基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物技术与制药工程技术领域，尤其涉及一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肠道是机体的重要屏障，也是最容易发生感染的地方，导致肠道感染的有细菌感染、真菌感染或蠕虫感染等不同感染类型，其中，mdr细菌病原体引起的病毒性肠道感染正变得越来越严重，所以，mdr细菌病原体引起的病毒性肠道感染是亟需解决的重大问题。
3.抗菌药物一直是控制和治疗微生物感染的首选手段，在保护人类和动物健康方面发挥举足轻重的作用。由于抗菌药物的广泛和不合理使用，加速了细菌耐药性的出现、流行和快速传播，致使许多临床抗菌药物在使用过程中逐渐表现出治疗效率降低甚至无效。再加上多药耐药频繁的被发现，例如大肠杆菌中的ndm-1和mcr-1，革兰氏阴性菌的抗菌药耐药性更为严重，对全球公共卫生安全构成严重威胁。据估计，到2050年，耐药性细菌每年将导致1000万人死亡和100万亿美元的经济损失。因此，如何合理使用抗菌药物、提升其治疗治疗效果、延长现有抗菌药物的使用寿命，以及突破溶解度差的抗菌药物在口服给药中疗效受到的限制仍待解决。
4.几十年来，各种合成纳米颗粒递送系统已经出现并被用于改善抗菌药物的药代动力学和药效学特征。当由递送系统携带时，抗菌药物的清除和组织分布特征主要受载体特性而非抗菌药物分子的理化性质的影响。因此，合成药物递送系统已被开发用于提高药物疗效和治疗指数，同时最大限度地减少药物毒性和脱靶副作用。脂质体、胶束、树枝状聚合物、纳米胶囊和纳米海绵等是合成药物递送系统中最突出的例子。尽管这些载体为抗菌药物递送提供了优势，但在临床转化过程中仍存在许多障碍。例如，载体的安全性、稳定性等一直是制约其发展的重要因素。
5.近年来，生物或仿生药物载体领域迅猛发展。细胞外囊泡是细胞衍生的膜结构，能够将各种活性生物分子从生产细胞运输到受体细胞，从而改变受体细胞的生理机能。这种能力引起了人们对用于治疗应用的细胞外囊泡的极大关注，并作为一种抗菌药物的潜在载体。但是，由于细胞外囊泡的产率低、稳定性差，不利于用于治疗病毒性肠道感染或其他肠道疾病的难溶性药物的口服递送，且现有递送载体在食品保鲜领域受安全性不明的困扰，极大限制其在食品保鲜领域的应用。
6.为此，本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体及其制备方法和应用。


技术实现要素：

7.为了解决上述现有技术中的不足，本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体及其制备方法和应用。
8.本发明的一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体及其制备方法和应用是通过
以下技术方案实现的：
9.本发明的第一个目的是提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，包括载体以及水不溶性药物，所述水不溶性药物装载于所述载体的内部；
10.其中，所述载体的表面装载有功能化分子的牛奶外泌体，所述功能化分子为磷脂酰丝氨酸、能够实现巨噬细胞靶向的分子、以及提升牛奶外泌体靶向性及稳定性的分子或聚合物中任意一种；
11.所述水不溶性药物为抗菌药物、抗肿瘤药物和基因药物中任意一种。
12.进一步地，所述水不溶性药物为α-倒捻子素。
13.进一步地，所述能够实现巨噬细胞靶向的分子为半乳糖、乳糖、甘露糖和叶酸中任意一种。
14.进一步地，所述提升牛奶外泌体靶向性及稳定性的分子或聚合物为胆固醇或聚乙二醇peg。
15.进一步地，当所述装载有功能化分子的牛奶外泌体中还含有标志性蛋白；
16.所述标志性蛋白为tsg101、flotillin-1、cd63、cd81、alix、hsp60中任意一种。
17.进一步地，所述载体的粒径为35～1000nm。
18.本发明的第二个目的是提供一种上述功能化载药外泌体的制备方法，包括以下步骤：
