细胞周围免疫细胞数量缺乏或识别肿瘤细胞的免疫细胞作用失能，即使免疫检查点抑制剂能改善的功能耗竭，机体对其的治疗抵抗或耐药仍无法避免。而抗原递呈细胞的失能和肿瘤周围t细胞的匮乏是免疫检查点药物在晚期肿瘤患者出现抵抗或耐药的重要原因。因此增强肿瘤周围t细胞的数量或促进抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈作用是改善免疫检查点抑制剂治疗抵抗或耐药的重要突破口。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种当归补血汤在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用，大幅提高免疫检查点抑制剂作为抗肿瘤药物的治疗有效性，为晚期肿瘤的治疗提供新的治疗方案和新思路，解决了免疫检查点抑制剂对晚期肿瘤患者疗效欠佳等问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种当归补血汤在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用，所述当归补血汤包括黄芪和当归。
7.作为优选的，所述黄芪和当归的质量比为1～10：1。
8.作为优选的，所述免疫检查点抑制剂包括pd-l1抗体、pd-1抗体、pd-1和pd-l1中的一种或多种。
9.本发明的另一个目的还在于，提供了一种抗晚期肿瘤的药物组合物，包括上述的当归补血汤与免疫检查点抑制剂。
10.本发明的另一个目的还在于，提供了一种如上述药物组合物在制备治疗抗晚期肿瘤药物中的应用。
11.作为优选的，所述肿瘤为结肠癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种。
12.作为优选的，是向受试患者施用所述当归补血汤与免疫检查点抑制剂，所述当归补血汤包括质量比为1～10：1的黄芪和当归。
13.作为优选的，所述当归补血汤与免疫检查点抑制剂可以同时、分开或顺序给药。
14.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.1、本发明首次发现当归补血汤可增强免疫检查点抑制剂抗晚期肿瘤的疗效，在肿瘤的动物模型中，当归补血汤可以促进肿瘤组织或引流淋巴结中cd8
+
t细胞的增殖和活化以及促进机体对肿瘤细胞的抗原提呈作用，使用当归补血汤可以显著增强免疫检查点抑制剂的抗晚期肿瘤疗效，两者的联用表现出协同增效，可达到良好的治疗肿瘤效果，解决了免疫检查点抑制剂对晚期肿瘤患者疗效欠佳的问题。因此，当归补血汤联合免疫检查点抑制剂可应用在制备抗晚期肿瘤的药物中。本发明为治疗晚期肿瘤的研究提供了新的思路和理论基础，具有重大意义。
16.2、本发明的当归补血汤为天然中药组分，具有较高的安全性和较小的毒副作用，能为患者保障更为良好的生理机能和生活质量，原材料取材广泛，价格低廉，降低了肿瘤的治疗成本，具有良好的应用前景。
附图说明
17.图1为实施例1中晚期肿瘤实验不同试验组小鼠的处理过程示意图。
18.图2为晚期肿瘤实验中不同处理组小鼠的肿瘤体积随时间变化的照片。
19.图3为晚期肿瘤实验中不同处理组小鼠的肿瘤体积随时间变化的曲线图。
20.图4为早期肿瘤实验中不同处理组小鼠的肿瘤大小随时间变化图；a为处理过程示意图，b为肿瘤体积，c为肿瘤大小照片，d为肿瘤重量。
21.图5为实施例2中不同处理组小鼠的脾脏的流式细胞图；a为cd8
+
t细胞的比例，b为cd4
+
t细胞的比例。
22.图6为实施例2中不同处理组小鼠脾脏的流式细胞图；a为cd8
+
t细胞中活化因子ifn-γ+的比例，b为cd8
+
t细胞中活化因子tnf-α+的比例。
23.图7为实施例3中不同处理组小鼠的外周血中cd8
+
t细胞的比例。
24.图8为实施例3中不同处理组小鼠的肿瘤细胞中淋巴细胞的比例(a)、cd8
+
t细胞的比例(b)以及活化cd8
+
