犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术：

0、技术背景

1、貉是一种珍贵的毛皮兽，是一种特种农业养殖动物。近年来，随着人们收入的增长和生活水平的提高，国内毛皮市场逐渐旺盛，同时毛皮出口一直保持稳定，带动了毛皮动物养殖的快速发展。貉作为重要的毛皮动物饲养品种，在毛皮动物养殖格局中占有一定比重。在貉养殖密度大的地区，貉养殖业在促进农民增产增收、吸纳农村剩余劳动力以及完善畜牧产业链等方面发挥了重要作用。貉作为传统饲养的毛皮动物种类之一，具有养殖成本低、下崽成活率高、收益稳定等特点，为养殖户创造了良好的经济收益，貉疾病虽少但是也成为困扰养貉业的一大难题，目前，病毒性疾病以貉犬瘟热、貉病毒性肠炎和伪狂犬为主，占比高达90％。

2、犬瘟热是由犬瘟热病毒(cdv)引起的犬科高度接触性传染病，在全世界大部分国家和地区均有犬、狐、貉、水貂和多种野生动物暴发犬瘟热的报道。严重危害毛皮动物饲养业，被称为毛皮动物三大疫病之一，具有较高的发病率和死亡率。貉犬瘟热无明显的季节性，一年四季均可发生，传染源主要是发病的貉以及带毒的动物。其眼、鼻的分泌物、体液、粪便等含有大量病毒，可对饲料、水源和用具等造成污染。在自然条件下，所有年龄的肉食毛皮动物均易感，尤其以断乳后的仔貉最易感染，一旦感染犬瘟热，不易治愈，及可能造成规模性传染或死亡，则会给养殖户造成巨大的经济损失。

3、貉病毒性肠炎是由貉细小病毒(rdpv)引起的一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率较高，是危害貉业养殖与发展的重要传染病之一。不同年龄和品种的貉均有易感性，尤以8～12周龄的幼貉最为易感，发病貉出现剧烈腹泻，临床上幼貉的发病率一般在70％以上；7月龄以上成年貉多呈隐性感染，临床腹泻症状不明显，发病率为20％左右。发病貉和感染貉是该病的主要传染源，病毒通过粪便、尿液、口鼻分泌物等排出体外，经消化道和呼吸道传染在貉群内传播。貉病毒性肠炎全年都可发生，常呈地方性流行。一旦传入貉场，防疫卫生措施不完善、消毒不彻底都会导致疾病长期存在或周期性发生，存在养殖隐患。

4、所以，貉犬瘟热及貉病毒性肠炎的有效控制，重点在于预防。而目前，国内市场已上市的犬瘟热疫苗或病毒性肠炎相关疫苗多为针对水貂或狐狸的疫苗，尚无针对貉的专用疫苗。并且现有技术多为通过转瓶进行病毒抗原培养，制备过程耗时耗力，所生产抗原批间差异大，疫苗质量较难把控；灭活疫苗在保存过程中，还会出现蛋白(抗原)易降解现象，对疫苗长期保存有很大影响。

5、因此更新技术研制出貉专用的安全、有效、利于长期保存的犬瘟热、貉病毒性肠炎疫苗，实现“一针两防”，势在必行，也将进一步推动行业的发展。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用，本发明的二联冻干灭活疫苗可用于貉犬瘟热和貉病毒性肠炎两种疾病的预防。

2、本发明的技术方案：

3、一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，成分包括犬瘟热病毒抗原及貉细小病毒抗原。

4、所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，疫苗使用的动物包括貉。

5、进一步的，疫苗中犬瘟热病毒含量不低于105.5tcid50/头份，貉细小病毒含量不低于106.0tcid50/头份。

6、进一步的，所述犬瘟热病毒抗原为cdv jtm株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.9905。貉细小病毒抗原为rdpv lt株，为本发明单位自主分离获得毒株。

