冠状病毒疫苗的制作方法

背景技术：

0、背景

1、2021年11月sars-cov-2 omicron关注变体(voc)的出现(参考文献1)可被视为covid-19大流行的转折点，这是由于其基本上逃逸之前建立的免疫的能力。omicron ba.1(其在数周内取代delta成为占主导地位的循环voc)在受体结合结构域(rbd)和n-末端结构域(ntd)中获得了显著改变(参考文献2)。这些变化导致由中和抗体识别的许多表位的丧失(参考文献3-4)，以及由基于祖先mn908947毒株的疫苗或暴露于祖先株或之前变体诱发的体液免疫严重受损(参考文献5-7)。ba.1随后被ba.2变体取代，所述ba.2变体进而产生进一步亚系。ba.4和ba.5(其源自ba.2)目前在全球许多国家成为占主导地位的变体，多项研究表明，与ba.2相比并且尤其是与ba.1相比，其抗原性质发生了显著变化(参考文献8-9)。由于ba.4和ba.5共享同一的s糖蛋白序列，所以它们在本文称为ba.4/5。尽管rbd中的许多氨基酸变化在omicron亚系之间共享，但ba.2来源的亚系(包括ba.4/5)的ntd内的改变与ba.1中发现的那些大多不同(图33)。

2、世界上绝大多数人已经用mn908947毒株适应性疫苗(包括，例如，诸如bnt162b2和mrna-1273的mrna疫苗(参考文献10)进行了免疫，其因此基本上塑造了sars-cov-2群体免疫。然而，免疫逃逸变体omicron ba.1的出现导致疫苗接种个体中突破性感染的发生急剧增加。据报道，sars-cov-2变体突破性感染可重塑体液免疫，从而调节针对其他变体的中和抗体滴定度(文献8、11、12)。然而，如之前报道的，ba.1突破性感染可能不提供针对omicronba.4/5的强免疫力。

3、某些发现

4、为了确定ba.2突破性感染是否将重新聚焦针对omicron ba.2和ba.2来源的亚系(如ba.4/5)的免疫，研究了来自在2022年三月与五月之间(在此期间，ba.2谱系在德国占主导地位(全部vax+omi ba.2))接受了mrna疫苗的三重疫苗接种方案(bnt162b2/mrna-1273)并随后经历了sars-cov-2突破性感染的个体的样本中的中和抗体反应的大小和广度。此类发现对正在进行的疫苗设计工作具有重要意义，因为遏制covid-19大流行需要产生持久且足够广泛的免疫力，以提供针对当前和未来sars-cov-2变体的保护。

5、根据quandt等人(参考文献12)中之前公开的数据生成了两个参考群组，包括(i)在样本采集时没有之前或突破sars-cov-2感染的用bnt162b2三重疫苗接种的个体(bnt162b23)，和(ii)用mrna疫苗三重疫苗接种的具有在omicron ba.1占主导地位(全部vax+omi ba.1)期间的随后突破性感染的个体。

6、在用基于mrna的covid-19疫苗(bnt162b2、mrna-1273或包含两种疫苗的异源方案；全部vax+omi ba.1，全部vax+omi ba.2))三重疫苗接种后，sars-cov-2 omicron ba.1和ba.2的突破性感染分别在大约4个月或3周的中位数发生(图29)。用于表征血清中和活性的免疫血清对于bnt162b23群组在疫苗接种后的28天中位数采集，在ba接种后的43天采集对于全部vax+omi ba.1群组在ba.1突破后43天中位数采集，并且对于全部vax+omi ba.2群组在ba.2突破性感染后39天中位数采集。群组的中位数年龄相似(32-38岁)。对于本研究，ba.2.12.1中和数据是从来自群组bnt162b3和全部vax+om ba.1的血清样本产生的。

7、为了评价免疫血清的中和活性，使用了例如，如在参考文献13、14中所述的假病毒中和试验(pvnt)。采用携带sars-cov-2mn908947、alpha、beta、delta、omicron ba.1、ba.2、ba.2.12.1以及新出现的omicron亚系ba.4和ba.5的s糖蛋白的假病毒以评估中和广度。由于ba.4和ba.5共享同一的s糖蛋白序列，包括关键改变l452r和f486v，所以它们在本文称为ba.4/5。此外，对sars-cov(本文称为sars-cov-1；参考文献15)进行测定，以检测潜在泛沙贝病毒中和活性。

8、如参考文献12中之前报道的，针对来自未感染sars-cov-2的三重疫苗接种个体的免疫血清的omicron ba.1和ba.2的50％假病毒中和(pvn50)几何平均滴定度(gmt)与mn908947毒株相比显著降低(gmt 160和221对398)。针对ba.2.12.1和ba.4/5的中和活性甚至进一步降低(gmt 111和74)，与mn908947毒株相比针对ba.4/5的滴定度低5.4倍(图30(a))。

9、与未感染sars-cov-2的三重疫苗接种免疫血清相比，omicron ba.2突破性感染显著增加了针对ba.2和ba.2.12.1的pvn50 gmt，使得突破性感染后ba.2的中和作用与mn908947毒株相当(图31(b-c))。类似地，ba.1突破性感染孵育针对ba.1的强效中和活性(图30(b)，图31(a)。重要的是，尽管ba.2恢复期血清中针对ba.4/5的pvn50 gmt低于针对mn908947毒株(gmt 391对922，即降低2.4倍)，但这种降低仍低于在未感染omicron的bnt162b23群组中观察到的，后者的血清显示ba.4/5中和活性降低5.4倍(图31(c))。相比之下，ba.1突破性感染后针对ba.4/5和mn908947的pvn50 gmt分别为266和1327(即，降低5倍；图30(b))。因此，与三重疫苗接种的未感染omicron的个体相比，三重疫苗接种个体的omicron ba.1突破性感染并未导致omicron ba.4/5的更有效交叉中和。在两个群组中，针对ba.4/5的中和滴定度与针对mn908947所观察到的相比更接近于针对系统发育上更远缘的sars-cov-1观察到的低水平(图30)。值得注意的是，ba.1突破性感染后针对mn908947毒株的pvn50 gmt略高于针对ba.2突破性感染所观察到的那些(gmt 1327对922)，不希望受特定理论约束，这可能与第三次疫苗接种与感染之间的较长间隔有关(对于ba.1中位数22天对比对于ba.2中位数127.5天)(图31)。

10、进行单独分析，仅包括用bnt162b2三重疫苗接种的个体(具有ba.2或ba.1突破性感染，或未感染omicron)。在这些分析中，取得了关于ba.4/5中和活性的类似观察结果：ba.2恢复期血清中针对ba.4/5的pvn50 gmt比针对mn908947毒株低2.4倍，而在ba.1突破性感染后降低是6倍(图31)。尽管ba.2和ba.2.12.1的相对中和作用在ba.2和ba.1恢复期血清中相当，但针对这些变体的中和活性仍略高于在未感染omicron的血清中所观察到的中和活性。

11、来自三重疫苗接种的未感染omicron的个体的免疫血清针对祖先sars-cov-2 voc具有广泛中和活性。针对beta的中和活性在ba.1恢复期血清中略微更高，而alpha和delta的中和活性不受ba.1或ba.2突破性感染的影响(图31(c))。

12、总的来说，这些数据证明，接种过疫苗的个体的omicron ba.2突破性感染介导针对ba.1、ba.2、ba.2.12.1和几种祖先sars-cov-2变体的广泛中和活性。此外，针对ba.4/5的中和活性虽然低于针对mn908947参考的中和活性，但与ba.1恢复期血清中相比达到更大程度。

13、最近的研究已经证明，用mrna疫苗(bnt162b2或mrna-1273)疫苗接种的个体中的omicron ba.1突破性感染不仅加强针对祖先mn908947毒株的血清中和滴定度，而且加强针对包括ba.2在内的voc的中和滴定度(参考文献8、11、12)。这种效应在三重疫苗接种的个体中观察到，但在两重疫苗接种的个体中尤其明显，两重疫苗接种的个体的血清含有很少或没有针对ba.2的中和活性。然而，ba.1突破性感染并未诱发针对ba.4/5的强中和活性，ba.4/5是目前在世界范围内占主导地位的voc。不希望受特定理论约束，这种免疫逃逸被归因于先前存在的中和抗体反应的扩增和/或回忆，所述中和抗体反应识别omicron亚系ba.2.12.1、ba.4和ba.5中不存在的表位。

14、本实施例尤其提供以下见解：ba.2突破性感染触发回忆反应，所述回忆反应介导ba.2来源的亚系(包括ba.4/5)的增强中和作用，从而表明与更远缘的ba.1变体的突破性感染相比，ba.2、ba.2.12.1和ba.4/5之间的更高s蛋白序列相似性驱动更有效的交叉中和作用。尽管用当前批准的mn908947来源的疫苗(如bnt162b2)疫苗接种的重要性，所述疫苗提供有效保护免于当前voc(包括omicron ba.1和ba.2)引起的严重疾病，但在ba.2突破性感染后针对当前voc(包括ba.4/5)的广泛交叉中和活性的本发明发现尤其提供以下见解：即适应于mn908947毒株序列或来自如上所述的相同免疫相关类别(例如，alpha株、beta株、delta株、omicron ba.1)的变体序列的疫苗与适应于ba.2变体序列或来自如上所述的相同免疫相关类别(例如，omicron ba.2.12.1，omicron ba.4/ba.5)的变体序列的疫苗的组合可提供针对来自两种不同类别的变体的增强交叉中和活性。在一些实施方案中，本实施例提供的证据支持实施以季节性流感疫苗为模型的许可程序，所述许可程序使用最新流行病学数据来选择covid-19疫苗株。在一些实施方案中，本实施例进一步提供的证据支持为covid-19疫苗的季节性更新建立快速株选择，类似于世界卫生组织(who)全球流感监测和反应系统(gisrs)所实施的选择过程，和/或关于基于替代免疫原性终点的加速批准途径的协议。

15、来自针对sars-cov-2进行疫苗接种并且具有ba.1或ba.2突破性感染的受试者的中和滴定度分别在图31(a)和(b)中示出，并且两组受试者的gmr在图31(c)中示出。如图31(a)和(b)所示，来自之前针对sars-cov-2疫苗接种且具有ba.1或ba.2的突破性感染的受试者的血清被发现针对假病毒具有显著中和滴定度，所述假病毒包含mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白、alpha变体、beta变体、delta变体和omicron ba.1变体。如前所述，针对ba.2的中和滴定度在来自ba.1突破患者的血清中略低(gmt对于ba.2为875对比对于mn908947毒株为1327)，并且针对ba.2.12.1和ba.4/5的中和滴定度更低(gmt分别为584和266，相比之下对于mn908947毒株为1327)。ba.2突破患者与ba.1突破患者针对sars-cov-2mn908947毒株、alpha变体、beta变体和delta变体显示类似的中和反应。针对omicron ba.1的中和反应在ba.1突破患者中略高于ba.2突破患者(gmr为0.76相比于0.60)，而针对omicron ba.2的中和滴定度在ba.2突破患者高于ba.1突破患者(gmr为0.94对比0.66)。然而，出人意料地，针对ba.4/5的中和反应在ba.2突破患者中显著更高(在ba.2突破患者中gmr为0.39，相比之下在ba.1突破受试者中gmr为0.2)。因此，本公开因此证明，在针对sars-cov-2疫苗接种的受试者中与ba.1突破性感染相比，ba.2突破性感染可引发更广泛的免疫反应，并且教导，施用包含编码包含ba.2 omicron变体所特有的突变的s蛋白的rna的加强疫苗可实现令人惊讶和出人意料的益处。

16、此外，本公开提供以下见解：即鉴于ba.2和ba.4/5变体的s蛋白序列之间的相似性，将包含或递送ba.4和/或ba.5变体刺突序列的疫苗接种剂量与包含或递送mn908947刺突序列的疫苗接种剂量组合也可实现特别广泛的免疫(即，如本文所述的协同免疫)。

17、在一些实施方案中，这些发现表明，可例如在一些实施方案中根基于冠状病毒株和/或变体序列的s糖蛋白中的共享氨基酸改变来定义冠状病毒株和/或变体序列(例如，sars-cov-2株和/或变体序列的协同类别)。例如，尽管s蛋白的rbd中的许多氨基酸变化在omicron亚系(例如，ba.1、ba.2、ba.2.12.1和ba.4/5)之间共享，但ba.2和ba.2来源的亚系(包括ba.4/5)的ntd内的改变与ba.1中发现的那些大多不同。因此，在一些实施方案中，可基于与s蛋白的ntd内存在的共享氨基酸突变的程度来定义冠状病毒株和/或变体序列(例如，sars-cov-2株和/或变体序列)的协同类别。例如，在两个sars-cov-2株和/或变体序列共享至少50％(包括例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多)的在s蛋白的ntd中存在的氨基酸突变的一些实施方案中，可将sars-cov-2株和变体序列两者分组到同一类别中。在两个sars-cov-2株和/或变体序列共享不超过50％(包括不超过45％、不超过40％、不超过30％或更低)的在s蛋白的ntd中存在的氨基酸突变的一些实施方案中，可将sars-cov-2株和变体序列两者分组到不同的类别中。本发明的发现尤其提供以下见解：即使受试者(例如，通过感染和/或疫苗接种)暴露于至少两种具有不同协同作用类别的抗原(例如，如下表所示)可产生更强效的免疫反应(例如，扩大针对不同变体的交叉中和谱和/或产生不容易发生免疫逃逸的免疫反应)。

18、 类别i 类别ii mn908947毒株 omicron ba.2 alpha变体 omicron ba.2.11.2 beta变体 omicron ba.4 delta变体 omicron ba.5 omicron ba.1 源自上述中任一者的亚系 源自上述中任一者的亚系  