19.步骤1，将水不溶性药物装载于牛奶外泌体的内部，获得载药外泌体；
20.步骤2，将功能化分子装载于所述载药外泌体的表面，获得功能化载药外泌体；
21.其中，所述功能化分子为磷脂酰丝氨酸、能够实现巨噬细胞靶向的分子、以及提升牛奶外泌体靶向性及稳定性的分子或聚合物中任意一种。
22.进一步地，步骤1中，所述装载方式为共孵育、电穿孔、超声处理、共挤出和反复冻融中任意一种。
23.进一步地，所述牛奶外泌体由牛奶中分离获得，且所述分离方式为超速离心技术、尺寸排阻色谱技术、密度梯度离心技术和免疫分离技术中的任意一种或多种。
24.本发明的第三个目的是提供一种上述功能化载药外泌体在作为药物递送系统中的应用。
25.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
26.本发明以牛奶中含量丰富的牛奶外泌体为载体，牛奶外泌体具有囊泡结构，从而能够实现将水不溶性药物装载于所述牛奶外泌体的内部，获得载药外泌体，以显著提高水不溶性药物的溶液稳定性；再通过磷脂酰丝氨酸、半乳糖、乳糖、甘露糖和叶酸等功能化分子对载药外泌体进行功能化处理，获得靶向功能化载药外泌体，从而使其对巨噬细胞具有显著靶向性，通过本发明的方式形成药物递送体系，能够有效提升抗细菌感染疗效。
27.且本发明获得的功能化载药外泌体对肠道黏液具有良好的穿透能力，且对治疗产气荚膜梭菌引起的肠道坏死性肠炎具有良好保护效果。进一步可以通过胆固醇、聚乙二醇修饰提升稳定性和肠道黏液渗透性，进而提升疗效。
28.本发明的功能化载药外泌体可以提高口服给药的胃肠道稳定性、提升抗细菌病原体疗效；牛奶外泌体来源于牛奶，安全性极高，保障食品安全和抗菌有效性；拓展了牛奶外泌体在抗肠道细菌感染和食品保鲜领域的应用范围，牛奶中的外泌体含量十分丰富，便于
大规模制备，具有重要的应用价值。
附图说明
29.图1为分离牛奶外泌体exo的粒径分布，其中，曲线ulc为超速离心法分离获得的牛奶外泌体exo的粒径分布，曲线sec为尺寸排阻色谱发分离获得的牛奶外泌体exo的粒径分布；
30.图2为分离牛奶外泌体exo的蛋白标志物鉴定结果，其中，曲线ulc为超速离心法分离获得的牛奶外泌体exo的蛋白标志物鉴定结果，曲线sec为尺寸排阻色谱发分离获得的牛奶外泌体exo的蛋白标志物鉴定结果；
31.图3为分离牛奶外泌体exo的透射电镜图像，其中，图3(a)为超速离心法分离获得的牛奶外泌体在500μm尺度下的透射电镜图像，图3(b)为图(a)中方框处在50μm尺度下的透射电镜图像，图3(c)为尺寸排阻色谱法分离获得的牛奶外泌体在500μm尺度下的透射电镜图像，图3(d)为图(c)中方框处在50μm尺度下的透射电镜图像；
32.图4为α-倒捻子素溶液与载有α-倒捻子素的外泌体的溶液稳定性测试结果，其中，amg为α-倒捻子素组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体组；
33.图5为牛奶外泌体的肠道黏液穿透性试验的测试结果，其中，fitc为硫氰酸荧光素组，exo-fitc为标记硫氰酸荧光素牛奶外泌体组；
34.图6为磷脂酰丝氨酸修饰外泌体清除巨噬细胞中细菌试验的测试结果，其中，pbs为pbs组，mexo为牛奶外泌体治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，ps-aexo为磷酯酰丝氨酸修饰载有α-倒捻子素的外泌体治疗组；
35.图7为载药外泌体aexo治疗vre
fm
cau369引起的小鼠肠道感染的测试结果，其中，图7a为细菌vre在小鼠空肠、回肠、盲肠和结肠中的数量分布；图7b为治疗后小鼠盲肠中细菌vre的数量，其中，pbs为pbs组，lzd为利奈唑胺治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体治疗组；