7、进一步的，抗原灭活方法为：bea(2-溴乙胺氢溴酸盐，购自sigma公司)与naoh按比例混合，环化成bei(二乙烯亚胺，环化反应所得产物)，与抗原混合，调节终浓度为0.0005～0.01mol/l，优选为0.002mol/l；30～45℃，优选为37℃，灭活24～48小时；加入硫代硫酸钠溶液使其终浓度为0.005～0.04mol/l，优选为0.02mol/l，进行灭活阻断，完成抗原灭活。

8、所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的的制备方法，包括以下步骤：

9、(1)犬瘟热病毒灭活抗原制备：

10、选择mdck细胞，加入无血清营养液培养，使用无血清营养液将细胞密度稀释至4.0×106～6.0×106个/ml，按病毒感染指数(moi)0.01～0.1接种生产用毒种培养48～72小时，收获病毒液，抗原液中加入bei溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液中和，即得犬瘟热病毒灭活抗原；

11、(2)貉细小病毒灭活抗原制备；

12、选择crfk转瓶细胞，用胰酶消化成单个细胞并计数，加入含6％～10％牛血清的mem或dmem培养液，培养1～4小时，按moi为0.05～0.1同步接种rdpv生产毒种，培养，rdpv病毒含量应不低于107.5tcid50/ml，抗原液中bei溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液，中和1小时，即得貉细小病毒灭活抗原；

13、(3)配苗及冻干：

14、将步骤(1)和步骤(2)获得的灭活抗原按比例混合，配苗时每头份犬瘟热抗原病毒含量不低于105.5tcid50，貉细小病毒含量不低于106.0tcid50，计算两种抗原配苗用量，用稀释液补充，再与冻干保护剂混合均匀，即为疫苗原液；

15、(4)疫苗稀释液：

16、将佐剂gel02pr(montanide gel 02pr佐剂，购自seppic公司)121℃高压灭菌20～30分钟，与灭菌pbs(0.01mol/l磷酸盐缓冲溶液，主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾及水配制而成)混匀，无菌定量分装，作为犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的配套稀释液。

17、进一步的，所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的的制备方法，

18、步骤(1)中，接种生产用毒种在37℃、60～100r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养48～72小时，收获病毒液，置-15℃以下保存。cdv病毒含量应不低于107.0tcid50/ml，抗原液中加入0.5mol/l bei溶液，使其终浓度为0.002mol/l，37℃条件下灭活24～48小时，加入2mol/l硫代硫酸钠溶液的体积，使其终浓度为0.02mol/l，37℃中和1小时；

19、步骤(2)中，加入含6％～10％牛血清的mem(或dmem)培养液，在37℃、40～60r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养1～4小时，按moi为0.05～0.1同步接种rdpv生产毒种，在37℃、40～60r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养，定时取样观察，80％左右细胞出现病变时收获病毒液，并置于-15℃以下保存。

20、步骤(3)中，用稀释液补充体积至每瓶疫苗装量的1/2～5/6，优选为4/5；再与冻干保护剂按2～6:1比例混合均匀，优选为4:1，即为疫苗原液，混匀后无菌定量分装并加盖冻干后即得；

21、步骤(4)中，将佐剂gel02pr 121℃高压灭菌20～30分钟，与灭菌pbs按体积比1︰6～12的比例混匀，优选为1︰9；

22、所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗疫苗冻干后于2～8℃保存，保存期为36个月。

23、所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗在制备及预防貉犬瘟热、貉病毒性肠炎疾病过程中的应用。