t细胞的比例(c)。
25.图9为实施例4中不同处理组小鼠的肿瘤组织引流淋巴结中cd8
+
t细胞的比例(a)以及活化cd8
+
t细胞的比例(b)。
26.图10为实施例5中不同试验组小鼠的处理过程示意图。
27.图11为实施例5中不同处理组小鼠的肿瘤组织引流淋巴结中ot-1t细胞占cd8+t细胞比例(a)、ot-1t细胞的数量(b)以及活化ot-1t细胞的比例(c/d)。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
29.以下实施例中将mc38细胞(结肠癌，5
×
105)分别接种于6周龄c57bl/6小鼠背部，建立小鼠皮下荷瘤模型。
30.当归补血汤的制备：当归20g、黄芪100g。常规水煎，浓缩成1.5g生药/ml浓度备用(根据药典采用黄芪甲苷iv、阿魏酸作为药物质控指标，液质联用检测黄芪甲苷iv、阿魏酸的含量)。
31.实施例1
32.在晚期肿瘤干预实验中，将荷瘤小鼠分为对照组(con)、当归补血汤组(dgbx)、anti-pd-l1组，当归补血汤(dgbx)联合anti-pd-l1组。当归补血汤组从荷瘤第15天在起给予当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃及皮下注射pbs；anti-pd-l1组从荷瘤第15天起给予生理盐水每天1次灌胃及从荷瘤第15天开始皮下注射pd-l1抗体(200μg/200μl/只，每2天一次，共注射4次)；当归补血汤联合anti-pd-l1组从荷瘤第15天起给予当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃及从荷瘤第15天开始皮下注射pd-l1抗体(200μg/200μl/只，每2天一次，共注射4次)，对照组小鼠给予同等剂量和频次的生理盐水灌胃或pbs皮下注射(如图1)。每2天测量各组中荷瘤小鼠肿瘤的体积，荷瘤第27天处死各组小鼠，结果如图2和图3所示。
33.在早期肿瘤的干预实验中，将荷瘤小鼠分为对照组(control)、当归补血汤组(dgbx)和anti-pd-l1组，当归补血汤组从荷瘤第0天在起给予当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃及第7天开始每2天一次皮下注射pbs(共注射4次)，anti-pd-l1组从荷瘤第7天开始皮下注射pd-l1抗体(200μg/200μl/只，每2天一次，共注射4次)以及从第0天开始灌胃生理盐水(如图4a)，对照组小鼠第0天开始给予同等剂量生理盐水灌胃和第7天开始同等频次和剂量的pbs皮下注射，每2天测量小鼠肿瘤的体积，荷瘤第25天处死各组小鼠，称量小鼠肿瘤的重量，结果如图4所示。
34.从图2和图3中可以看出，在晚期肿瘤干预实验中，当归补血汤组的小鼠肿瘤的体积与对照组的小鼠肿瘤的体积相比无明显差异，这说明单纯使用当归补血汤在荷瘤晚期不能有效控制肿瘤生长；而在肿瘤早期干预实验中，单独使用当归补血汤能有效控制肿瘤的生长，而且其疗效和免疫检查点抑制剂的疗效相当(如图4b、图4c和图4d)；这可能是肿瘤早
期cd8
+
t的功能未严重耗竭，而到了晚期肿瘤cd8
+
t细胞功能耗竭已经发生严重耗竭，所以单独使用当归补血汤在肿瘤早期对肿瘤有疗效，但在肿瘤晚期却无疗效。但令人惊喜的是，在肿瘤晚期干预实验中，将当归补血汤联合anti-pd-l1作用于荷瘤小鼠，该组小鼠均显示出的更小肿瘤的体积，其与对照组和anti-pd-l1组相比肿瘤体积分别减小了75％和50％(如图3)，具有显著的差异。这说明虽然当归血汤在荷瘤晚期不能发挥抗肿瘤作用，但是当归补血汤能显著增强pd-l1抗体抗肿瘤的疗效。
35.实施例2
36.在晚期肿瘤干预实验中，将荷瘤小鼠分为对照组(control)、当归补血汤组(dgbx)，另选用正常无荷瘤小鼠作为阴性对照(tumor-free)。荷瘤第15天时，给对当归补血汤组小鼠灌以当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃，对照组和阴性对照组给予生理盐水灌胃。荷瘤第27天处死各组小鼠，取出小鼠脾脏对cd4