19、例如，在一些实施方案中，可向没有之前感染的未接种疫苗的受试者可施用疫苗的组合，所述疫苗中的至少两种各自适应于具有不同协同作用类别的sars-cov-2株(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，组合中的此类疫苗可在不同时间施用，例如，在一些实施方案中，作为间隔预先确定的时间段施用的第一剂量和第二剂量(例如，根据如本文所述的某些给药方案)。在一些实施方案中，组合中的此类疫苗可作为多价疫苗施用。在一些实施方案中，可向感染或疫苗接种一种类别的sars-cov-2株的受试者施用适应于不同类别的sars-cov-2株的疫苗(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，这种疫苗可以是基于多肽或基于rna的疫苗。

20、虽然本发明的发现是基于对源自不同研究的样本的回顾性分析，使用相对小的样本量和在免疫间隔和人口统计学特征(如个体的年龄和性别)方面不完全一致的群组，但本发明的发现为疫苗设计和疫苗接种策略提供有用的见解，以改善针对更广谱sars-cov-2变体的交叉中和作用。

21、在一些实施方案中，疫苗可包含多肽(例如，非天然多肽，例如嵌合多肽)，所述多肽包含为一种或多种不同sars-cov-2变体所特有的一个或多个突变；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽(例如，非天然多肽，例如嵌合多肽)，所述多肽包含为第一sars-cov-2变体所特有的一个或多个突变和为第二sars-cov-2变体所特有的一个或多个突变；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，第一sars-cov-2变体可以是来自上表的类别i的sars-cov-2株/变体，而第二sars-cov-2变体可以是来自上表的类别ii的sars-cov-2株/变体。例如，在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为第一sars-cov-2变体所特有的一个或多个突变的rbd和含有为第二sars-cov-2变体所特有的一个或多个突变的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。

22、在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和含有为第二sars-cov-2变体(其不是ba.1omicron变体)所特有的一个或多个突变的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含或编码多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和含有为第二sars-cov-2变体(其不是ba.1omicron变体)所特有的一个或多个突变的rbd。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和含有为ba.2omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和含有为ba.4/5omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。

23、在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和含有为第二sars-cov-2变体(其不是ba.1omicron变体)所特有的一个或多个突变的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和含有为第二sars-cov-2变体(其不是ba.1omicron变体)所特有的一个或多个突变的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和含有为ba.2omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含为ba.1omicron变体的ntd所特有的一个或多个突变和含有为ba.4/5omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。

24、在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和mn908947s蛋白的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.2omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和mn908947s蛋白的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.4/5omicron变体所特有的一个或多个突变的rbd和mn908947s蛋白的ntd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。

25、在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和mn908947s蛋白的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.2omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和mn908947s蛋白的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。在一些实施方案中，疫苗可包含多肽，所述多肽包含含有为ba.4/5omicron变体所特有的一个或多个突变的ntd和mn908947s蛋白的rbd；或编码所述多肽的核酸(例如，在一些实施方案中为rna)。

26、材料和方法

27、参与者的募集和样本采集

28、来自未感染sars-cov-2的bnt162b2三重疫苗接种(bnt162b23)群组的个体提供了知情同意书作为他们参与2期试验bnt162-17(nct05004181)的一部分。具有omicron ba.1或ba.2突破性感染的个体(全部vax+omi ba.1和全部vax+omi ba.2群组)进行三重疫苗接种，例如使用一个或多个剂量的bnt162b2、modema mrna-1273、astrazeneca chadox1-s重组疫苗或它们的组合，并被募集以提供研究的血液样本和临床数据。omicron感染在2021年11月与2022年1月中旬之间(全部vax+omi ba.1)或2022年3月与2022年5月之间(在亚系ba.1和ba.2分别占主导地位时)通过变体特异性pcr证实(参考文献24)。本研究中某些参与者(例如，至少7名参与者)的感染进一步通过基因组测序进行表征，并且基因组测序证实了omicron ba.1或ba.2感染。

29、参与者在采血时没有症状。表26是针对中和抗体反应进行分析的疫苗接种个体的特征的总结。所有参与者在疫苗接种前均无记录的sars-cov-2感染史。

30、表26

31、

32、n/a：不适用；n/a，不可获得；d，剂量；yrs，岁；n，数目。

33、*，募集时呈阴性sars-cov-2pcr试验#，没有之前sars-cov-2感染迹象(基于covid-19症状/体征和sars-cov-2pcr试验)

34、作为政府疫苗接种计划的一部分，参与者接受了bnt162b2疫苗的初始2剂量系列，并且剂量之间的间隔没有记录

35、omicron ba.1感染在募集至研究性研究时证实

36、通过在2000x g下将抽取的血液离心10分钟来分离出血清，并冷冻保存直至使用。

37、vsv-sars-cov-2s变体假病毒产生

38、根据公开的假型化方案(参考文献49)用sars-cov-1s糖蛋白(uniprot参考：p59594)和用源自以下各项的sars-cov-2s糖蛋白对编码绿色荧光蛋白(gfp)和荧光素酶而不是vsv-糖蛋白(vsv-g)的重组复制缺陷型水疱性口炎病毒(vsv)载体进行假型化：mn908947参考株(ncbi参考：43740568)、alpha变体(改变：δ69/70、δ144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h)、beta变体(改变：l18f、d80a、d215g、δ242-244、r246i、k417n、e484k、n501y、d614g、a701v)、delta变体(改变：t19r、g142d、e156g、δ157/158、k417n、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n)、omicron ba.1变体(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f)、omicron ba.2变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)、omicron ba.2.12.1变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452q、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、s704l、n764k、d796y、q954h、n969k)或omicron ba.4/5变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)。

39、sars-cov-2s糖蛋白改变的图解示于图62中，并且omicron亚系中s糖蛋白改变的单独比对展示于图60中。简言之，将在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs[sigma-aldrich])的杜氏改良伊氏培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium；dmem)加上glutamaxtm(gibco)(称为培养基)中培养的hek293t/17单层(crl-11268tm)按照制造商的说明书用桑格测序验证的sars-cov-1或变体特异性sars-cov-2s表达质粒加上lipofectamineltx(life technologies)转染。在24小时，vsv-g补充型vsvδg载体。在37℃和7.5％co2下孵育2小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，然后添加补充有抗vsv-g抗体(克隆8g5f11，kerafast inc.)的培养基以中和残余vsv-g补充型输入病毒。在接种后20小时收获含有vsv-sars-cov-2-s假型的培养基，使其通过0.2μm过滤器(nalgene)并储存在-80℃。用培养于培养基中的vero 76细胞(crl-1587tm)来滴定各批假病毒。将由对应于每毫升200个转导单位(tu)的感染滴定度的确定体积的mn908947s糖蛋白假病毒参考批次诱发的相对荧光素酶单位用作对照者，所述mn908947s糖蛋白假病毒参考批次以前在muik等人，2021中进行了描述。计算各批sars-cov-2变体假病毒的输入体积以基于相对荧光素酶单位相对于参考物来对感染滴定度进行归一化。

40、假病毒中和化验

41、在化验前4小时，将vero 76细胞以在培养基中40，000个细胞/孔接种于96孔白色平底板(thermo scientific)中，并在37℃和7.5％co2下培养。将每种个体血清在培养基中连续稀释2倍，第一稀释度为1∶5(未感染omicron的三重bnt162b2疫苗接种；稀释范围为1∶5至1∶5，120)或1∶30(后续omicron ba.1或ba.2突破性感染后三重疫苗接种；稀释范围为1∶30至1∶30，720)。在sars-cov-1假病毒化验的情况下，所有个体的血清最初1∶5稀释(稀释范围为1∶5至1∶5，120)。将vsv-sars-cov-2-s/vsv-sars-cov-1-s粒子在培养基中进行稀释以在化验中获得200个tu。将血清稀释液与假病毒(n＝每种血清每种假病毒2个技术性重复)在室温下1∶1混合30分钟，然后添加至vero76细胞单层中，并在37℃和7.5％co2下孵育24小时。移除上清液，并用荧光素酶试剂(promega)裂解细胞。在plus酶标仪(bmg labtech)上记录发光，并且中和滴定度被计算为仍然导致发光减少50％的最高血清稀释度的倒数。结果用重复实验的几何平均滴定度(gmt)表示。如果未观察到中和作用，则报告检出限[lod]一半的任意滴定度值。

42、统计分析

43、用于分析抗体滴定度的统计聚合方法为几何平均值且对于sars-cov-2voc滴定度和mn908947滴定度的比率来说为几何平均值和相应95％置信区间。几何平均值的使用解释了跨越几个数量级的抗体滴定度的非正态分布。使用对多重比较作出邓恩校正(dunn’scorrection)的弗里德曼试验(friedman test)在共同的对照组下对成组几何平均中和抗体滴定度进行成对符号秩检验(pairwise signed-rank tests)。使用graphpad prism软件版本9进行所有统计分析。

44、实施例14中引用的参考文献

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60、实施例15：关于由编码来自omicron变体的sars-cov-2s蛋白的疫苗引发的免疫反应的进一步更新

61、在实施例8中描述的实验之后，进一步的受试者被纳入临床试验中，所述临床试验研究编码包含ba.1omicron变体所特有的一个或多个突变的sars-cov-2s蛋白的rna疫苗。在本实施例中，向受试者(18至55岁，有或无之前感染迹象)施用第2加强(第4剂量)的30ug编码mn908947毒株的sars-cov-2s蛋白的rna(在本实施例中为bnt162b2)或30ug编码具有omicron变体所特有的一个或多个突变的sars-cov-2s蛋白的rna(在本实施例中为bnt162b2omi，其编码具有ba.1omicron变体所特有的突变的sars-cov-2s蛋白，包含seq idno：50和51，并且编码seq id no：49的氨基酸)。

62、在对没有之前感染迹象的参与者的初步免疫原性分析中，与bnt162b2(n＝141)相比，bnt162b2omi(n＝132)引发了针对ba.1omicron sars-cov-2病毒的优异中和抗体反应。针对ba.1omicron的bnt162b2omi gmt为1929(ci：1632，2281)，相比之下bnt162b2gmt为1100(ci：932，1297)；gmt比率1.75(95％ci：1.39，2.22)。

63、与bnt162b2相比，bnt162b2omi引发了针对sars-cov-2的mn908947毒株的类似中和抗体反应。bnt162b2omi gmt为11997(ci：10554，13638)，相比之下bnt162b2gmt为12009(ci：10744，13425)。

64、数据表明，与编码mn908947毒株的s蛋白的rna疫苗相比，omicron单价疫苗作为第2加强疫苗接种(第4剂量)改善针对ba.1omicron的中和抗体反应，并且没有不利地影响针对sars-cov-2的mn908947毒株的中和抗体反应。

65、实施例16.voc疫苗接种的免疫影响

66、本实施例描述施用编码来自所关注的某些变体(“voc”)的刺突蛋白的bnt162b2疫苗的免疫影响。具体而言，本实施例描述了向已接受了两个剂量(即，根据已建立的模型免疫方案)的“原始”bnt162b2疫苗(即，编码mn908947刺突蛋白，如本文所述)的受试者(在此实施例中为小鼠)施用“加强剂量”的免疫影响。

67、图34呈现本实施例中使用的免疫方案。具体来说，将balb/c小鼠用bnt 162b2免疫两次(每剂1ug)，然后在稍后时间点用bnt162b2/voc(每剂1ug)免疫。免疫发生至多3或4次。定期对动物进行放血，以通过elisa和假病毒中和化验分析抗体免疫反应。在试验结束时，对动物实施安乐死，并分析脾脏中的t细胞反应。

68、用以下各项进行加强：(a)原始bnt162b2(“bnt162b2”)；(b)bnt162b2omi ba.1(“omi ba.1”)；(c)bnt162b2omi ba.4/5(“omi ba.4/5”)；(d)bnt162b2+omi ba.1(各自0.5g)；(e)bnt162b2+omi ba.4/5(各自0.5ug)；(f)omi ba.1+omi ba.4/5(各自0.5ug)；和(g)bnt162b2+omi ba.1+omi ba.4/5(各自0.33ug)。

69、omicron变体ba.4和ba.5首次在2022年1月在循环中报道，并且到2022年6月已成为占主导地位的变体。这两种谱系均含有氨基酸取代f486v和r493q。初步研究表明与ba.1和ba.2相比，尤其是与ba.1相比，ba.4和ba.5的抗原性质的显著变化。此外，随着在特定地点(例如葡萄牙)观察到ba.5变体比例的递增趋势，covid-19病例数量和试验阳性率也有所增加。本公开提出ba.4/5(鉴于其共同的刺突蛋白突变，它们在本实施例中一起考虑)可能代表逃逸voc。本公开证明包括一个或多个剂量的疫苗的给药方案(例如，如本文所述并且具体地如本实施例中所举例说明)的特定益处，所述疫苗包含或递送(例如，通过所施用rna的表达)含有相关ba.4/5序列(例如，氨基酸取代)的刺突蛋白。

70、图35和36呈现如所指示，相对于各种sars-cov-2株的基线(在第104天测定，加强前)几何平均滴定度(gmt)。可以看出，不同小鼠群组的基线免疫是相当的。具体来说，每种假病毒的组gmt在群组之间始终在相同的范围内；没有观察到大于约2倍的差异。与如上所述在人类群体中的观察结果一致，与针对voc的中和gmt相比，针对mn908947毒株的中和gmt相当高(gmt高达3，044)。总的来说，gmt的排序为mn908947＞ba.1`ba.2＞ba.2.12.1＞ba.4/5。

71、图37示出基线(在第104天测定，加强前)交叉中和作用分析，并且证明基线免疫群组在交叉中和能力方面是相当的。具体地说，在基线时，计算的变体/mn908947参考gmt比率表明，交叉中和能力在群组之间是相当相似的(在bnt162b2单价组re.ba.1中和中仅观察到一个异常值)。再次与人类群体的观察结果一致，ba.1＝ba.2＞ba.2.12.1＞ba.4/5。