24、具体的，本发明提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的制备方法，

25、具体步骤如下：

26、(1)犬瘟热病毒灭活抗原制备

27、选择生长状态良好的摇瓶mdck细胞，加入无血清营养液并按1.0×106～1.5×106个/ml细胞密度接入生物反应器，在37℃、60～100r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养，每日取样进行细胞观察并计数。当生物反应器中细胞密度达到8.0×106～12.0×106个/ml时，使用无血清营养液将细胞密度稀释至4.0×106～6.0×106个/ml，按病毒感染指数(moi)0.01～0.1接种生产用毒种在37℃、60～100r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养48～72小时，收获病毒液，置-15℃以下保存。cdv病毒含量应不低于107.0tcid50/ml，抗原液中加入0.5mol/l bei溶液，使其终浓度为0.002mol/l，37℃条件下灭活24～48小时，加入2mol/l硫代硫酸钠溶液的体积，使其终浓度为0.02mol/l，37℃中和1小时。经无菌和灭活检验合格后，即得犬瘟热病毒灭活抗原。

28、(2)貉细小病毒灭活抗原制备

29、选择长成致密单层crfk转瓶细胞，用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，根据生物反应器培养体积，每升体积含微载体5g，按0.8×105～1.2×105个/mg细胞密度接入细胞后，加入含6％～10％牛血清的mem(或dmem)培养液，在37℃、40～60r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养1～4小时，按moi为0.05～0.1同步接种rdpv生产毒种，在37℃、40～60r/min、ph值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养，定时取样观察，80％左右细胞出现病变时收获病毒液，并置于-15℃以下保存。rdpv病毒含量应不低于107.5tcid50/ml，抗原液中加入0.5mol/l bei溶液，使其终浓度为0.002mol/l，37℃条件下灭活24～48小时，加入2mol/l硫代硫酸钠溶液的体积，使其终浓度为0.02mol/l，37℃中和1小时。经无菌和灭活检验合格后，即得貉细小病毒灭活抗原。

30、(3)配苗

31、将步骤(1)和步骤(2)获得的病毒抗原按比例混合，配苗时每头份犬瘟热抗原病毒含量不低于105.5tcid50，貉细小病毒含量不低于106.0tcid50，计算两种抗原配苗用量，用稀释液补充体积至每瓶疫苗装量的4/5，再与冻干保护剂按4:1比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后无菌定量分装并加盖冻干后即得。

32、(4)疫苗稀释液

33、将佐剂gel02pr 121℃高压灭菌20～30分钟，与灭菌pbs按体积比1︰9的比例充分混匀，无菌定量分装，作为犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的配套稀释液。

34、本发明提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗在疾病预防中的应用。

35、(1)疫苗安全性研究

36、本发明中犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗分别单剂量(2.0ml含1头份)重复接种、超剂量(4.0ml含2头份)接种貉，观察期内貉体温、精神、食欲、粪便形态、行为活动均无异常，安全性研究结果表明，疫苗对貉安全。

37、(2)疫苗有效性研究

38、a.血清学方法：犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗单剂量接种貉后，7日cdv及rdpv抗体转阳，14日cdv及rdpv中和抗体即可达到临界保护值。

39、b.免疫攻毒：疫苗免疫后28日，攻击犬瘟热和貉病毒性肠炎检验强毒，貉均100％获得保护，效力研究结果表明，本发明二联苗效力确实，能够使貉免于犬瘟热和貉病毒性肠炎强毒攻击。

40、(3)疫苗保存期

41、本发明中犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗置于2～8℃条件下保存36个月，进行疫苗免疫攻毒试验，貉对犬瘟热病毒和貉病毒性肠炎保护仍不低于80％。疫苗保存期确定为2～8℃保存36个月。

42、本发明提供了一种由全悬浮培养的cdv抗原与微载体悬浮培养的rdpv抗原，经灭活后，与冻干保护剂按一定比例混合冻干制成的二联灭活疫苗。用于貉犬瘟热和貉病毒性肠炎两种疾病的预防。疫苗安全性结果表明，疫苗接种后，貉无不良反应，疫苗安全性良好。效力结果表明，疫苗免疫后14日，抗体水平即可达到保护值，免疫后28日攻毒，免疫组貉保护率均达100％，貉可免于犬瘟热和貉病毒性肠炎强毒攻击，获得保护。以上结果证明，本发明犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗对貉安全、有效，真正做到同时预防貉犬瘟热、貉病毒性肠炎两大疾病。

