一种级联调控脊髓微环境促神经再生的静电纺丝制备方法

本发明属于神经再生领域，更具体地说，具体涉及一种级联调控脊髓微环境促神经再生的静电纺丝制备方法。

背景技术：

1、随着全球建筑业和交通业兴起和发展，脊髓损伤发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为人类公共卫生难题。以往研究表明，神经具有再生的潜能，但是面临宿主体内剧烈炎症反应，往往存在修复失败的风险。原发性脊髓损伤后机械物理性损伤导致神经元和轴突死亡，但随后激活的固有免疫反应扩大原发性损伤程度和病变范围。因此，近年国内外研究指出，积极调控急性期炎症反应，改善脊髓损伤微环境，为内源性神经干细胞提供良好增殖和分化平台，可能是治疗的关键。[4]然而，损伤局部恶性炎症级联效应限制内源性神经干细胞募集，引起神经干细胞不足以形成桥接网络，导致神经修复效率较低。[5]因此，如何调控局部免疫微环境促进内源性干细胞迁移成神经元分化，是突破治疗脊髓损伤瓶颈的关键所在。

2、脊髓损伤急性期血——脊髓屏障通透性增强，中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞到达损伤部位发挥固有免疫反应，其中血源性单核-巨噬细胞和活化的小胶质细胞(原位巨噬细胞)受损伤局部趋化调节作用分别在损伤后3天和7天达到峰值，并且可以极化为经典激活巨噬细胞(m1)和交替激活的巨噬细胞（m2），动态参与炎症反应。急性sci阶段，m1型主要清除组织碎片、促进新生血管萌芽和抗原提呈，但局部失衡微环境导致m1过度极化导致剧烈炎症反应，引起m1/m2自发转换能力障碍。研究表明m1与m2亚型之间的动态平衡，能够为nscs成神经分化提供有利的微环境，是决定sci预后的关键因素之一。he shen等开发了一种持续释放il-10并清除damps的水凝胶支架，以此来减少脊髓损伤后巨噬细胞m1的极化。然而，单纯调控免疫炎症，损伤局部缺乏诱导种子细胞成神经分化的生物信号，限制了神经修复。kui shen等设计了一种全身靶向损伤脊髓的纳米药物递送系统，将抗炎药物et通过靶向肽负载在三嵌段共聚物上（plag-pei-mpeg），以此来调控m1和m2比例，降低炎症水平。但是，系统性给药靶向性有待进一步探索，而且损伤局部神经组织坏死后形成的脊髓空洞增加了修复失败的概率。因此，构建兼具调控巨噬细胞和刺激内源性干细胞成神经分化的神经桥接移植材料是亟待解决的难题。