72、图38-40呈现在加强后7天获得的数据，并记录了ba.4/5、并且特别是单价ba.4/5在实现gmt的显著几何平均值倍数增加(图38和39)和有效交叉中和作用(图40)方面的显著有效性。可以看出，bnt162b2加强剂免疫针对所有voc产生相当的滴定度增加(3.9-7.1倍)，而单价ba.1和ba.4/5加强剂产生同源voc滴定度的相当强的增加(对于ba.1为16.8倍，对于ba.4/5为67.3倍)。

73、单价ba.4/5加强剂在所测试的假病毒组中驱动滴定度增加方面是最有效的。与单价voc加强剂相比，二价加强剂显示类似但减弱的趋势；在二价加强剂中，b2+ba.4/5组合在驱动广泛交叉中和作用方面是最有效的。三价加强剂(b2+ba.1+ba.4/5)优于二价加强剂，并且在二价b2+ba.4/5与单价ba.4/5加强剂之间提供中间免疫。

74、图40尤其呈现计算的变体/mn908947参考gmt比率，其表明：

75、(i)bnt162b2加强剂产生相对差的交叉中和作用，尤其是ba.2及其后代(ba.2.12.1，ba.4/5)

76、(ii)ba.1加强剂产生对ba.1的优异交叉中和作用，但对ba.2.12.1、ba.4/5的中和作用仍然相对较差

77、(iii)ba.4/5加强剂产生平衡的泛omicron中和作用，针对ba.2、ba.2.12.1和ba.4/5具有非常令人鼓舞的中和作用

78、与单价voc加强剂相比，二价加强剂显示类似但减弱的趋势；在二价加强剂中，b2+ba.4/5组合在驱动广泛交叉中和作用方面是最有效的；三价加强剂(b2+ba.1+ba.4/5)引发了与ba.1/ba.4/5加强剂相当的交叉中和作用。

79、也可向小鼠施用两个rna分子，其中两个rna分子的比率不是1∶1。例如，可向小鼠施用包含1∶2比率的bnt162b2和ba.4/5的二价疫苗(例如，通过施用0.33ug的bnt162b2和0.66ug的ba.4/5)。还可向小鼠施用包含1∶3比率的bnt162b2和ba.4/5的二价疫苗(例如，通过施用0.25ug的bnt162b2和0.75ug的ba.4/5)。此类组合物可施用于未接种疫苗的小鼠或施用于之前用bnt162b2疫苗接种的小鼠(例如，之前被施用了两剂1ug的bnt162b2)。

80、本说明书证明了ba.4/5免疫(并且特别是bnt162b2+ba.4/5免疫，例如，具有本文提供的序列)的显著功效。

81、此外，本说明书证明了呈单价、二价和三价形式的ba.4/5免疫的功效，并记录了单价ba.4/5的出人意料的功效。

82、本公开具体地证明了向之前已进行免疫(例如，使用mn908947疫苗，如使用至少(或恰好)两剂mn908947疫苗)的受试者施用的一个或多个ba.4/5剂量的显著有效性。不希望受特定理论束缚，本公开教导，omicron ba.4/5刺突的免疫学特征可使其对免疫受试者特别有用或有效，包括已用mn908947毒株(和/或用与mn908947毒株免疫相关的一种或多种毒株)进行免疫(例如，通过之前施用一个或多个疫苗剂量和/或通过之前感染)免疫的受试者，包括具体地通过用一个或多个剂量(例如，1、2、3、4个或更多个剂量)的原始bnt162b2疫苗接种。

83、实施例17：omicron ba.2突破性感染增强ba.2.12.1和ba.4/ba.5的交叉中和作用

84、本实施例17为实施例14的扩展，并且描述了分析从ba.1-和ba.2-突破病例采集的血清样本针对omicron ba.4和ba.5变体的中和活性的实验。除了证实实施例14中描述的结果外，本实施例17还提供了由ba.1和ba.2突破性感染诱发的抗体反应的进一步表征，并且提供了关于哪些方面可促成与ba.1突破性感染相比，如在ba.2突破性感染中观察到的ba.4/5omicron变体的中和作用增加的见解。具体而言，本实施例证明ba.2突破性感染可诱发结合sars-cov-2s蛋白(例如，ba.4/5sars-cov-2omicron变体)的n末端结构域(ntd)的中和抗体的更高滴定度，其可导致ba.4/5omicron变体的中和作用增加。

85、如之前实施例中所证明，之前被施用编码来自mn908947毒株的sars-cov-2s蛋白的rna且随后发生了omicron ba.1突破性感染的个体具有针对omicron ba.1、ba.2和之前sars-cov-2关注变体(voc)的强血清中和活性，但针对取代了之前变体的高传染性omicron亚系ba.4和ba.5的血清中和活性较低。由于后面的亚系来源于omicron ba.2，因此对经历了ba.2突破性感染的covid-19mrna疫苗三重免疫个体的血清中和活性进行了分析。本实施例证明，这些个体的血清具有针对之前的voc以及所有测试的omicron亚系，包括ba.2来源的变体ba.2.12.1、ba.4/ba.5具有广泛中和活性(证实前面实施例14的结果)。此外，应用抗体耗减，本实施例表明，ba.2恢复期血清对ba.2和ba.4/ba.5亚系的中和作用在很大程度上由靶向刺突糖蛋白的n末端结构域(ntd)的抗体驱动，而omicron ba.1恢复期血清对它们的中和作用完全依赖于靶向受体结合结构域(rbd)的抗体。这些发现表明，与ba.1刺突糖蛋白相比，暴露于omicron ba.2在接种疫苗的个体中引发显著ntd特异性回忆反应，并且由此增强ba.4/ba.5亚系的中和作用。鉴于ba.2来源的亚系如ba.4/ba.5占主导地位的当前流行病学和快速持续进化，这些发现与开发omicron适应性疫苗高度相关。

86、引言

87、2021年11月sars-cov-2omicron关注变体(voc)的出现(参考文献1)可被视为covid-19大流行的转折点。omicron ba.1相对于来自mn908947毒株的s蛋白在刺突(s)糖蛋白受体结合结构域(rbd)和n末端结构域(ntd)中显著改变，部分逃逸之前建立的免疫(参考文献2)。

88、许多表位的丧失(参考文献3，4)降低了对由基于野生型毒株(mn908947-hu-1)s糖蛋白的疫苗或通过感染之前毒株(参考文献5-7)诱发的中和抗体的易感性，从而需要第三疫苗剂量来建立完全免疫(参考文献8-10)。omicron ba.1被ba.2变体取代，ba.2变体进而被它的后代ba.2.12.1、ba.4和ba.5取代，所述后代现在在许多地区占主导地位(参考文献11-14)。

89、在抗原性上，ba.2.12.1表现出与ba.2而非ba.1的高度相似性，而ba.4和ba.5与ba.2明显不同，并且甚至与ba.1更明显不同，与它们的系谱一致(参考文献15和16)。虽然rbd中的一些氨基酸变化在所有omicron亚系之间是共享的，但l452q改变仅在ba.2.12.1中发现，并且是区别其rbd与ba.2变体的rbd的唯一残基。l452r和f486v改变是ba.4/ba.5特异性的，而s371f、t376a、d405n和r408s由ba.2及其后代ba.2.12.1和ba.4/ba.5所共享，但不由ba.1共享(图33)。这些氨基酸交换与从疫苗诱发的中和抗体和靶向野生型s糖蛋白的治疗性抗体药物进一步逃逸相关(参考文献6，15，17-20)。ba.2及其后代的ntd在抗原性上更接近于野生型毒株，并且缺乏ba.1中发生的几种氨基酸变化、插入和缺失(图33)。例如，使ba.1变体对一组针对野生型s糖蛋白的ntg定向单克隆抗体产生抗性的δ143-145、l212i或ins214epe在ba.2和后代中没有发现(参考文献21，22)。

90、如之前实施例中所证明，bnt162b2疫苗接种的个体的omicron ba.1突破性感染增强针对omicron ba.1、ba.2和之前的voc的广泛中和活性，其水平与针对sars-cov-2野生型所观察到的相似。三重bnt162b2疫苗接种的个体的ba.1突破性感染诱发强效回忆反应，主要是扩增针对在变体中广泛共享的表位的记忆b细胞，而不是诱发仅对ba.1具有特异性的b细胞。与ba.1变体相比，omicron亚系ba.4和ba.5的中和作用在ba.1突破患者中中在较低程度上增加，并且几何平均滴定度与针对系统发育上更远缘的sars-cov-1的几何平均滴定度相当。

91、鉴于omicron ba.2相比于与ba.1，与ba.4/ba.5更密切相关，所以评估了与ba.1突破性感染相比，ba.2突破性感染是否会使交叉中和活性更朝向这些最新的omicron亚系转移。比较了来自三组不同的用mrna covid-19疫苗三重疫苗接种的个体，即来自无sars-cov-2感染史的个体和经历了ba.1或ba.2的突破性感染的个体的血清样本对不同omicron亚系的中和作用。此外，还表征了靶向s糖蛋白rbd对比ntd的血清抗体对omicron亚系中和作用的贡献。由此产生的数据增加了目前对omicron免疫逃逸机制以及免疫对变体交叉中和作用的影响的了解，并且由此有助于指导进一步的疫苗开发。

92、结果

93、群组和采样

94、本研究调查了来自三个群组的血清样本：在采样时未感染sars-cov-2的bnt162b2三重疫苗接种的个体(bnt162b23，n＝18)、用三个剂量的mrna covid-19疫苗(bnt162b2/mrna-1273同源或异源方案)疫苗接种且随后具有在ba.1占主导地位时的omicron突破性感染的个体(mrna-vax3+ba.1，n＝14)或具有在ba.2占主导地位时的突破性感染的三重mrna疫苗接种的个体(mrna-vax3+ba.2，n＝13)。对于恢复期群组，关键事件之间的相关间隔，如最近的疫苗接种和感染提供于图41中。血清源自bnt162b2疫苗试验的生物样本采集和探究经历了omicron突破性感染的疫苗接种患者的非干预研究。

95、三重mrna疫苗接种的个体的omicron ba.2突破性感染诱发包括omicron ba.4/ba.5在内的voc的广泛中和

96、在充分表征的假病毒中和试验(pvnt)(参考文献24，25)中通过用具有sars-cov-2野生型毒株或alpha、beta、delta、omicron ba.1、ba.2以及ba.2来源的亚系ba.2.12.1、ba.4和ba.5的s糖蛋白的假病毒确定50％假病毒中和(pvn50)几何平均滴定度(gmt)来测试免疫血清的中和活性。由于ba.4和ba.5共享同一的s糖蛋白序列，所以在本实施例中，它们在pvnt的背景下被称为ba.4/5。此外，对sars-cov(本文称为sars-cov-1)进行测定，以检测潜在泛沙贝病毒中和活性(参考文献26)。作为正交试验系统，还使用了活sars-cov 2中和试验(vnt)，所述中和试验分析在整个试验周期内存在的抗体在真实病毒(sars-cov-2野生型毒株和包括ba.4在内的voc，omicron ba.2.12.1除外)的多周期复制期间的中和作用。

97、在pvnt中，来自所有三个群组的血清都强效中和野生型毒株、alpha、beta、deltavoc以及omicron ba.1和ba.2谱系，中和活性在突破性感染的个体中、特别是在ba.1突破性感染群组(mrna-vax3+ba.1)中更明显。然而，与野生型相比，bnt162b2三重疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体(bnt162b23)和mrna-vax3+ba.1个体针对ba.2.12.1的血清中和活性显著降低(p＜0.05)，并且针对ba.4/5的血清中和活性甚至更显著降低(p＜0.001；与野生型毒株相比＞5倍)(图42(a))。相比之下，来自具有omicron ba.2突破性感染的三重mrna疫苗接种的个体(mrna-vax3+ba.2)的血清与野生型毒株一样强效地中和ba.2.12.1假病毒。ba.4/5的中和作用与ba.2.12.1的中和作用大致相似，并且相对于野生型毒株的降低显著(p＜0.05)，但与两个其他群组相比不太明显(约2.5倍)。

98、为了关于中和广度比较群组而不考虑抗体滴定度的大小，将voc pvn50gmt针对mn908947毒株进行了归一化。所述比率表明，与mrna-vax3+ba.1和bnt162b23血清(gmt比率为0.18和0.17)相比，ba.4/5交叉中和作用在mrna-vax3+ba.2中明显更强(gmt比率为0.38)(图42(b))。类似地，mrna-vax3+ba.2血清对omicron ba.2.12.1的交叉中和作用(gmt比率0.52)强于mrna-vax3+ba.1血清(gmt比率0.43)，并且甚至更强于bnt162b23血清(gmt比率0.26)。

99、仅包括这三个群组内的bnt162b2疫苗接种的个体的单独分析证实，ba.2突破性感染与相当大的ba.4/5交叉中和作用相关(ba.4/5与野生型gmt比率0.42)，而在ba.1突破性感染后，针对ba.4/5的pvn50gmt比针对野生型的那些低约6倍(即，gmt比率0.17)(图45((a)-(c))。ba.1和ba.2恢复期的血清对ba.2和ba.2.12.1的交叉中和作用优于bnt162b2三重疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体的血清。

100、真实活sars-cov-2病毒中和化验提供的voc中和滴定度与来自pvnt化验的中和滴定度高度相关(图46)，并且证实了图42中的主要发现。在此化验中，与针对野生型的相比，bnt162b23血清中针对omicron ba.2的50％病毒中和(vn50)gmt强烈降低(p＜0.0001)，而来自两个恢复期组的血清均表现出强中和活性，vn50gmt与针对野生型毒株的相当(图43(a))。与bnt162b23和mrna-vax3+ba.1群组相比，针对omicron ba.4的中和活性的降低灶ba.2恢复期群组中不太明显(vn50gmt约2.5倍，相比之下针对野生型毒株分别低约15倍和约5倍)。