43、本发明有益效果

44、1、本发明提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的制备方法，涉及到犬瘟热病毒抗原，貉细小病毒抗原，经灭活后，冻干制成。

45、2、本发明中二联苗适用的靶动物为貉，目前国内市场无针对貉专用疫苗，多为水貂、犬等动物疫苗进行替代，免疫保护率低，往往需要进行多次重复免疫，增加养殖成本。本发明中二联苗可同时预防貉犬瘟热和貉病毒性肠炎两种疾病，疫苗针对貉子使用，且能够做到一针两防，减少养殖成本，减少养殖户免疫接种的工作量。

46、3、本发明涉及的犬瘟热病毒抗原采用mdck全悬浮细胞接种cdv毒种制备，目前，全病毒大多需要贴壁培养，技术更新后多选用微载体悬浮培养。犬瘟热病毒也多采用vero细胞微载体悬浮培养，本发明中使用驯化后的mdck全悬浮细胞培养与无血清培养基中进行cdv抗原制备，与现有技术相比，节省了微载体和血清的购买成本，培养周期缩短1～2日，且病毒含量高，抗原性状稳定均一。

47、4、本发明中貉细小病毒采用微载体悬浮培养技术进行抗原制备。目前现有技术对貉细小全病毒的培养主要依靠转瓶培养，制备大量抗原耗时费力，且批间差异大。本发明中运用crfk微载体悬浮细胞接种rdpv毒种，所制备的抗原具有病毒含量高、抗原产量大、批间差异小、性状稳定均一的优点。同时，使用悬浮培养技术生产抗原还有节省人工、节约成本、培养条件稳定可控、污染几率小等优点，为提高疫苗质量提供保证。

48、5、本发明中二联苗制备过程中将犬瘟热与貉细小高效价抗原灭活后进行配苗，与以往全病毒活疫苗相比更加安全。

49、6、本发明中二联苗将灭活抗原经过预冷、升华、干燥等程序真空冻干后制得疫苗，采用灭活冻干方式制备的犬瘟热、貉病毒性肠炎二联苗，打破了以往常规灭活疫苗的制备方式。

50、7、本发明中二联冻干灭活疫苗，与以往灭活疫苗相比，可有效减缓蛋白(抗原)的降解，从而延长疫苗保存期。本发明中犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗2～8℃条件下保存期为36个月。

51、8、本发明中二联苗免疫时使用配套稀释液进行稀释，佐剂gel02pr与pbs按体积比1︰9的比例充分混匀，作为犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的配套稀释液，该稀释液中的gel02pr成分具有免疫增强效果，用于疫苗稀释，配套使用能够更有效的增强疫苗免疫效果，为貉提供更好的保护。

52、9、本发明中犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗进行安全检验，分别单剂量(2.0ml含1头份)重复接种、超剂量(4.0ml含2头份)接种貉，连续观察14日，貉体温、精神、食欲、粪便形态、行为活动均无异常，无其他临床异常，证明疫苗对貉安全。二联苗效力检验，单剂量接种貉后，14日cdv、rdpv中和抗体均可达到临界保护值，免疫28日攻毒，免疫组貉100％保护，对照组貉100％发病，证明二联苗效力确实。

53、10、疫苗安全性结果表明，疫苗接种后，貉无不良反应，疫苗安全性良好。效力结果表明，疫苗免疫后14日，抗体水平即可达到保护值，免疫后28日攻毒，免疫组貉保护率均达100％，貉可免于犬瘟热和貉病毒性肠炎强毒攻击，获得保护。以上结果证明，本发明犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗对貉安全、有效，真正做到同时预防貉犬瘟热、貉病毒性肠炎两大疾病。