36.图8为载药外泌体aexo治疗产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎的测试结果，其中，图8a为产气荚膜梭菌在鸡空肠、回肠、盲肠和直肠中的数量分布；图8b为治疗后鸡盲肠中产气荚膜梭菌的数量，其中，pbs为pbs组，exo为牛奶外泌体治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体治疗组。
具体实施方式
37.正如背景技术中所述，本发明为了能够实现口服递送，将用于治疗病毒性肠道感染或其他肠道疾病的难溶性药物递送至肠道内，以治疗各种肠道感染，本发明考虑到牛奶外泌体在牛奶中产量丰富，稳定性高，安全性好，是作为药物递送载体的理想目标，且牛奶外泌体在总脂质中含有43.6mol％的胆固醇，显著增加磷脂双层膜刚性，从而在胃肠道环境中具有高稳定性。且牛奶外泌体具有良好的黏液穿透性，能够穿透化学屏障达到免疫屏障，故本发明以牛奶外泌体为载体，将水不溶性药物装载于牛奶外泌体的内部，能够显著提高水不溶性药物的溶液稳定性，再通过磷脂酰丝氨酸、能够实现巨噬细胞靶向的分子、以及提升载药外泌体的靶向性及稳定性的分子或聚合物中任意一种分子作为功能化分子，通过功能化分子对载药外泌体进行功能化处理，获得靶向功能化载药外泌体，从而使其对巨噬细
胞具有显著靶向性，提升抗细菌感染疗效。且下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
38.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，包括载体以及水不溶性药物，所述水不溶性药物装载于所述载体的内部；且本发明的功能化载药外泌体通过以下制备方法获得：
39.将水不溶性药物装载于牛奶外泌体的内部，获得载药外泌体；再将功能化分子装载于所述载药外泌体的表面，获得功能化载药外泌体；
40.需要说明的是，本发明不限制水不溶性药物和功能化分子的装载顺序，可以先将功能化分子装载于牛奶外泌体的表面后，再将水不溶性药物装载于牛奶外泌体的内部；也可以先将水不溶性药物装载于牛奶外泌体的内部后，再在其表面装载功能化分子，只要能够使牛奶外泌体的内部装载有水不溶性药物，且表面装载有功能化分子，获得具有靶向功能性的载药外泌体即可。
41.且本发明不限制水不溶性药物的具体成分，可以根据实际需求进行选择，比如可选自抗菌药物、抗肿瘤药物和基因药物等。本发明考虑到bcsⅱ和ⅳ类抗菌药物抗肠道感染疗效低的因素，以α-倒捻子素作为水不溶性药物，将其装载于靶向功能化外泌体上，从而能够改善药物的溶解性，提升药物溶解度，进而改善抗菌疗效。
42.且本发明不限制将水不溶性药物装载于牛奶外泌体内部时具体的装载方式，比如采用共孵育、电穿孔、超声处理、共挤出和反复冻融等装载方式均可，只要达到装载药物的目的即可。但本发明考虑到装载简便和效率高的因素，采用孵育技术将α-倒捻子素装载于牛奶外泌体上，获得载药外泌体。
43.本发明不限功能化分子的具体类型或结构，只要能够使载药外泌体靶向功能化即可，比如可选自磷脂酰丝氨酸、能够实现巨噬细胞靶向的分子(比如半乳糖、乳糖、甘露糖和叶酸等)、提升牛奶外泌体靶向性及稳定性的分子或聚合物(比如胆固醇和聚乙二醇)中任意一种，以提升载药外泌体的靶向性，从而不仅能够提升疗效，又可以降低毒副作用。本发明考虑到特异性受体识别介导巨噬细胞靶向的原因，优选的采用磷脂酰丝氨酸作为功能化分子。本发明不限制功能化分子装载于载药外泌体上的具体装载方式，只要能够使载药外泌体靶向功能化即可。本发明考虑到简便、高效的原因，可选的采用共孵育的方式进行装载。
44.本发明考虑到成本和制备便利性的因素，以牛奶为来源，从中分离获得牛奶外泌体，且本发明不限制从牛奶中分离牛奶外泌体的具体分离方式，只要能够分离获得牛奶外泌体即可。本发明牛奶外泌体含有标志性蛋白(标志性蛋白为tsg101、flotillin-1、cd63、cd81、alix、hsp60中任意一种)，存在标志性蛋白，才能证明分离得到的是外泌体，标志性蛋白是鉴定外泌体的技术手段之一。且本发明可选的，可以采用超速离心技术、尺寸排阻色谱技术、密度梯度离心技术和免疫分离技术中的任意一种或多种。具体可采用以下几种方式进行分离获得牛奶外泌体：