101、与pvnt数据一致，通过计算针对野生型毒株的voc vn50gmt比率进行的非大小依赖性分析表明，与mrna-vax3+ba.1群组(gmt比率0.20)和bnt162b23(gmt比率0.07)相比，ba.4交叉中和作用在mrna-vax3+ba.2群组(gmt比率0.39)中更强(图43(b))，并且在bnt162b2三重疫苗接种的个体的子群组中类似(图45(d)-(f))。

102、总的来说，这些数据证明，疫苗接种的个体的omicron ba.2突破性感染与针对所有测试的omicron亚系和之前的sars-cov-2voc的广泛中和活性相关。特别地，这些数据表明，与ba.1突破性感染相比，ba.2突破性感染在使中和抗体反应重新聚焦朝向ba.4/ba.5s糖蛋白方面更有效(约2倍高的交叉中和作用)。

103、三重mrna疫苗接种的ba.2恢复期个体的血清对omicron ba.2和ba.4/5的中和作用在很大程度上是由靶向ntd的抗体介导的。

104、为了剖析与s糖蛋白的rbd或ntd结合的血清抗体对于中和sars-cov-2野生型、omicron ba.1、ba.2和ba.4/5的作用，将这些抗体级分分别从三个群组的血清中好耗减(各自n＝6，图47(a))。使用sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白rbd和ntd诱饵进行耗减，因为已证明voc突破性感染主要引发识别在已知voc中保守的表位的回忆反应(参考文献10，23和27)。

105、耗减实验除去＞97％的所有rbd结合抗体和＞74％的所有ntd结合抗体(图47(b))。耗减的血清随后在pvnt化验中进行测试。在来自所有群组的血清中，rbd抗体耗减强烈降低针对野生型毒株的中和活性，而在ntd结合抗体的耗减后，中和活性大部分保留(＞80％剩余活性)(图44(a))。omicron ba.1的中和作用在rbd结合抗体耗减后完全消除，并且基本上不受ntd结合抗体耗减的影响。对于ba.2的中和作用，rbd抗体耗减几乎完全消除了mrna-vax3+ba.1血清的中和活性(约2％的残余中和活性)。bnt162b23并且特别是mrna-vax3+ba.2血清的中和滴定度的降低不太严重，分别约12％和约24％的剩余中和活性。相比之下，ntd结合抗体的耗减对bnt162b23和mrna-vax3+ba.1血清的中和活性没有显著影响(分别为未耗减对照的约91％和约99％)，而mrna-vax3+ba.2血清的中和活性降低至约50％。对于ba.4/5的中和作用，在rbd抗体耗减后观察到类似的模式，mrna-vax3+ba.1血清的中和活性强烈降低(约3％残余活性)，相比之下bnt162b23和mrna-vax3+ba.2血清的中和活性降低不太严重(分别约20％和约26％剩余活性)。与ba.2相比，ntd结合抗体的耗减对ba.4/5中和作用的影响更大，其中bnt162b23和mrna-vax3+ba.1血清的剩余中和活性分别为约70％和约90％，再次mrna-vax3+ba.2血清的效应最强(为未耗减对照的约48％)。

106、作为正交方法，评估了来自那3个群组的疫苗接种的个体的血清针对含有工程化杂交s糖蛋白的假病毒的中和活性，所述工程化杂交s糖蛋白由omicron ba.1n末端(包括ntd(氨基酸1-338))和ba.4/5c末端(包括rbd)组成。

107、来自bnt162b23的血清中针对omicron ba.1-ba.4/5杂交假病毒的pvn50gmt略低于ba.4/5假病毒的gmt(1.86倍)，并且在ba.1恢复期中，gmt仅受轻微影响(＜1.5倍降低)(图44(b))。相比之下，在ba.2恢复期血清中，针对杂交假病毒的滴定度远远低于针对ba.4/5假病毒的滴定度(gmt降低＞3倍)(图44(b))，这表明大量中和活性可归因于在omicron ba.2与ba.4/5之间共享的ntd表位。

108、总的来说，在两个实验中获得的数据表明，在所有这些voc中，rbd结合抗体对中和作用提供了主要贡献。此外，暴露于ba.1(在其ntd方面与之前的voc显著不同；图33)加强了疫苗诱发的主要结合rbd的中和抗体的回忆反应，而暴露于ba.2s糖蛋白(具有与之前的voc更密切相关的ntd)可在现有记忆的基础上建立，并且引发靶向ntd的抗体的大量回忆，这进而大大促成ba.2和ba.4/5的中和作用。

109、论述

110、最近的研究已经证明，在用mrna疫苗bnt162b2或mrna-1273或灭活病毒疫苗进行疫苗接种的个体中，omicron ba.1突破性感染加强针对包括ba.2在内的voc的血清中和滴定度(参考文献10，15，23)，但不加强针对ba.2.12.1或ba.4/ba.5的血清中和滴定度。免疫逃逸一直被归因于先前存在的中和抗体反应的加强，所述中和抗体反应识别在sars-cov-2野生型毒株与omicron ba.1之间共享、但由于包括l452q/l452r和f486v在内的关键残基的改变而在ba.2.12.1、ba.4和ba.5中部分缺失的表位(参考文献15)。

111、在本实施例中，ba.2突破性感染与广泛中和活性相关，包括ba.2及其后代ba.2.12.1、ba.4和ba.5。这些发现表明，与在抗原性上更远缘的ba.1变体的突破性感染相比，ba.2与ba.2.12.1和ba.4/5在s糖蛋白rbd以及ntd方面的较高序列相似性驱动更有效的交叉中和作用。特别地，鉴于异源sars-cov-2株的突破性感染主要扩增针对保守的s糖蛋白表位的记忆b细胞库(参考文献10，23)，所以由于ba.1ntd内的大量改变，ba.1突破性感染可能不会引发ntd特异性记忆b细胞的强烈回忆(图33)。本文所述的在抗体耗减和杂交假病毒实验中获得的数据表明，ntd结合抗体对三重疫苗接种的ba.2恢复期血清中针对omicronba.4/5的中和活性具有很大贡献，而在ba.1恢复期血清中，中和活性主要依赖于rbd结合抗体。这一发现与以下观察结果一致，即从ba.2突破性感染的个体中分离出的ntd结合抗体不会中和ba.1(参考文献29)。这些重要的发现共同扩展了我们关于用目前基于野生型毒株的疫苗进行疫苗接种和加强以及各种voc的突破性感染如何塑造群体中的免疫模式的认识，并为响应于当前和新出现的voc的进一步疫苗开发和适应提供了重要信息。

112、尽管用当前批准的基于野生型毒株的疫苗如bnt162b2进行疫苗接种的重要性，所述疫苗提供有效的保护免受由包括omicron ba.1和ba.2在内的当前voc造成的严重疾病(参考文献30和31)，但本发明的发现强调，考虑迅速演变的流行病学情形和新出现的sars-cov-2变体对于指导疫苗适应项目也是重要的。例如，虽然适应于ba.1株s糖蛋白序列的疫苗的功效当前正在临床试验中进行研究，但本发明的数据表明，可从适应于ba.2或后代的序列的疫苗获得进一步益处。

113、材料和方法

114、研究设计、参与者募集和样本采集

115、本研究的目的是研究omicron ba.2突破性感染对人血清的交叉变体中和能力的影响。将三重mrna(bnt162b2/mrna-1273)疫苗接种且具有证实的在德国omicron ba.2谱系占主导地位的一段时间内的后续sars-cov-2突破性感染的个体(2022年3月至5月；mrna-vax3+ba.2)中的免疫反应与三重mrna疫苗接种且具有证实的在omicron ba.1谱系占主导地位的一段时间内的后续sars-cov-2突破性感染的个体(2021年11月至2022年1月中旬；mrna-vax3+ba.1)(参考文献1和2)以及在样本采集时未感染sars-cov-2(核衣壳血清反应阴性)的三重bnt162b2疫苗接种的个体(bnt162b23)的免疫反应进行比较。使用假病毒和活sars-cov-2中和化验表征血清中和能力。参考群组bnt162b23和mrna-vax3+ba.1的数据之前已公开(参考文献10)，除了新生成的ba.2.12.1中和数据。进一步表征了在耗减靶向野生型s糖蛋白ntd或rbd的中和抗体后，更小的子群组中的变体的交叉中和作用。

116、来自bnt162b23群组的个体提供了知情同意书作为他们参与2期试验bnt162-17(nct05004181)的一部分。来自mrna-vax3+omi ba.1和mrna-vax3+ba.2群组的参与者是从法兰克福歌德大学(goethe university frankfurt)的大学医院募集的，作为已在接种covid-19疫苗之后经历omicron突破性感染的非干预研究(由大学医院伦理委员会批准的方案[编号：2021-560])探究性患者的一部分。omicron ba.1感染通过变体特异性pcr证实。本研究中4名ba.1恢复期参与者的感染进一步通过基因组测序进行表征。在所有4个病例中，基因组测序均证实了omicron ba.1感染。

117、提供了所有参与者的人口统计学和临床数据以及采样时间点(图41)。所有参与者在疫苗接种前均无记录的sars-cov-2感染史。参与者在采血时没有症状。

118、通过在2000x g下将抽取的血液离心10分钟来分离出血清，并冷冻保存直至使用。

119、vsv-sars-cov-2s变体假病毒产生

120、根据公开的假型化方案(参考文献3)用sars-cov-1s糖蛋白(uniprot参考：p59594)和源自以下各项的sars-cov-2s糖蛋白对编码绿色荧光蛋白(gfp)和荧光素酶而不是vsv-糖蛋白(vsv-g)的重组复制缺陷型水疱性口炎病毒(vsv)载体进行假型化：mn908947-hu-1参考株(ncbi参考：43740568)、alpha变体(改变：δ69/70、δ144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h)、beta变体(改变：l18f、d80a、d215g、δ242-244、r246i、k417n、e484k、n501y、d614g、a701v)、delta变体(改变：t19r、g142d、e156g、δ157/158、k417n、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n)、omicron ba.1变体(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f)、omicron ba.2变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)、omicron ba.2.12.1变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452q、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、s704l、n764k、d796y、q954h、n969k)、omicron ba.4/5变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)或人工omicron ba.1-ba.4/5杂交s糖蛋白(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)。sars-cov-2s糖蛋白改变的图解示于图48中，并且omicron亚系中s糖蛋白改变的单独比对展示于图33中。

121、简言之，将在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs[sigma-aldrich])的杜氏改良伊氏培养基(dmem)加上glutamaxtm(gibco)(称为培养基)中培养的hek293t/17单层(crl-11268tm)按照制造商的说明书用桑格测序验证的sars-cov-1或变体特异性sars-cov-2s表达质粒加上lipofectamine ltx(lifetechnologies)转染。在转染后24小时，用vsv-g补充型vsvδg载体以3的感染复数(moi)感染细胞。在37℃和7.5％co2下孵育2小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，然后添加补充有抗vsv-g抗体(克隆8g5f11，kerafastinc.)的培养基以中和残余vsv-g补充型输入病毒。在接种后20小时收获含有vsv-sars-cov-2-s假型的培养基，使其通过0.2μm过滤器(nalgene)并储存在-80℃。用培养于培养基中的vero 76细胞(crl-1587tm)来滴定各批假病毒。将由对应于每毫升200个转导单位(tu)的感染滴定度的确定体积的sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次诱发的相对荧光素酶单位用作对照者，所述sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次以前在muik等人，2021(参考文献4)中进行了描述。计算各批sars-cov-2变体假病毒的输入体积以基于相对荧光素酶单位相对于参考物来对感染滴定度进行归一化。

122、假病毒中和化验

123、在化验前4小时，将vero 76细胞以40，000个细胞/孔接种于96孔白色平底板(thermo scientific)中的培养基中，并在37℃和7.5％co2下进行培养。将每种个体血清在培养基中连续稀释2倍，第一稀释度为1∶5(未感染sars-cov-2的三重bnt162b2疫苗接种；稀释范围为1∶5至1∶5，120)或1∶30(后续omicron ba.1或ba.2突破性感染后三重疫苗接种；稀释范围为1∶30至1∶30，720)。在sars-cov-1假病毒化验的情况下，所有个体的血清最初1∶5稀释(稀释范围为1∶5至1∶5，120)。将vsv-sars-cov-2-s/vsv-sars-cov-1-s粒子在培养基中进行稀释以在化验中获得200个tu。将血清稀释液与假病毒(n＝每种血清每种假病毒2个技术性重复)在室温下1∶1混合30分钟，然后添加至vero 76细胞单层中，并在37℃和7.5％co2下孵育24小时。移除上清液，并用荧光素酶试剂(promega)裂解细胞。在plus酶标仪(bmg labtech)上记录发光，并且中和滴定度被计算为仍然导致发光减少50％的最高血清稀释度的倒数。对于耗减研究，增加关于中和滴定度的分辨率，以便区分个体血清水平的小于2倍差异。通过生成在每种系列血清稀释度下中和百分比的4参数逻辑(4pl)拟合来确定中和滴定度。50％假病毒中和(pvn50)滴定度被报道为导致发光减少50％的稀释度的插值倒数。所有假病毒中和实验的结果都用重复实验的几何平均滴定度(gmt)表示。如果未观察到中和作用，则报告检出限[lod]一半的任意滴定度值。未感染sars-cov-2的bnt162b2三重疫苗接种群组和三重疫苗接种的ba.1恢复期群组的sars-cov-2野生型毒株和alpha、beta、delta、ba.1、ba.4/5voc以及sars-cov-1假病毒中和gmt之前在quandt.等人(参考文献10)中进行了报道。本研究中只有ba.2.12.1中和数据是新从血清样本中生成的。