3、近年，神经移植生物材料不仅能够填充缺损部位，而且具有修复脊髓功能的作用。课题组前期研发的左旋聚乳酸（plla）微溶胶静电纺丝技术，制备工艺简便，取向排列纤维模拟天然神经细胞外基质，接触引导神经突和轴突的生长，负载细胞因子载药率高达80%，缓释时间持续6周，尤其能够屏蔽局部恶性微环境对携载生物因子的有害因素，是递送神经分化信号和支撑引导神经再生的优良载体。中枢系统中，广泛表达的脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，bdnf）是一种具有神经营养作用的蛋白质，具有促进神经细胞生存，增加突触可塑性及神经发生的功能。但是，天然神经纤维作为高亲水性软组织，plla的疏水特性可能限制了细胞的生物学作用。水凝胶具有良好的亲水性，不仅能维持细胞生理功能，而且在调节巨噬细胞炎症方面具有潜在研究价值。其中gelma水凝胶含有rgd和mmp序列，具有亲和细胞表面整合素受体，通过膜“外—内”生物信息传递模式影响细胞作用，为修饰plla支架提供了新策略。更有研究显示此模式可促进巨噬细胞表达抗炎亚型，但具体机制尚不明确。此外，损伤部位由于原发机械性和继发生化性链式共同作用，导致原位内源神经干细胞坏死以及缺乏募集系统干细胞的生物信号。研究表明sdf-1α可通过sdf-1α/cxc趋化因子受体通路，趋化干细胞随浓度梯度迁移到损伤部位发挥神经修复作用。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术存在的困境，本发明根据天然中枢神经外基质特点以及急性脊髓损伤微环境炎症导致缺乏内源性nscs的病理学特征，受建筑学“钢筋砼”结构启发，构建了一种具有免疫调节和神经修复功能的仿生纤维支架，以满足抑制脊髓损伤急性炎症和持续神经再生的特定需求。通过水凝胶酰胺键涂层微溶胶静电纺丝技术，“砼”层gelma水凝胶携载sdf-1α的高亲水性和溶胀释放特性，激活巨噬细胞“外至内”干预模式，诱导巨噬细胞和小胶质细胞m2极化和抗炎因子分泌，降低脊髓损伤局部炎症反应，促进血管萌发新生，实现快速调节急性期免疫炎症和提高内源性神经干细胞归巢，为后期神经修复提供良好环境。“钢筋”层核壳结构持续释放bdnf，促进归巢内源性神经干细胞成神经元分化，达到神经功能恢复的目标。此外，我们在体外通过理化方法多角度探讨了仿生复合纤维的结构特性，sdf-1α和bdnf的负载效率以及对巨噬细胞和神经干细胞生物学效应的调控作用。高亲水性调控免疫反应与程序性释放sdf-1α、bdnf促进神经功能恢复的协同效应在将复合混凝纤维植入大鼠脊髓半切模型得到验证，证明该复合纤维是一种具有吸引力于抗炎——修复协作式治疗脊髓损伤的新策略。

2、为了实现上述目的，具体的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明第一个方面公开了一种静电纺丝纤维ms@g/s的制备方法，包括：

4、s1：制备含有bdnf的微溶胶粒子的水-油乳液后，然后再加入pla和dmf，得到微溶胶纺丝液；

5、s2：利用s1得到的微溶胶纺织液制备微溶胶静电纺丝定向纤维；

6、s3：将s2得到的微溶胶静电纺丝定向纤维浸泡在含有sdf-1a的gelma溶液中，反应过夜后使用紫外照射，得到静电纺丝纤维ms@g/s。

7、优选的，在s1中，包括：

8、s11：制备ha溶液；

9、s12：将bdnf重悬于牛血清白蛋白中得到bdnf溶液，将bdnf溶液与ha溶液混合后得到ha -bdnf水溶胶；

10、s13：将span80和dcm添加到ha -bdnf水溶胶中得到含有bdnf的微溶胶粒子的水-油乳液；s14：在含有bdnf的微溶胶粒子的水-油乳液中加入pla和dmf后得到微溶胶纺丝液。

11、更优选的，在s12中，所述bdnf溶液与ha溶液的体积比为（0.5-1）：（2-6）。

12、优选的，在s2中，包括：

13、将s1得到的微溶胶纺织液装入注射器中，针端用金属夹固定，金属夹连接直流高压电源，在推进泵转速为70-90μl/min、电压为10-20 kv、针尖与平行电极接收器距离为15-30 cm的条件下进行静电纺丝，得到微溶胶静电纺丝定向纤维。

14、优选的，在s3中，包括

15、s31：制备碱性溶液；

16、s32：将微溶胶静电纺丝定向纤维置于s1制备得到的碱性溶液中20-40秒，然后用水洗涤；

17、s33：将微溶胶静电纺丝浸泡在包含有edc、nhs和mes缓冲液的混合溶液，在35-39℃下静置10-30分钟后，弃上清；

18、s34：将50-70%取代度的gelma和含有光引发剂的去离子水配置成5-15%浓度的gelma溶液，然后加入sdf-1a，得到含有sdf-1a的gelma溶液；

19、s35：将s33得到的微溶胶静电纺丝浸泡在含有sdf-1a的gelma溶液中，在35-39℃中反应过夜，然后将微溶胶静电电纺丝取出，使用紫外照射后得到静电纺丝纤维ms@g/s。