45.分离方法一：将牛奶以1000～3000g离心5～20min，除去细胞成球及细胞碎片；收集上清，再以8000～13000g离心10～40min，去除脂肪球和酪蛋白碎片；收集上清，再以60000～100000g离心30～90min，去除大颗粒和微泡；收集上清，再以120000～300000g离心60～240min，收集外泌体颗粒。
46.分离方法二：将牛奶以1000～3000g离心5～20min，除去细胞成球及细胞碎片；收集上清，再以8000～13000g离心10～40min，去除脂肪球和酪蛋白碎片；再用外泌体分离柱35～350nm或70～1000nm规格，柱体积3～100ml，加样体积0.1～10ml，收集外泌体。
47.分离方法三：在室温下向预处理的牛奶中滴加乙酸至ph4.6，搅拌混合5min，然后在4℃下以10，000
×
g离心10min，用0.22μm膜过滤取上清；再用外泌体分离柱35～350nm或70～1000nm规格，柱体积3～100ml，加样体积0.1～10ml，收集外泌体组分。
48.分离方法四：在室温下向预处理的牛奶中加入20～30mm/ledta，搅拌混合5min，然后在4℃下以10，000
×
g离心10min，用0.22μm膜过滤取上清；再用外泌体分离柱35～350nm或70～1000nm规格，柱体积3～100ml，加样体积0.1～10ml，收集外泌体组分。
49.通过上述方法获得的牛奶外泌体的粒径能够达到35～1000nm。
50.实施例1
51.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，且其制备方法如下：
52.s1、制备牛奶外泌体
53.以牛奶为牛奶外泌体源，采用超速离心法分离获得牛奶外泌体，且获得的牛奶外泌体具有囊泡结构；
54.s2、以α-倒捻子素作为水不溶性药物，采用共孵育的方式将其装载于牛奶外泌体的囊泡结构的内部，获得载药外泌体；
55.s3、以磷脂酰丝氨酸作为功能化分子，将其采用共孵育的方式装载于牛奶外泌体的囊泡结构的表面，获得靶向功能化外泌体。
56.实施例2
57.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，且其制备方法与实施例1的区别仅在于：
58.采用尺寸排阻色谱法分离获得牛奶外泌体；
59.以半乳糖作为功能化分子；
60.采用电穿孔法，将α-倒捻子素装载于牛奶外泌体的囊泡结构的内部。
61.实施例3
62.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，，且其制备方法与实施例1的区别仅在于：
63.本实施例中，采用密度梯度离心法分离获得牛奶外泌体；
64.以胆固醇作为功能化分子；
65.采用超声处理法，将α-倒捻子素装载于牛奶外泌体的囊泡结构的内部。
66.实施例4
67.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，，且其制备方法与实施例1的区别仅在于：
68.本实施例中，以甘露糖作为功能化分子。
69.实施例5
70.本发明提供一种基于牛奶外泌体的功能化载药外泌体，且其制备方法与实施例1的区别仅在于：
71.本实施例中，以聚乙二醇peg作为功能化分子。
72.实验部分
73.本发明下述所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂厂商购买所得。以下实验中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
74.一、牛奶外泌体的分离
75.本发明分别采用超速离心法和尺寸排阻色谱法分离外泌体。
76.超速离心法分离外泌体的具体步骤为：
77.首先将新鲜的牛奶在2000g，4℃条件下离心10min，去除死细胞和细胞碎片；取上清液继续在10000g，4℃条件下离心30min，去除脂肪球等杂质；取上清液在100000g，4℃条件下离心60min，去除外囊泡等杂质；取上清液在135000g，4℃条件下离心90min，弃去上清液，沉淀用pbs(ph7.4)吹打重悬，即为牛奶外泌体悬液。