124、活sars-cov-2中和化验

125、在意大利锡耶纳的vismederi s.r.1.通过基于细胞病变效应(cpe)的微中和化验确定sars-cov-2病毒中和滴定度。简言之，将来自个体的热灭活血清样本1∶2连续稀释(从1∶10开始；n＝每种血清每种病毒2个技术性重复)并在37℃下与100tcid50的活野生型样sars-cov-2病毒株2019-ncov/italy-inmi1(genbank：mt066156)、alpha病毒株ncov19分离株/英格兰/mig457/2020(改变：δ69/70、δ144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h)、beta病毒株ncov19分离株/英格兰ex-sa/hcm002/2021(改变：d80a、d215g、δ242-244、k417n、e484k、n501y、d614g、a701v)、从鼻咽拭子分离的经序列验证的delta株(改变：t19r、g142d、e156g、δ157/158、l452r、t478k、d614g、p681r、r682q、d950n)、omicron ba.1株hcov-19/比利时/rega-20174/2021(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f)、经序列验证的omicron ba.2株(改变：t19i、δ24-26、a27s、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、r682w、n764k、d796y、q954h、n969k)或经序列验证的omicron ba.4株(改变：v3g、t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)一起孵育1小时以允许任何抗原特异性抗体与病毒结合。s糖蛋白改变的图解在图48中示出。2019-ncov/意大利-inmi1株s糖蛋白的序列与野生型sars-cov-2s(mn908947-hu-1分离株)是同一的。将vero e6(crl-1586tm)细胞单层与血清/病毒混合物接种在96孔板中，并孵育3天(2019-ncov/意大利-inmi1株)或4天(alpha、beta、delta、omicron ba.1、ba.2和ba.4变体株)，以允许非中和病毒感染。在倒置光学显微镜下观察所述板，并将孔评分为对sars-cov-2感染呈阳性(即，显示cpe)或对sars-cov-2感染呈阴性(即，细胞存活而无cpe)。

126、中和滴定度被确定为保护超过50％的细胞免受cpe的最高血清稀释度的倒数，并报告为重复实验的gmt。如果未观察到中和作用，则报告5[lod的一半]的任意滴定度值。

127、耗减人血清中的rbd或ntd结合抗体

128、根据制造商的说明书制备sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白rbd和ntd偶联磁珠(acro biosystems，目录号mbs-k002和mbs-k019；分别40μg rbd/mg珠粒和38μg ntd/mg珠粒)。将珠粒以1mg珠粒/ml重悬于超纯水中，并使用磁体来收集珠粒并用pbs洗涤珠粒。将珠粒重悬于血清中，每100μl血清获得20μg rbd或ntd诱饵。通过每100μl血清添加0.5mg生物素饱和的myonetm链霉亲和素t1dynabeadstm t1dynabeadstm(thermofisher，目录号65601)，对每种血清进行模拟耗减(未耗减对照)。在温和旋转下将珠粒与人血清孵育1小、时。施用磁体来从耗减的上清液中分离珠粒结合的抗体。使用假病毒中和化验分析耗减的和未耗减的血清的交叉中和能力。通过多重电化学发光免疫测定(meso scale discovery，v-plexsars-cov-2组1试剂盒，目录号k15359u-2)确定rbd和ntd结合抗体两者的耗减功效。

129、统计分析

130、用于分析抗体滴定度的统计聚合方法为几何平均值且对于sars-cov-2voc滴定度和野生型毒株滴定度的比率来说为几何平均值和相应95％置信区间。几何平均值的使用解释了跨越几个数量级的抗体滴定度的非正态分布。使用对多重比较作出邓恩校正的弗里德曼试验在共同的对照组下对成组几何平均中和抗体滴定度进行成对符号秩检验。使用spearman相关性来评价非正态分布数据集之间的单调关系。使用graphpad prism软件版本9进行所有统计分析。

131、实施例17的参考文献

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164、实施例18：暴露于ba.4/ba.5刺突糖蛋白驱动接种疫苗的人和小鼠中的泛omicron中和作用

165、本实施例是实施例7、13、16和17的扩展，并且描述(i)来自之前针对sars-cov-2疫苗接种且有过有ba.4/5突破性感染的人受试者(在本实施例中，先前已经被施用了三个剂量的编码mn908947变体的sars-cov-2s蛋白的rna疫苗的人受试者)的免疫反应数据，和(ii)进一步小鼠数据，显示由编码包含某些omicron变体所特有的突变的sars-cov-2s蛋白的rna诱发的免疫反应。

166、摘要

167、由于刺突(s)糖蛋白内的大量氨基酸改变，sars-cov-2omicron变体及其亚系显示出中和抗体的明显病毒逃逸。如之前实施例中所证明，用omicron子代ba.1和ba.2疫苗接种的个体的突破性感染一直与针对sars-cov-2关注变体(voc)，最显著的是针对最近出现的ba.2后代omicron ba.4和ba.5的不同交叉中和活性模式相关。在此，在接种疫苗的人和小鼠中研究了omicron ba.4/ba.5s糖蛋白暴露对中和抗体反应的大小和广度的影响。来自具有omicron ba.4/ba.5突破性感染的三重mrna疫苗接种的个体的免疫血清显示针对omicron ba.1、ba.2、ba.2.12.1和ba.4/ba.5展示广泛且强效的中和活性。在基于sars-cov-2野生型(mn908947)株的初次免疫后，向小鼠施用ba.4/ba.5适应性mrna加强疫苗与类似广泛的中和活性相关。用编码ba.4/ba.5适应性和基于野生型的s糖蛋白免疫原的二价mrna疫苗免疫未接种疫苗的小鼠进一步显示诱发针对omicron和非omicronvoc的强烈且广泛的中和活性。这些发现支持以下结论，即当作为单价或二价加强剂施用时，omicronba.4/ba.5适应性疫苗(例如，编码包含这些变体所特有的突变的sars-cov-2s蛋白的rna)可改善针对当前和新出现的voc的中和广度(特别是与ba.1适应性疫苗相比有所改善)。这些发现还表明，ba.4/ba.5疫苗当以二价形式施用时具有向没有预先存在的针对sars-cov-2的免疫的受试者(例如，向未暴露的受试者)提供保护。

168、引言

169、自2021年11月出现以来，sars-cov-2omicron关注变体(voc)对covid-19大流行的流行病学情形产生了重大影响(参考文献1-2)。初始omicron变体ba.1的尖刺(s)糖蛋白中的显著改变导致许多中和性抗体表位的丧失(参考文献3)，并使ba.1能够部分逃逸先前建立的基于sars-cov-2野生型毒株(mn908947-hu-1)的免疫(参考文献4-6)。因此，与之前的voc相比，疫苗接种个体的omicron突破性感染更为常见。虽然omicron ba.1在全球许多国家被ba.2变体取代，但其他变体如ba.1.1和ba.3暂时和/或在当地势头正猛，但没有在全球占主导地位(参考文献7-9)。omicron ba.2.12.1取代ba.2在此期间在美国占主导地位，而ba.4和ba.5在欧洲、非洲部分地区和亚洲/太平洋地区取代ba.2(参考文献8，10-12)。当前，voc omicron ba.4和ba.5在世界大部分地区(包括美国)占主导地位，其中它们最终取代了ba.2.12.1(参考文献13)。

170、omicron谱系voc在s糖蛋白中获得了大量改变(氨基酸交换、插入或缺失)，其中一些在所有omicron voc之间共享，而其他对一个或多个亚系具有特异性(参见图33)。在抗原性上，ba.2.12.1表现出与ba.2而非ba.1的高度相似性，而ba.4和ba.5与ba.2明显不同，并且甚至与ba.1更明显不同，与它们的系谱一致(参考文献14)。ba.1与其余omicron voc的主要区别包括s糖蛋白n末端结构域中的δ143-145、l212i或ins214epe和受体结合结构域(rbd)中的g446s或g496s。rbd中的氨基酸变化t376a、d405n和r408s进而为ba.2及其后代所共有，而在ba.1中不存在。此外，一些改变对某些ba.2-后代voc具有特异性，包括对于ba.2.12.1而言的l452q或对于ba.4和ba.5而言的l452r和f486v。大多数这些共享的和亚系特异性的改变显示在针对野生型s糖蛋白产生的单克隆抗体和多克隆血清的免疫逃逸中起重要作用(参考文献15)。

171、如之前实施例中所述，用mrna疫苗或灭活病毒疫苗免疫的个体的omicron ba.1或ba.2突破性感染一直与针对omicron ba.1、ba.2和之前的voc的强效中和活性相关(还参见参考文献16-21)。omicron ba.2.12.1和ba.4/ba.5中和作用相对于未感染sars-cov-2的疫苗接种者血清的相当加强仅在ba.2突破病例中明显，其针对ba.4/ba.5的滴定度低于针对其余voc的滴定度(还参见参考文献19-21)。与野生型加强剂相比，在基于野生型毒株的初次免疫后向小鼠施用omicron ba.1适应性加强剂之前显示增强针对ba.1的中和活性(参见之前的实施例16和参考文献22)。2期临床试验的初步分析还表明，与来自用原型mrna疫苗加强的个体的血清相比，来自用omicron ba.1适应性mrna疫苗作为第4剂疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体的血清显示针对ba.1的显著增加的中和反应(参考文献23)。然而，ba.1适应性加强剂与增加的ba.4/ba.5交叉中和作用不相关，因为在来自ba.1和原型加强个体的血清中，针对ba.4/ba.5的反应分别比针对ba.1和原型株的反应低大约3倍和5倍。

172、鉴于当前高传染性voc omicron ba.4和ba.5在全球大部分地区的主导地位，本实施例旨在研究暴露于omicron ba.4/ba.5s糖蛋白是否会触发针对相关omicron亚系的更广泛中和抗体反应。对来自具有omicron ba.4/ba.5突破性感染的疫苗接种个体的免疫血清中和来自在用bnt162b2初次免疫后接受了omicron ba.4/ba.5适应性加强剂疫苗的小鼠的血清中针对omicron voc的中和活性的广度进行了测试。此外，评价了来自用omicronba.4/ba.5适应性疫苗免疫但之前没有暴露于野生型s糖蛋白的小鼠的血清中的中和活性的广度。本实施例中描述的数据提供了对omicron免疫逃逸机制和免疫对变体交叉中和作用的影响的进一步深入了解，并且因此对指导疫苗接种策略的选择是有用的。

173、结果

174、研究设计、群组和采样

175、研究了omicron ba.4/ba.5突破性感染在用三个剂量的mrna covid-19疫苗(bnt162b2/mrna-1273同源或异源方案)疫苗接种的个体中的影响(图49(a))和bnt162b2免疫前小鼠的omicron ba.4/ba.5适应性加强剂疫苗接种对免疫血清中的中和活性广度的影响(图49(b))。此外，在未感染小鼠(即，之前未暴露于sars-cov-2s蛋白的小鼠，参见图49(c))中研究了用omicron ba.4/ba.5适应性疫苗进行初次免疫的效果。

176、对于突破性感染研究，从三重mrna疫苗接种且随后经历了omicron ba.4或ba.5突破性感染的个体(mrna-vax3+ba.4/ba.5，n＝17，图53)采集血清样本。包括三个群组用于参考：具有omicron ba.2(mrna-vax3+ba.2，n＝19)或ba.1(mrna-vax3+ba.2，n＝14)突破性感染的三重mrna疫苗接种的个体，以及在采样时未感染sars-cov-2的bnt162b2三重疫苗接种的个体(bnt162b23，n＝18，图53)。血清源自之前在实施例7、13和17中描述的研究。

177、三重mrna疫苗接种的个体的omicron ba.4/ba.5突破性感染导致泛omicron中和活性

178、在充分表征的假病毒中和试验(pvnt)(参考文献24-25)中通过用具有sars-cov-2野生型毒株或omicron ba.1、ba.2以及ba.2来源的亚系ba.2.12.1、ba.4和ba.5的s糖蛋白的假病毒确定50％假病毒中和(pvn50)几何平均滴定度(gmt)来测试免疫血清的中和活性。由于ba.4和ba.5的s糖蛋白序列是同一的，所以在pvnt的背景下，使用ba.4/5。此外，对sars-cov(本文称为sars-cov-1)进行测定，以检测潜在泛沙贝病毒中和活性(参考文献26)。作为正交试验系统，还使用了活sars-cov-2中和试验(vnt)，所述中和试验分析在整个试验周期内存在的免疫血清在真实病毒(sars-cov-2野生型毒株和omicron voc ba.1、ba.2和ba.4)的多周期复制期间的中和作用。

179、在pvnt化验中，来自omicron ba.4/ba.5突破性感染群组(mrna-vax3+ba.4/ba.5)的血清强效地中和了野生型毒株和所有测试的omicron voc(图50(a))。针对omicron ba.2和ba.2.12.1假病毒的pvn50gmt在针对野生型毒株的gmt的2倍范围内(针对omicron的gmt613对比针对野生型的gmt 1085)。ba.1和ba.4/5的中和作用(gmt 500-521)与ba.2的中合作用大致相似，并且相对于野生型毒株的降低显著(p＜0.05)，但也在约2倍范围内。针对sars-cov-1的gmt显著较低(p＜0.0001；比野生型低＞50倍)。