+
t和cd8
+
t细胞进行流式细胞术进行检测，差异的统计学意义采用独立样本t检验(均数
±
s.d。**p《0.01,***p《0.001)，结果如图5和图6所示。
37.从图5中可以看出，与阴性对照组相比，对照组小鼠的脾脏中cd4
+
和cd8
+
的t细胞比例明显下降，而经当归补血汤干预的小鼠脾脏中cd4
+
和cd8
+
的t细胞比例得到明显的提高。从图6中可以看出，与阴性对照组相比，对照组小鼠的脾脏中cd8
+
t细胞的功能明显下降，而经当归补血汤干预的小鼠脾脏中cd8
+
t细胞的功能性得到恢复，能达到正常小鼠水平。说明当归补血汤可上调肿瘤机体脾脏cd4
+
和cd8
+
t细胞的数量和功能。
38.实施例3
39.在晚期肿瘤干预实验中，将荷瘤小鼠分为对照组(control)、当归补血汤组(dgbx)。荷瘤第15天时，给当归补血汤组小鼠灌以当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃，对照组给予生理盐水灌胃。荷瘤第27天处死各组小鼠，取出小鼠外周血和肿瘤组织进行流式细胞术进行检测，差异的统计学意义采用独立样本t检验(均数
±
s.d。*p《0.05,***p《0.01)，结果如图7和图8所示。
40.从图中可以看出，与对照组相比，经当归补血汤干预的小鼠不管是外周血中cd8
+
的t细胞比例，还是肿瘤组织中cd8
+
的t细胞比例均有明显的增多，且经当归补血汤干预的小鼠的肿瘤细胞中t淋巴细胞的比例以及活化cd8
+
的t细胞的数量也明显增多。说明当归补血汤可上调肿瘤机体外周血和肿瘤组织中cd8
+
t细胞的数量和功能。
41.实施例4
42.在晚期肿瘤干预实验中，将荷瘤小鼠分为对照组(control)、当归补血汤组(dgbx)。荷瘤第15天时，给当归补血汤组小鼠灌以当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃，对照组给予生理盐水灌胃。荷瘤第27天处死各组小鼠，取出肿瘤旁引流淋巴结进行流式细胞术进行检测。差异的统计学意义采用独立样本t检验(均数
±
s.d。**p《0.01,***p《0.001)，结果如图9所示。
43.从图中可以看出，与对照组相比，经当归补血汤干预的小鼠引流淋巴结中cd8
+
的t细胞比例明显增多，活化cd8
+
的t细胞的数量也明显增多。说明当归补血汤可上调肿瘤机体引流淋巴结中cd8
+
t细胞的数量和功能。
44.实施例5
45.将mc38皮下荷瘤小鼠分为对照组(control)、当归补血汤组(dgbx)。荷瘤第7天时，
给当归补血汤组小鼠灌以当归补血汤水煎剂(30g生药/kg体重)每天1次灌胃，对照组给予生理盐水灌胃。荷瘤第13天结束以上灌胃给药，但此时给予两组小鼠尾静脉注射ot-1t细胞，荷瘤第17天处死各组小鼠(如图10所示)，取出肿瘤旁引流淋巴结进行流式细胞术进行检测。差异的统计学意义采用独立样本t检验(均数
±
s.d。**p《0.01,***p《0.001)，结果如图11所示。
46.从图中可以看出，与对照组相比，经当归补血汤干预的小鼠的引流淋巴结中ot-1t细胞占cd8
+
t细胞比例明显增加以及ot-1t细胞的数量明显增加，并且活化ot-1t细胞的比例明显增多。说明当归补血汤可增强抗原递呈过程。
47.综上，在肿瘤的动物模型中，使用当归补血汤可以显著增强免疫检查点抑制剂的抗晚期肿瘤疗效。这是由于当归补血汤发挥增敏疗效的机制是促进肿瘤组织或引流淋巴结中cd8
+
t细胞的增殖和活化以及促进机体对肿瘤细胞的抗原提呈作用。因此，当归补血汤能解决了免疫检查点抑制剂对晚期肿瘤患者疗效欠佳的问题。
48.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。