78.尺寸排阻色谱法分离外泌体的具体步骤为：
79.首先将新鲜的牛奶在2000g，4℃条件下离心10min，去除死细胞和细胞碎片；取上清液继续在10000g，4℃条件下离心30min，去除脂肪球等杂质，收集上清液。将外泌体分离柱qev(35-350nm,izon)用pbs冲洗活化10min,再将收集的上清液加入色谱柱，待样品完全进入到色谱柱之后，再加pbs不断冲洗，收集不同组分即可得到外泌体溶液。
80.二、牛奶外泌体性能表征
81.且本发明分别对上述两种分离方法获得的牛奶外泌体的性能进行了以下表征：
82.1)牛奶外泌体粒径浓度测试
83.将两种方法分离的牛奶外泌体进行粒径浓度测试，且测试结果如图1所示，其中，曲线ulc为超速离心法分离获得的牛奶外泌体exo的粒径分布，曲线sec为尺寸排阻色谱发分离获得的牛奶外泌体exo的粒径分布。本发明采用纳米颗粒追踪分析仪测定牛奶外泌体的粒径大小浓度：
84.首先取10μl外泌体重悬液适量稀释，吹打混匀，将稀释后的牛奶外泌体重悬液在室温条件下上机进行检测。测试样品条件：0.3nm-5μm，浓度范围：0.1ppm-40％w/v。
85.由图1可以看出，采用尺寸排阻色谱法分离的牛奶外泌体的粒径大小比超速离心法分离的牛奶外泌体更加均一。可能原因是尺寸排阻色谱法避免了离心力对牛奶外泌体的破坏，更好地保留了牛奶外泌体的完整性，并且按照尺寸大小选择性的洗出色谱柱。
86.2)牛奶外泌体蛋白标志鉴定
87.首先裂解提取牛奶外泌体蛋白，再采用bca法测定提取样品中的蛋白浓度(μg/ml)，且测试结果如图2所示，其中，曲线ulc为超速离心法分离获得的牛奶外泌体exo的蛋白标志物鉴定结果，曲线sec为尺寸排阻色谱发分离获得的牛奶外泌体exo的蛋白标志物鉴定结果。
88.且本发明具体采用以下方法进行鉴定：分别制备分离胶和浓缩胶，将蛋白溶液用蛋白变性buffer补齐至25μl，蛋白变性3-5min，迅速放入低温1min备用。在上样孔中加入蛋白mreker和样品，加入电泳液后先采用低压80v使得样品至分离胶和浓缩胶交界处，再将电压调高至120v。电泳完成后再采用横流湿转进行转膜，取出pvdf膜放入封闭液内，室温封闭1-2h。取出pvdf膜，在tbst缓冲液中漂洗3次再进行抗体孵育，最后采用ecl化学发光液进行曝光。
89.由图2可以看出，采用尺寸排阻色谱法和超速离心法分离的外泌体均带有标志性
蛋白：脂筏标记蛋白flotillin1和escrt复合体相关的蛋白tsg101，表明两种方法均能从牛奶中成功分离牛奶外泌体。
90.3)牛奶外泌体的透射电镜
91.为观察分离获得的牛奶外泌体的结构，本发明分别对上述两种分离方法获得的牛奶外泌体进行了透射电镜测试，测试结果如图3所示。且本发明具体通过以下步骤进行测试：
92.a.吸取20μl牛奶外泌体悬液用pbs进行适度稀释，获得分散性良好的样品，便于后期结构观察；
93.b.用镊子轻轻夹取一个200目铜网之余干净滤纸上；
94.c.吸取10μl稀释后的牛奶外泌体悬液滴于铜网之上，室温静置5min；
95.d.用滤纸轻轻吸去多余的外泌体溶液样品，再在铜网上滴加10μl的1％磷钨酸进行复染制样1min；
96.e.复染处理结束后用滤纸吸去多余磷钨酸，再在铜网上滴加10μl的pbs缓冲液。
97.图3中，图3(a)为超速离心法分离获得的牛奶外泌体在500μm尺度下的透射电镜图像，图3(b)为图(a)中方框处在50μm尺度下的透射电镜图像，图3(c)为尺寸排阻色谱法分离获得的牛奶外泌体在500μm尺度下的透射电镜图像，图3(d)为图(c)中方框处在50μm尺度下的透射电镜图像，且由图3可以看出，采用尺寸排阻色谱法和超速离心法分离的外泌体均为典型囊泡结构，尺寸大小均一。
98.三、牛奶外泌体载药评价
99.1)制备功能化载药外泌体
100.s1、以α-倒捻子素作为水不溶性药物，采用以下共孵育方法将其与牛奶外泌体制成功能化载药外泌体：