180、为了将针对具有omicron ba.1或ba.2突破性感染(mrna-vax3+ba.1和mrna-vax3+ba.2)的参考群组的mrna-vax3+ba.4/ba.5与未感染sars-cov-2的三重bnt162b2疫苗接种的个体(bnt162b23)进行比较，将voc pvn50gmt针对野生型毒株进行归一化，以允许评估中和光度，而不考虑抗体滴定度的大小，其在具有突破性感染的三重疫苗接种的个体与无感染的三重疫苗接种的个体之间出人意料地不同(参考文献16和21)。虽然bnt162b23血清介导了omicron ba.1和ba.2的大量交叉中和，但omicron ba.1和ba.2的突破性感染与相应同源毒株的较高交叉中和相关(图50(b))。与mrna-max3+ba.4/ba.5(gmt比率为0.57和0.48)相比，ba.2.12.1并且特别是ba.4/5的交叉中和在mrna-vax3+ba.1群组(gmt比率分别为0.43和0.18)中不太有效。在mrna-vax3+ba.2群组(gmt比率分别为0.53和0.37)中，ba.2.12.1和ba.4/5的交叉中和减少较少。出人意料地，在倒数情况下，omicron ba.1和ba.2的交叉中和在mrna-vax3+ba.4/ba.5群组(gmt比率分别为0.46和0.57)中保持在相对较高的水平。因此，ba.4/ba.5突破性感染在评估的所有群组的所有测试的voc(gmt比率≥0.46)之中导致最有效的交叉中和作用。

181、真实活sars-cov-2病毒中和化验在很大程度上证实了在图50(a)-(b)中所示的主要pvnt化验发现。omicron ba.4/ba.5突破血清中针对ba.2和ba.4的50％病毒中和(vn50)gmt与针对野生型毒株的相当(即，在1.5倍范围内)(图50(c))。ba.1中和作用的降低是显著的(p＜0.01)，但在2.5倍范围内。针对野生型毒株归一化的gmt显示mrna-vax3+ba.4/ba.5血清(gmt比率≥0.40)对omicron ba.1、ba.2和ba.4的强效交叉中和作用，而在mrna-vax3+ba.1(gmt比率0.20)和mrna-vax3+ba.2(gmt比率0.39)血清中，ba.4交叉中和作用的效率相当低(图50(d))(参考文献16和21)。因此，在pvnt和vnt化验系统中的发现表明，omicronba.4/ba.5突破性感染与针对所有测试的omicron亚系的广泛中和活性相关。

182、用omicron ba.4/ba.5s糖蛋白适应性mrna疫苗加强免疫在bnt162b2两重疫苗接种的小鼠中驱动泛omicron中和作用

183、在omicron ba.4/ba.5突破性感染后观察到的中和广度增强表明，与基于omicronba.1的疫苗相比，基于omicron ba.4/5s糖蛋白序列的变体适应性疫苗能够引发回忆反应与更广泛的交叉中和作用。为了测试这一假设，在bnt162b2预免疫小鼠中进行了加强剂研究(图49(b))。在第0天和第21天向小鼠施用初始系列的两次bnt162b2免疫，并且在第104天施用第三剂bnt162b2(1μg)或编码omicron ba.1或ba.4/ba.5s糖蛋白的bnt162b2来源的变体适应性疫苗(图54)。适应性疫苗作为编码omicron ba.1或ba.4/5s糖蛋白的单价疫苗(1μg)或包含bnt162b2和omicron ba.1或ba.4/5s糖蛋白适应性疫苗(各自0.5μg)的二价疫苗。bnt162b2和omicron适应性疫苗的相当rna纯度和完整性以及体外抗原表达得到了证实(图55(a)-(b))。

184、使用在加强剂之前(第104天，d3前)和加强剂之后第7、21和35天(d7d3、d21d3和d35d3)抽取的血清，在pvnt化验中测定了针对表达野生型毒株、omicron ba.1、ba.2、ba.2.12.1或ba.4/5s糖蛋白的假病毒的中和滴定度。使用活sars-cov-2中和试验作为正交试验系统，以证实所观察到的假病毒在d21d3和d35d3的加强后中和活性。

185、通过测定在d3前抽取的血清中sars-cov-2假病毒中和活性来评估小鼠的基线免疫。专用于各种加强剂的组的pvn50gmt是相当的，即在3倍差异的范围内(图56)。与针对野生型毒株的相比，针对omicron ba.1和ba.2的pvn50gmt低3至11倍(gmt比率≤0.32，图56(b))。针对ba.2.12.1和ba.4/5的gmt与针对野生型的相比低10至25倍(gmt比率≤0.10)。

186、在d7d3，中和gmt在各组之间且针对所有测试的变体均大幅增加(图57)，在d21d3达到峰值滴定度(图51)。在来自bnt162b2加强小鼠的血清中，观察到针对野生型毒株的强中和活性，而针对omicron变体的pvn50gmt明显较低(图51(a))。omicron ba.1加强剂导致对ba.1和野生型毒株的相当中和作用，而针对其余voc的pvn50gmt明显更低。特别地，针对ba.4/5的gmt与针对野生型的相比降低13倍。相比之下，施用ba.4/5加强剂针对所有omicron变体产生广泛中和活性，pvn50gmt与针对野生型毒株的相当(在1.5倍范围内)。来自接受了bnt162b2/ba.1二价加强剂的小鼠的血清具有针对野生型毒株的高pvn50gmt，和对omicron ba.1的强效中和作用，而针对ba.2及其后代菌株的gmt略微更低。bnt162b2/omicron ba.4/5二价加强剂产生针对野生型毒株的高滴定度，与bnt162b2单价加强剂相当。omicron中和作用在所有亚系中大致相当(在2倍范围内)，pvn50gmt略低于针对野生型毒株的。

187、为了定量第三剂疫苗变体对个体voc的中和作用的加强效应，评估了在d21d3检测到的pvn50gmt相对于施用第三剂前测定的基线gmt的倍数变化。bnt162b2相当地增加了所有测试的变体的中和作用(pvn50gmt比基线高6至10倍)，而检测到ba.1加强剂对同源voc的中和的最显著效应(增加26倍)(图51(b))。ba.4/5加强剂强烈增强针对ba.2.12.1和ba.4/5的中和活性(＞120倍)，并且还对ba.1和ba.2中和作用具有显著影响(分别增加34和37倍)。bnt162b2/ba.1和bnt162b2/ba.4/5二价疫苗分别显示与ba.1和ba.4/5单价疫苗相似的增强模式，尽管针对同源voc的中和作用较少聚焦的增加。

188、为了关于中和广度比较各组而不考虑大小，将voc pvn50gmt针对野生型毒株进行了归一化。gmt比率显示，omicron ba.4/5加化疫苗介导泛omicron中和作用(对于所有测试的变体≥0.65)(图51(c))。相比之下，ba.1加强疫苗有利于中和ba.1(gmt比率0.77)，而对于ba.2(0.39)且特别是对于ba.2.12.1和ba.4/5(≤0.16)而言的比率明显较低。二价bnt162b2/ba.4/5疫苗也介导广泛中和活性，与bnt162b2/ba.1二价疫苗相比，对ba.2、ba.2.12.1和ba.4/5的交叉中和作用增强，尽管gmt比率与ba.4/5单价疫苗相比较低(介于0.27与0.46之间)。

189、再次，真实活sars-cov-2病毒中和化验在很大程度上证实了在图51(a)-(c)中所示的主要pvnt化验发现。来自被施用ba.4/5加强剂剂量的小鼠的血清强效中和了所有测试的变体(图51(d))，从而证实了这种方法介导泛omicron中和作用的能力(gmt比率≥0.39)(图51(e))。虽然来自用bnt162b2/ba.4/5二价疫苗加强的小鼠的血清中omicron变体的中和作用与ba.4/5单价疫苗相比较低，但两种含有ba.4/5的疫苗表现出与bnt162b2/ba.1疫苗相比对omicron变体的更强交叉中和作用，并且与单价ba.1疫苗和bnt162b2相比甚至更强。

190、虽然与d21d3相比，在d7d3绝对滴定度略低，但omicron ba.4/5疫苗介导针对所有变体的相似中和活性(图57)。bnt162b2/ba.4/5二价加强剂介导了相当的中和广度(gmt比率≥0.35)，而来自所有其他加强剂组的血清表现出对ba.2、ba.2.12.1(和ba.4/5)的相当低的交叉中和作用。类似地，随后对d35d3血清的分析显示，与基线相比，通过ba.4/5疫苗加强剂显著增强针对omicron变体的中和活性，导致泛omicron中和作用(图58(a)-(c))。二价bnt162b2/ba.4/5加强剂在所有测试的变体中也表现出广泛中和作用，而ba.1和bnt162b2/ba.1疫苗表现出较低的交叉中和能力，尤其是针对ba.2.12.1和ba.4/5。类似地，在vnt化验中，与含有ba.1的疫苗和bnt162b2相比，来自用含有ba.4/5的疫苗加强的两个组的血清表现出对所有测试的omicron变体的明显更强的交叉中和作用(图58(d)-(e))。

191、这些小鼠加强剂结果与上述在ba.4/5突破性感染的人类中观察到的结果一致，并且进一步表明，在用基于野生型毒株的疫苗初次免疫后，使用omicron ba.4/5s糖蛋白适应性疫苗的加强剂可引发在广度上优于基于ba.1s糖蛋白的加强剂的泛omicron中和活性。

192、用omicron ba.4/ba.5s糖蛋白适应性mrna疫苗加强免疫在之前未疫苗接种的小鼠中驱动泛omicron中和作用

193、接下来，进行了实验，以更好地了解在没有针对sars-cov-2的预先存在的免疫反应的小鼠中用omicron适应性疫苗免疫后血清样本的中和能力。将未感染小鼠在第0天和第21天用bnt162b2、ba.1或ba.4/5s糖蛋白适应性单价疫苗或二价bnt162b2/ba.4/5疫苗免疫两次(图49(c))。使用在第二次免疫后14天(d14d2)抽取的血清，在pvnt化验中测定了针对表达野生型毒株s糖蛋白的假病毒、之前的vocalpha或delta或omicron ba.1、ba.2、ba.2.12.1或ba.4/5的假病毒的中和滴定度。在来自bnt162b2免疫小鼠的血清中，观察到针对野生型毒株的强中和活性。在这些血清中，还检测到针对alpha和delta的强效中和活性(在野生型的4倍范围内)，而针对omicron变体的pvn50gmt显著(14至37倍)低于野生型(图52)。用omicron ba.1单价疫苗免疫导致对ba.1的高度中和。在这些血清中，还检测到对omicron ba.2和ba.2.12.1的强效中和作用(在ba.1的3倍范围内)，而针对野生型毒株和其余voc的pvn50gmt显著(7至32倍)低于ba.1。用omicron ba.4/5单价疫苗免疫导致对ba.4/5的高度中和。在这些血清中，还检测到对omicron ba.2和ba.2.12.1的强效中和作用(在ba.4/5的2.5倍范围内)，而针对野生型毒株和其余voc的pvn50gmt显著(14至＞42倍)低于ba.4/5。用bnt162b2/ba.4/5二价疫苗免疫导致针对ba.4/5的高中和活性。与其他疫苗相比，在这些血清中还检测到针对野生型毒株和所有剩余voc的强效中和活性(在ba.4/5的6倍范围内)。

194、这些结果表明，在未感染动物(例如，之前未针对sars-cov-2给药和/或未感染sars-cov-2的动物)中，单价疫苗可主要以变体特异性方式诱发高中和性抗体反应，但在针对更远缘变体进行测试时可能丧失效力。相比之下，二价疫苗可在未感染动物中诱发强烈且广泛的中和性抗体反应。

195、论述

196、在本实施例中，三重mrna疫苗接种的个体的ba.4/ba.5突破性感染与所有当前或之前占主导地位的omicron亚变体的强效中和作用相关，即在ba.4/5突破患者中观察到泛omicron中和作用。这些发现与最近的报告一致，所述报告显示来自用bnt162b2或基于腺病毒的疫苗进行疫苗接种且随后ba.4突破性感染的个体的血清中omicron ba.1、ba.2以及beta和delta的强交叉中和作用(参考文献27)。与人类中的那些观察结果一致，在用bnt162b2初次免疫后接受omicron ba.4/5加强疫苗的小鼠血清中也观察到了泛omicron中和活性，而omicron ba.1加强针对ba.4/ba.5诱发显著降低的中和抗体滴定度。二价bnt162b2/ba.4/5加强引发广泛omicron中和作用，尽管不如ba.4/5单价加强剂那么明显。总之，这些发现进一步了解了突破性感染或呈单价或二价形式的适应于omicron voc的疫苗加强剂如何塑造免疫，并表明暴露于omicron ba.4/5s糖蛋白可赋予针对当前循环的和潜在的未来omicron亚系voc的增强的保护。发现用bnt162b2/ba.4/5二价疫苗对未感染小鼠进行免疫引发针对野生型毒株以及omicron和非omicron voc的强烈中和抗体反应，表明这种二价方法可为之前未感染sars-cov-2的未疫苗接种的个体(例如，年幼儿科患者)提供广泛保护，并且因此可特别适合于这些个体。

197、尽管当前批准的基于sars-cov-2野生型毒株的疫苗(如bnt162b2)已被证明在保护免受严重疾病方面有效(参考文献28-30)，但由于在抗原性上与野生型毒株远缘的新变体不断出现(参考文献16-18，20)，所以预防传播仍然是重大挑战。本实施例中描述的数据表明，与基于之前占主导地位的omicron亚系(如ba.1)的疫苗相比，单价或二价ba.4/ba.5s糖蛋白适应性加强疫苗(例如，本文所述的单价或二价疫苗)可赋予针对高度流行的ba.4和ba.5voc的更高益处。鉴于它们在世界上许多地区的主导地位和它们的高传播性(参见例如，参考文献8，10，11和13)，有可能将从omicron ba.4或ba.5中产生具有进一步生长优势的新变体，所述新变体保留对ba.4/ba.5适应性疫苗的部分或全部敏感性。因此用基于omicron ba.4/5s糖蛋白的适应性疫苗加强预先存在的免疫可能代表应对当前大流行情况的一种合适策略，而密切监测病毒进化和流行病学情形仍然有助于指导响应于新出现的威胁的潜在进一步疫苗适应。