20、更优选的，所述含有sdf-1a的gelma溶液中sdf-1a的浓度为100-300μg/ml。在本发明的一些具体实施例中，所述sdf-1a的浓度为200μg/ml。

21、本发明第二个方公开了上述的方法制备得到的静电纺丝纤维ms@g/s。

22、本发明第三个方面公开了一种促神经再生的材料，所述促神经再生的材料包括上述的静电纺丝纤维ms@g/s。

23、本发明第四个方面公开了上述的方法或上述的静电纺丝纤维ms@g/s在促神经再生领域中的应用。

24、优选的，所述应用为在级联调控脊髓微环境促神经再生领域中的应用。

25、在本发明的一些优选实施例中，包括：

26、首先制备1 wt%的透明质酸钠纯溶胶（将0.1 g ha溶于9.9 g去离子水中，室温下旋转至完全溶解）。将大鼠bdnf (peprotech，usa)重悬于0.1% wt%牛血清白蛋白bsa中，最终浓度为100μg/ml。混合10μl bdnf与50μl ha得到ha -bdnf水溶胶，0.01gspan80和4gdcm添加到ha -bdnf水溶胶中，混合和高速搅拌30分钟，在室温下获得均匀稳定的含有bdnf微溶胶粒子的水-油乳液。在含有bdnf微溶胶粒子的水-油乳液中加入0.5 g plla和2 g dmf，最终得到微溶胶(ms)纺丝液。

27、将上述微溶胶(ms)纺丝液装入长度为10 cm、内针直径为0.9 mm的注射器中，注射器体积为10ml，针端用金属夹固定，金属夹连接直流高压电源(天津东文高压电源有限公司，中国)，在推进泵转速为80 μl/min、电压为15 kv、针尖与平行电极接收器距离为20 cm的条件下进行静电纺丝。平行定向的纤维支架可以在电极棒之间收集。为了去除残余的溶剂从得到的纤维，将制备的纤维支架在真空下干燥一夜，得到微溶胶静电纺丝定向纤维（ms）。

28、先将25ml 0.25m naoh溶液与等量乙醇混合，配制成碱性溶液。将微溶胶静电纺丝定向纤维置于碱性溶液中30秒，然后用去离子水洗涤3次。接着将微溶胶静电纺丝定向纤维浸泡在包含有40mg edc、60mg nhs和5ml mes (ph 15 = 6.0)缓冲液的混合溶液中。37℃静置15分钟后，弃上清。将60%取代度的gelma和含有光引发剂的去离子水配置成10%浓度的gelma溶液，然后直接加入sdf-1a（peprotech，usa），使其浓度为200μg/ml。然后将处理好的微溶胶静电纺丝定向纤维浸泡在含有sdf-1a的gelma溶液中，在37℃中反应过夜，最后将微溶胶静电纺丝定向纤维取出，使用紫外照射(365 nm, 6.9 mw·cm−2)，使覆盖在电纺丝表面的gelma光交联，然后冷冻干燥保存，得到静电纺丝纤维ms@g/s。

29、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

30、本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：

31、本发明构建了一种具有免疫调节和神经修复功能的仿生纤维支架，以满足抑制脊髓损伤急性炎症和持续神经再生的特定需求。通过水凝胶酰胺键涂层微溶胶静电纺丝技术，“砼”层gelma水凝胶携载sdf-1α的高亲水性和溶胀释放特性，激活巨噬细胞“外至内”干预模式，诱导巨噬细胞和小胶质细胞m2极化和抗炎因子分泌，降低脊髓损伤局部炎症反应，促进血管萌发新生，实现快速调节急性期免疫炎症和提高内源性神经干细胞归巢，为后期神经修复提供良好环境。

32、并且，在体外通过理化方法多角度探讨了仿生复合纤维的结构特性，sdf-1α和bdnf的负载效率以及对巨噬细胞和神经干细胞生物学效应的调控作用。高亲水性调控免疫反应与程序性释放sdf-1α、bdnf促进神经功能恢复的协同效应在将复合混凝纤维植入大鼠脊髓半切模型得到验证，给脊髓损伤患者带来了福音。