101.以乙腈和乙醇按照1:1的体积比的混合溶液为溶剂，将α-倒捻子素置于其中，形成浓度为512μg/ml的α-倒捻子素溶液，随后将α-倒捻子素溶液与外泌体(蛋白浓度2mg/ml)以1:9(v/v)简单混合后进行共孵育，保持最终溶剂浓度≤10％，获得载α-倒捻子素(amg)外泌体。此溶剂浓度的选择对外泌体的质量属性没有显著影响。且具体工艺为：将amg药物溶液与外泌体混合后，室温静置孵育15min，10000g离心10min，以去除未结合药物。为了除去多余的溶剂，收集装载amg药物的外泌体，连续通入氮气挥发有机溶剂，即获得的载药外泌体。
102.s2、然后，将获得的载药外泌体与磷酯酰丝氨酸(10mg/ml)以1:20(v/v)用量共孵育，获得的功能化载药外泌体，并将获得的功能化载药外泌体悬浮在pbs中，通过0.22μm注射器无菌处理，并在-80℃保存。
103.2)稳定性评价
104.a.标准溶液配置：
105.称取α-倒捻子素对照品适量用二甲基亚砜(dmso)溶解，混匀，配制成5000μg/ml的的标准储备液，于4℃冰箱中保存备用。临用前取出用流动相稀释成一定浓度的标准工作液。储备液1个月内可用。
106.b.色谱条件：
107.采用shim-packgistc18色谱柱(4.6
×
250mm,5um)，流动相为乙腈：0.1％磷酸水溶液(90:10,v/v)，检测模式为uv312nm，进样量为20ul，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
108.c.样品处理：
109.将载有α-倒捻子素的功能化载药外泌体和α-倒捻子素水溶液分别在室温静置12h后，取上清后稀释10倍，过0.22μm滤膜后，待上机检测药物浓度，测试结果如图4所示，其中，amg为α-倒捻子素组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体组。
110.且由图4可以看出，纯α-倒捻子素水溶液十分不稳定，上清几乎不含有药物，药物全部沉淀到底部，而将α-倒捻子素载入到牛奶外泌体后，溶液十分稳定，静置12h后，上清中药物浓度几乎不变，说明将α-倒捻子素装载于牛奶外泌体内形成功能化载药外泌体，能够显著提高α-倒捻子素的溶液稳定性。
111.3)外泌体肠道黏液穿透性评价
112.使用体外transwell模型评估牛奶外泌体的黏液转运特性。从猪肠道获得天然肠黏液并在-80℃下冷冻直至使用。
113.transwell规格如下：0.4μm聚碳酸酯膜，大小为0.33cm2表面积，用于分隔上、下隔室。将600μl过滤后的pbs放入下室，并在膜的上侧加入40μl黏液(约0.2mm厚的层)。将牛奶外泌体用fitc进行荧光标记后，在每个孔将15μl标记的牛奶外泌体添加到黏液层的表面，以使黏液不被稀释。然后立即盖住孔板移至37℃轻轻摇晃并在指定的时间内从下室中取出pbs，在多功能酶标仪上测量溶液荧光强度。测量最初添加到黏液中的原始外泌体溶液的荧光强度作为空白对照，其操作流程图如图5中左图所示。
114.测试结果如图5中右图所示，其中，fitc为硫氰酸荧光素组，exo-fitc为标记硫氰酸荧光素牛奶外泌体组，可以看出，牛奶外泌体具有较强的肠道黏液穿透特性。
115.4)功能化外泌体抗菌评价
116.将巨噬细胞以105个/孔铺于24孔板，待细胞贴壁后，以moi＝100攻菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsat44)感染，细菌感染1h后，弃上清再加入药物进行处理，分为4组：pbs处理组，牛奶外泌体处理组，amg处理组(10μg/ml)，以及磷脂酰丝氨酸修饰外泌体处理组(相当于amg10μg/ml)，处理3h后，再用0.1％triton处理1min，吹打裂解细胞后，进行连续10倍稀释，将稀释液均匀涂布于培养皿上，移至37℃培养箱，18h后菌落计数。