198、材料和方法

199、人类研究设计、参与者募集和样本采集

200、在本实施例中描述的研究的目的是研究omicron ba.4/ba.5突破性感染对人血清的交叉变体中和能力的影响。中和活性在来自三重mrna(bnt162b2/mrna-1273)疫苗接种且具有证实的后续sars-cov-2突破性感染的个体的免疫血清中进行评估，所述突破性感染在德国在omicron ba.4/ba.5谱系占主导地位的一段时间内(2022年6月中旬至7月中旬)发生；或通过基因组测序(mrna-vax3+ba.4/5)变体证实(ba.4或ba.5)(图53)。将中和活性与来自三重mrna疫苗接种且具有证实的在omicron ba.2谱系占主导地位的一段时间(2022年3月至5月；mrna-vax3+ba.2)、在德国omicron ba.1谱系占主导地位的一段时间(2021年11月至2022年1月中旬；mrna-vax3+ba.1)(参考文献1，2)内的后续sars-cov-2突破性感染的个体和在样本采集时未感染sars-cov-2(核衣壳血清反应阴性)的三重bnt162b2疫苗接种的个体(bnt162b23)的免疫血清中的中和活性进行比较。使用假病毒和活sars-cov-2中和化验表征血清中和能力。参考群组mrna-vax3+ba.2、mrna-vax3+ba.1和bnt162b23的数据之前已公开(参考文献16，21)。

201、来自mrna-vax3+omi ba.4/5、mrna-vax3+omi ba.2和mrna-vax3+ba.1群组的参与者是从法兰克福歌德大学(goethe university frankfurt)的大学医院募集的，作为已在接种covid-19疫苗之后经历omicron突破性感染的非干预研究(由大学医院伦理委员会批准的方案[编号：2021-560])探究性患者的一部分。来自bnt162b23群组的个体提供了知情同意书作为他们参与2期试验bnt162-17(nct05004181)的一部分。

202、本研究中5例ba.4/5和4例ba.1恢复期参与者的感染通过基因组测序证实(参考文献16)。

203、所有参与者在疫苗接种前均无记录的sars-cov-2感染史。参与者在采血时没有症状。

204、通过在2000x g下将抽取的血液离心10分钟来分离出血清，并冷冻保存直至使用。

205、rna的体外转录和脂质-纳米颗粒(lnp)制剂

206、bnt162b2疫苗在来自sars-cov-2分离株mn908947-hu-1(genbank：mn908947.3)的具有融合前构像稳定k986p和v987p突变的s序列的背景下设计。omicron ba.1和omicronba.4/5疫苗候选物是基于包括如图54所示的序列变化的bnt162b2设计的。rna产生以及配制如在其他地方所描述进行(参见例如，参考文献32，其内容以引用的方式整体并入本文)。简言之，将dna模板克隆到质粒载体中，通过pcr扩增并进行纯化，所述质粒载体具有通过接头(a30la70，10个核苷酸)中断以提高rna稳定性和翻译效率的主链序列元件(t7启动子，5′和3′utr，100个核苷酸的聚(a)尾)(参见例如，参考文献33，34)。在三核苷酸cap1类似物((m27，3’-o)gppp(m2’-o)apg；trilink)存在下并且在n1-甲基假尿苷-5′-三磷酸(m1ψtp；thermo fisher scientific)替代尿苷-5′-三磷酸(utp)的情况下通过t7rna聚合酶在体外转录rna(参考文献35)。使用磁性粒子纯化rna(参考文献36)，并且通过微流体毛细管电泳(agilent 2100生物分析仪)评估rna完整性，并且所有三种rna都显示出单一尖峰，产生相当且较高的纯度以及完整性(图55(a))。此外，测定了溶液的浓度、ph值、渗透压、内毒素水平和生物负荷。

207、一种可电离脂质((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)、两种结构脂质(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱[dspc]和胆固醇)和一种聚乙二醇化脂质(2-[(聚乙二醇)-2000]-n，n-二十四烷基乙酰胺)被用于rna的配制。在通过透析转移到水性缓冲液系统中后，对lnp组成进行分析，确保但不限于高rna完整性和包封功效以及小于100nm的粒度。将疫苗候选物以0.5mg/ml的浓度储存在-70℃至-80℃直至使用时间点。

208、rna和疫苗的体外表达

209、根据制造商的说明书使用ribojuicetm mrna转染试剂盒(merck millipore)用0.15μgbnt162b2或omicron适应性疫苗(脂质-纳米颗粒配制的)或用疫苗rna转染hek293t细胞，并且孵育18小时。将经转染的hek293t细胞用可固定活力染料(ebioscience)染色，并与mfc标记的重组人ace-2(sino biological)一起孵育。与af647缀合的第二驴抗小鼠抗体用于检测表面表达。在使用facscelesta流式细胞仪(bd biosciences，bd facsdiva软件版本8.0.1)和flowjo软件版本10.6.2(flowjo，bd biosciences)进行流式细胞术分析之前将细胞固定(固定缓冲液，biolegend)。

210、小鼠研究

211、所有小鼠研究都在biontech se进行，并且方案由地方当局(当地福利委员会)批准，并根据欧洲实验室动物科学协会联合会的建议进行。研究执行和圈养符合德国动物福利法和指令2010/63/eu。将小鼠保持在12小时明/暗周期的单独通风笼、受控的环境条件(22℃±2℃，45％至65％相对湿度)和无特定病原体的条件下。任意提供食物和水。仅选择健康状况良好的小鼠进行测试程序。

212、对于免疫，将雌性balb/c小鼠(janvier)(9-21周龄)随机分配到组。将bnt162b2和基于omicron的疫苗候选物在0.9％nacl中稀释，并且在异氟烷麻醉下以20μl的体积将1μg的疫苗候选物注射到腓肠肌中。对于小鼠加强剂研究，将小鼠用bnt162b2免疫两次(第0天和第21天)。用bnt162b2和基于omicron的疫苗候选物进行第三次免疫在研究开始后第104天进行，并且小鼠在第三次免疫前不久且如图49所指示放血。对于未感染小鼠研究，将动物在第0天和第21天用bnt162b2和基于omicron的疫苗候选物进行免疫。第二次免疫后14天，抽血。在无麻醉的情况下从颜面静脉采集外周血。最终放血在异氟烷麻醉下从眶后静脉丛进行。对于血清生成，将血液在16，000g下离心5分钟，并且将血清立即用于下游化验或保存在-20℃，直到使用时间点。

213、vsv-sars-cov-2s变体假病毒产生

214、根据公开的假型化方案(例如，如参考文献3中所述，其内容以引用的方式整体并入本文)用sars-cov-1s糖蛋白(uniprot参考：p59594)和用源自以下各项的sars-cov-2s糖蛋白对编码绿色荧光蛋白(gfp)和荧光素酶而不是vsv-糖蛋白(vsv-g)的重组复制缺陷型水疱性口炎病毒(vsv)载体进行假型化：野生型毒株(mn908947-hu-1，ncbi参考：43740568)、alpha变体(改变：δ69/70、δ144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h)、delta变体(改变：t19r、g142d、e156g、δ157/158、k417n、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n)、omicron ba.1变体(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、1478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f)、omicron ba.2变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)、omicron ba.2.12.1变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452q、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、s704l、n764k、d796y、q954h、n969k)和omicronba.4/5变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)。sars-cov-2s糖蛋白改变的图解示于图32中，并且omicron亚系中s糖蛋白改变的单独比对展示于图33中。

215、简言之，将在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs[sigma-aldrich])的杜氏改良伊氏培养基(dmem)加上glutamaxtm(gibco)(称为培养基)中培养的hek293t/17单层(crl-11268tm)按照制造商的说明书用桑格测序验证的sars-cov-1或变体特异性sars-cov-2s表达质粒加上lipofectamine ltx(lifetechnologies)转染。在转染后24小时，用vsv-g补充型vsvδg载体以3的感染复数(moi)感染细胞。在37℃和7.5％co2下孵育2小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，然后添加补充有抗vsv-g抗体(克隆8g5f11，kerafastinc.)的培养基以中和残余vsv-g补充型输入病毒。在接种后20小时收获含有vsv-sars-cov-2-s假型的培养基，使其通过0.2μm过滤器(nalgene)并储存在-80℃。用培养于培养基中的vero 76细胞(crl-1587tm)来滴定各批假病毒。将由对应于每毫升200个转导单位(tu)的感染滴定度的确定体积的sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次诱发的相对荧光素酶单位用作对照者，所述sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次以前在muik等人，2021(参考文献31)中进行了描述。计算各批sars-cov-2变体假病毒的输入体积以基于相对荧光素酶单位相对于参考物来对感染滴定度进行归一化。

216、假病毒中和化验

217、在化验前4小时，将vero 76细胞以40,000个细胞/孔接种于96孔白色平底板(thermo scientific)中的培养基中，并在37℃和7.5％co2下进行培养。将人类和小鼠血清样本以在1∶5至1∶30，720(人类血清)、对于小鼠加强剂研究1∶40至1∶102，400(小鼠血清；起始稀释度为1∶40[d3前]，1∶200[d7d3])以及1∶100[d21d3，d35d3])范围内的稀释度在培养基中和在未感染环境中(小鼠血清；单价疫苗接种组开始稀释度1∶120至1∶15，360，和二价疫苗接种组开始稀释度1∶100)2倍连续稀释。将vsv-sars-cov-2-s/vsv-sars-cov-1-s粒子在培养基中进行稀释以在化验中获得200个tu。将血清稀释液与假病毒(n＝每种血清每种假病毒2个技术性重复)在室温下1∶1混合30分钟，然后添加至vero 76细胞单层中，并在37℃和7.5％co2下孵育24小时。移除上清液，并用荧光素酶试剂(promega)裂解细胞。在plus酶标仪(bmg labtech)上记录发光，并且中和滴定度被计算为仍然导致发光减少50％的最高血清稀释度的倒数。所有假病毒中和实验的结果都用重复实验的几何平均滴定度(gmt)表示。如果未观察到中和作用，则报告检出限[lod]一半的任意滴定度值。提供了人类血清中的中和滴定度的表。

218、活sars-cov-2中和化验

219、在意大利锡耶纳的vismederi s.r.1.通过基于细胞病变效应(cpe)的微中和化验确定sars-cov-2病毒中和滴定度。简言之，将人类和小鼠血清样本1∶2连续稀释(n＝每种血清每种病毒2个技术性重复；对于人类样本从1∶10开始，并且对于鼠类样本从1∶100[加强后，第125天]或1∶50[加强后，第139天]开始)，并且在37℃下与100tcid50的活野生型样sars-cov-2病毒株2019-ncov/意大利-inmi1(genbank：mt066156)、omicron ba.1株hcov-19/比利时/rega-20174/2021(改变：a67v、δ69/70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k、l981f)、经序列验证的omicron ba.2株(改变：t19i、δ24-26、a27s、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、r682w、n764k、d796y、q954h、n969k)或经序列验证的omicron ba.4株(改变：v3g、t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)一起孵育1小时以允许任何抗原特异性抗体与病毒结合。s糖蛋白改变的图解在图48中示出。2019-ncov/意大利-inmi1株s糖蛋白的序列与野生型sars-cov-2s(mn908947-hu-1分离株)是同一的。将vero e6(crl-1586tm)细胞单层与血清/病毒混合物接种在96孔板中，并孵育3天(2019-ncov/意大利-inmi1株)或4天(omicron ba.1、ba.2和ba.4变体株)，以允许非中和病毒感染。在倒置光学显微镜下观察所述板，并将孔评分为对sars-cov-2感染呈阳性(即，显示cpe)或对sars-cov-2感染呈阴性(即，细胞存活而无cpe)。中和滴定度被确定为保护超过50％的细胞免受cpe的最高血清稀释度的倒数，并报告为重复实验的gmt。如果未观察到中和作用，则报告5[lod的一半]的任意滴定度值。

220、统计分析

221、用于分析抗体滴定度的统计聚合方法为几何平均值且对于sars-cov-2voc滴定度和野生型毒株滴定度的比率来说为几何平均值和相应95％置信区间。几何平均值的使用解释了跨越几个数量级的抗体滴定度的非正态分布。使用对多重比较作出邓恩校正的弗里德曼试验在共同的对照组下对成组几何平均中和抗体滴定度进行成对符号秩检验。使用spearman相关性来评价非正态分布数据集之间的单调关系。使用graphpad prism软件版本9进行所有统计分析。

222、实施例18的参考文献

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259、实施例19：ba.4/ba.5突破性感染对omicron免疫反应的影响

260、本实施例19为实施例14、17和18的扩展，并且描述了分析从ba.1-、ba.2-和ba.4/5-突破病例采集的血清样本针对omicron ba.4、ba.5、ba.4.6、bf.7和ba.2.75变体的中和活性的实验。除了证实前面实施例中所描述的结果以外，本实施例19还提供了对由ba.1-、ba.2-和ba.4/5-突破性感染诱发的抗体反应与ba.4.6、bf.7和ba.2.75变体有关的进一步表征。本实施例进一步证明：ba.4/5突破性感染与ba.1-和ba.2-突破性感染相比可产生更广泛的中和反应，与ba.1-和ba.2-突破性感染相比针对ba.4/5和ba.4.6/bf.7变体诱发的中和滴定度更优，并且与针对ba.2.75病毒的中和滴定度相当。

261、sars-cov-2omicron变体的持续进化导致出现具有不同中和抗体逃避模式的众多亚系。最近出现的亚系ba.4.6、bf.7和ba.2.75因为它们在很多区域流行缓慢但稳步增加而引起了关注。本实施例研究了在后来突破性感染ba.1、ba.2或ba.4/ba.5sars-cov-2变体的covid-19mrna三重疫苗接种的个体的免疫血清中针对这些omicron亚系以及目前占主导地位的ba.4/ba.5的中和活性。还测试了来自未感染sars-cov-2的三重或四重mrna疫苗接种的个体的血清。来自ba.1、ba.2和ba.4/ba.5恢复期的血清相对于sars-cov-2野生型毒株来说在其交叉中和ba.2.75的能力方面大致相当。在ba.4/ba.5恢复期血清中检测出对omicron ba.4.6/bf.7的最强交叉中和作用。这些发现表明最近的omicron亚系的突破性感染可赋予至少部分的保护作用免受新出现的亚系感染，并且提供的进一步证据支持ba.4/5-特异性疫苗的功效(特别地，进一步证明ba.4/5-特异性疫苗可提供针对omciron变体的广泛免疫反应)。