117.测试结果如图6所示，其中，pbs为pbs组，mexo为牛奶外泌体治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，ps-aexo为磷酯酰丝氨酸修饰载有α-倒捻子素的外泌体治疗组，且可以看出，磷脂酰丝氨酸修饰牛奶外泌体具有显著增效的抗菌活性。
118.四、载药外泌体治疗抗万古霉素屎肠球菌小鼠肠道感染
119.细菌抗万古霉素屎肠球菌(enterococcusfaeciumcau369)准备：需要灌胃的vre
fm
cau369的数量为5
×
108cfus，灌胃体积为400μl，需要配置细菌母液为1.2
×
109cfus/ml。
120.抗生素配制：0.5g/l的氨苄西林(amp)，给小鼠自由饮水，3天换一次，处理5天，用于破坏肠道菌群。
121.实验操作具体步骤如下：
122.(1)体重为18-20g的icr小鼠，在0.5g/lamp饮水处理五天之后，停药一天，采用5
×
108cfusvre
fm
cau369灌胃一次，每只小鼠灌胃400μl菌液；
123.(2)小鼠感染1h后，分别用pbs、利奈唑胺(lzd8mg/kg)、amg(8mg/kg)、aexo(相当于amg8mg/kg)处理，2d后取小肠内容物。将内容物称重后，加入1ml的pbs缓冲液，剧烈混匀后，
连续十倍稀释，在选择性培养基(叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂)上涂板进行vre计数。
124.测试结果如图7所示，图7为载药外泌体aexo治疗vre
fm
cau369引起的小鼠肠道感染的测试结果，图7a为细菌vre在小鼠空肠(jejunum)、回肠(lleum)、盲肠(cecum)和结肠(colon)中的数量分布；图7b为治疗后小鼠盲肠中细菌vre的数量，其中，pbs为pbs组，lzd为利奈唑胺治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体治疗组；且从图7中可以看出，vre
fm
cau369主要分布在小鼠的盲肠和结肠位置，载药外泌体能够显著降低小鼠盲肠和结肠内的细菌数量。
125.五、载药外泌体治疗魏氏梭菌引起鸡坏死性肠炎
126.细菌魏氏梭菌(clostridiumperfringens)准备：需要灌胃c.perfringens的数量为1
×
109cfus，灌胃体积为0.2ml，需要配置细菌母液为5
×
109cfus/ml。
127.抗生素配制：0.5g/l的氨苄西林，链霉素1g/l，给小鸡自由饮水处理3天，用于破坏肠道菌群。
128.实验操作具体步骤如下：
129.实验鸡为12日龄，分为四组。鸡可以连续三天自由获得含有0.5g/l氨苄西林和1g/l链霉素的饮用水。给鸡喂食新鲜无菌水1d，然后通过口服产气荚膜梭菌c.perfringens(1
×
109cfus，200μl)感染。实验处理在感染后1h进行，分为四组，pbs、牛奶外泌体、amg(8mg/kg)、aexo(相当于amg8mg/kg)处理，治疗2d后检测肠道(空肠、回肠、盲肠、直肠)中的细菌数量。为了获得单细胞悬液，将收集的肠样品称重并在1ml无菌pbs中匀浆。通过在产气荚膜梭菌选择性平板上接种悬浮液的连续稀释液并均匀涂布，在37℃、厌氧条件下培养18h后进行细菌菌落定量。测试结果如图8所示，图8为载药外泌体aexo治疗产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎的测试结果，图8a表示产气荚膜梭菌在鸡空肠(jejunum)、回肠(lleum)、盲肠(cecum)和直肠(rectum)中的数量分布；图8b为治疗后鸡盲肠中产气荚膜梭菌的数量，其中，pbs为pbs组，exo为牛奶外泌体治疗组，amg为α-倒捻子素治疗组，aexo为载有α-倒捻子素的外泌体治疗组。由图8可以看出，产气荚膜梭菌c.perfringens主要分布在鸡肠道的盲肠和直肠位置，且本发明获得的功能载药外泌体能够显著降低鸡盲肠内的细菌数量。
130.显然，上述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。