262、sars-cov-2omicron关注变体(voc)在其刺突(s)糖蛋白中含有超过30个氨基酸改变，所述改变介导以前建立的免疫的部分逃逸。因此，在接种疫苗的群体之间与以前循环的voc相比，omicron的突破性感染已更加频繁。自从在2021年11月首次出现omicron以来，亚系ba.1、ba.2、ba.4和ba.5在大流行情形中连续地占据了主导地位。虽然自2022年年中以来ba.5一直是全球占主导地位的亚系，但病毒进化继续产生新的亚系，所述新的亚系在其s糖蛋白中具有额外的氨基酸改变。各大洲的许多国家都报道了以前的omicron亚系的后代流行缓慢但稳步增加。这些后代包括omicron ba.2.75、ba.4.6和bf.7，它们分别来自ba.2、ba.4和ba.5。

263、omicron ba.2.75在s蛋白的n末端结构域(ntd)内含有五个氨基酸改变，这使其有别于以前的omicron关注变体(voc)，包括其亲本亚系ba.2(图60)。另外，ba.2.75在其受体结合结构域(rbd)中具有三个在ba.2中不存在的改变，其中g446s与ba.1共享。最流行的omicron毒株ba.4.6和bf.7具有同一的s糖蛋白序列，所述s糖蛋白序列显示与其相应的亲本谱系ba.4和ba.5高度相似，所述亲本谱系还共享它们的s糖蛋白序列。在rbd内的单个r346t改变使ba.4.6/bf.7与ba.4/ba.5区分开来，并消除了治疗性单克隆抗体(mab)西加韦单抗(cilgavimab)的中和作用(参考文献1)。西加韦单抗与替沙格韦单抗(tixagevimab)的组合(evusheldtm)与免疫受损患者中的暴露前covid-19预防具有高度临床相关性，鉴于替沙格韦单抗缺乏针对omicron ba.4/ba.5及其后代的中和活性，预期所述组合对omicronba.4.6和bf.7无效(参考文献1和2)。

264、在世界许多地方的初级sars-cov-2免疫是基于感染原始野生型病毒或基于野生型毒株的疫苗，诸如mrna疫苗bnt162b2和mrna-1273。免疫反应通常通过突破性感染抗原性不同的omicron亚系病毒或最近授权的omicron适应性疫苗加强剂而进一步形成。一个重要问题是突破性感染和omicron适应性疫苗加强剂是否会引发针对最近出现且目前势头正猛的omicron亚系的大量中和抗体反应。

265、本实施例研究了从五组个体分离的免疫血清针对omicron ba.4.6/bf.7和ba.2.75的中和活性，所述五组个体接受了三个或四个剂量的mrna covid-19疫苗(bnt162b2/mrna-1273同源或异源方案)，有或无后续omicron亚系变体突破性感染。个体群组为bnt162b2三重疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体(bnt162b23；n＝18)、bnt162b2四重疫苗接种的未感染sars-cov-2的老年个体(bnt162b24；n＝15)以及三重mrna疫苗接种且经历突破性感染omicron ba.1(mrna-vax3+ba.1；n＝14)、ba.2(mrna-vax3+ba.2，n＝19)或ba.4/ba.5(mrna-vax3+ba.4/ba.5，n＝17)的个体(图61)。鉴于当地卫生当局向老年个体建议接种第四剂疫苗且与以前的变体相比omicron突破性感染的频率很高，研究设计包括被认为代表一大部分欧洲和北美群体的群组。在充分表征的假病毒中和试验(pvnt)(参考文献3-5)中通过用具有sars-cov-2野生型毒株或omicron ba.4/ba.5(ba.4和ba.5的s糖蛋白序列是同一的)、ba.4.6/bf.7(ba.4.6和bf.7的s糖蛋白序列是同一的)或ba.2.75的s糖蛋白的假病毒确定50％假病毒中和(pvn50)几何平均滴定度(gmt)来测试血清中和活性。

266、在bnt162b23、bnt162b24和mrna-vax3+ba.1群组中，针对omicron ba.4/ba.5的pvn50滴定度显著低于针对野生型毒株的滴定度(gmt降低5倍至6倍)(图59(a))。在mrna-vax3+ba.2和mrna-vax3+ba.4/ba.5群组中ba.4/ba.5中和作用的降低与其他群组中相比也在统计上显著但不太明显(gmt与野生型相比低2倍至3倍)。在mrna-vax3+ba.2中，与ba.4/ba.5相比，针对omicron ba.4.6/bf.7的pvn50滴定度进一步显著降低(gmt 239对比386；p＜0.05)。还在bnt162b24中观察到相对于ba.4/ba.5来说ba.4.6/bf.7中和的降低相当大但在统计学上并不显著(gmt 55对比121)。在所有其他群组中，omicron ba.4.6/bf.7gmt在很大程度上与针对omicron ba.4/ba.5的gmt相当并且mrna-vax3+ba.4/ba.5中的滴定度最强效(gmt 443)。在mrna-vax3+ba.4/ba.5中，针对ba.2.75的滴定度与ba.4/ba.5相比降低1.8倍(gmt 295对比521)，而在mrna-vax3+ba.1中，针对ba.2.75的中和gmt与针对ba.4/ba.5的中和gmt相比甚至增加了2倍(gmt 525对比263)。在其他群组中针对ba.2.75的滴定度与针对ba.4/5的滴定度相当。

267、为了允许评估中和广度而不考虑抗体滴定度的大小，将omicron亚系pvn50gmt针对野生型毒株进行了归一化。在bnt162b23和bnt162b24群组中所有omicron亚变体假病毒的gmt比率类似(所有假病毒的比率≤0.22，图59(b))，这表明尽管抗体滴定度总体略有增加，但第四剂bnt162b2并未改善所测试的亚变体的交叉中和作用。与bnt162b23相比，在来自mrna-vax3+ba.2的血清中ba.4/ba.5和ba.4.6/bf.7的交叉中和显著(p＜0.05)更强(对于ba.4/ba.5，gmt比率0.37对比0.17；且对于ba.4.6/bf.7，0.23对比0.12)。在mrna-vax3+ba.4/ba.5群组中对于ba.4/ba.5假病毒(gmt比率0.48，p＜0.01，对比bnt162b23)和ba.4.6/bf.7假病毒(0.41，p＜0.0001)两者来说gmt比率甚至更高。omicron ba.2.75假病毒的交叉中和在大多数群组中大致相当，仅在mrna-vax3+ba.1中与bnt162b23相比观察到有显著(p＜0.05)增加。

268、发现在接种疫苗的个体和ba.2恢复期的血清中针对omicron ba.4.6/bf.7的中和活性与ba.4/ba.5相比进一步降低，这表明：r346t改变介导多克隆血清中中和抗体的进一步逃逸。在omicron ba.4.6，bf.7和其他目前不太流行的毒株中在此位点的rbd的趋同进化(参考文献1)指示由此产生的免疫逃逸可能赋予相当大的生长优势。此处总结的发现指示omicron ba.4/ba.5突破性感染重新聚焦中和抗体反应，以部分恢复ba.4.6/bf.7中和作用。如在实施例18中所展示，在ba.4/ba.5突破性感染的人和用omicron ba.4/5适应性疫苗加强的小鼠中也观察到omicron谱系的类似交叉中和模式。因此，这样的发现提供了证据支持omicron ba.4/5适应性疫苗加强剂也可在人类中引发针对ba.4.6/bf.7的相关中和抗体反应。

269、omicron ba.2.75的交叉中和与ba.4/5的交叉中和大致相当的观察结果与之前的报道一致(参考文献2、6和7)。不希望受特定理论束缚，这项观察结果表明ba.2.75相较于ba.5的生长优势可能与除免疫逃避以外的的因素有关。例如，在一些实施方案中，omicronba.2.75和ba.4/ba.5对ba.1和ba.4/ba.5恢复期血清中和的易感性的微小差异可能指向在免疫逃避中具有潜在的环境依赖性作用的氨基酸改变。

270、本实施例中所总结的研究结果集中于新的omicron亚系ba.4.6/bf.7和ba.2.75的中和，因为这些亚系在将来可能会根据它们目前的轨迹取代ba.5。omicron突破性感染与新亚系的交叉中和作用增强相关的发现与前面实施例中所提供的数据一致，所述数据显示增强的中和广度，包括针对早期omicron亚系和以前的sars-cov-2voc。这些发现共同显示omicron ba.4/ba.5突破性感染与针对所有变体，包括omicron亚系最广泛的中和相关，提供了证据支持用编码包含为ba.4/5变体所特有的突变的sars-cov-2s蛋白的rna疫苗接种可产生广泛中和反应。

271、材料和方法

272、研究设计、参与者募集和样本采集

273、本研究的目的在于研究与sars-cov-2野生型和omicron ba.4/ba.5相比，五组不同的血清针对omicron ba.4.6/bf.7和ba.2.75亚系的交叉中和活性。在来自以下各项的免疫血清中评估中和活性：(i)未感染sars-cov-2的三重bnt162b2疫苗接种的年轻成人个体(bnt162b23)；(ii)未感染sars-cov-2的四重bnt162b2疫苗接种的年长成人个体(bnt162b24)和三重mrna(bnt162b2/mrna-1273)疫苗接种的个体，其中被证实的后续sars-cov-2突破性感染发生(iii)在omicron ba.1谱系占主导地位的一段时间内(2021年11月到2022年1月中旬；mrna-vax3+ba.1)、(iv)在omicron ba.2谱系占主导地位的一段时间内(2022年3月至5月；mrna-vax3+ba.2)或(v)在omicron ba.4/ba.5谱系占主导地位的一段时间内，德国(2022年6月中旬至7月中旬；mrna-vax3+ba.4/5)。使用假病毒中和化验表征血清中和能力。群组bnt162b23、mrna-vax3+ba.1、mrna-vax3+ba.2、mrna-vax3+ba.4/5的sars-cov-2野生型和omicron ba.4/ba.5中和数据以前已有公开。

274、来自mrna-vax3+omi ba.1、mrna-vax3+omi ba.2和mrna-vax3+ba.4/5群组的参与者是从法兰克福歌德大学(goethe university frankfurt)的大学医院募集的，作为已在接种covid-19疫苗之后经历omicron突破性感染的非干预研究(由大学医院伦理委员会批准的方案[编号：2021-560])探究性患者的一部分。来自bnt162b23和bnt162b24群组的个体分别提供了知情同意书作为他们参与2期试验bnt162-17(nct05004181)和bnt162-16子研究f(nct04955626)的一部分。所有参与者在疫苗接种前均无记录的sars-cov-2感染史。参与者在采血时没有症状。

275、通过在2000x g下将抽取的血液离心10分钟来分离出血清，并冷冻保存直至使用。

276、根据公开的假型化方案(berger rentsch，marianne，和gert zimmer.″avesicular stomatitis virus replicon-based bioassay for the rapid andsensitive determination of multi-species type i interferon.″plos one 6.10(2011)：e25858)用sars-cov-1s糖蛋白(uniprot参考：p59594)或用源自以下各项的sars-cov-2s糖蛋白对编码绿色荧光蛋白(gfp)和荧光素酶而不是vsv-糖蛋白(vsv-g)的重组复制缺陷型水疱性口炎病毒(vsv)载体进行假型化：野生型毒株(mn908947-hu-1，ncbi参考：43740568)、omicron ba.4/ba.5变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)、omicron ba.4.6/bf.7变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)和omicron ba.2.75变体(改变：t19i、δ24-26、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k)。sars-cov-2s糖蛋白改变的图解示于图62中，并且omicronvoc中s糖蛋白改变的单独比对展示于图60中。

277、简言之，将在补充有10％热灭活胎牛血清(fbs[sigma-aldrich])的杜氏改良伊氏培养基(dmem)加上glutamaxtm(gibco)(称为培养基)中培养的hek293t/17单层(crl-11268tm)按照制造商的说明书用桑格测序验证的变体特异性sars-cov-2s表达质粒加上lipofectamine ltx(life technologies)转染。在转染后24小时，用vsv-g补充型vsvδg载体以3的感染复数(moi)感染细胞。在37℃和7.5％co2下孵育2小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，然后添加补充有抗vsv-g抗体(克隆8g5f11，kerafast inc.)的培养基以中和残余vsv-g补充型输入病毒。在接种后20小时收获含有vsv-sars-cov-2-s假型的培养基，使其通过0.2μm过滤器(nalgene)并储存在-80℃。用培养于培养基中的vero 76细胞(crl-1587tm)来滴定各批假病毒。将由对应于每毫升200个转导单位(tu)的感染滴定度的确定体积的sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次诱发的相对荧光素酶单位用作对照者，所述sars-cov-2野生型毒株s糖蛋白假病毒参考批次以前在muik等人，2021(muik，alexander，等人″neutralization of sars-cov-2lineageb.1.1.7pseudovirus by bnt 162b2vaccine-elicited human sera.″science 371.6534(2021)：1152-1153)中进行了描述。计算各批sars-cov-2变体假病毒的输入体积以基于相对荧光素酶单位相对于参考物来对感染滴定度进行归一化。

278、假病毒中和化验

279、在化验前4小时，将vero 76细胞以40,000个细胞/孔接种于96孔白色平底板(thermo scientific)中的培养基中，并在37℃和7.5％co2下进行培养。将人血清样本在培养基中进行2倍连续稀释，稀释度范围为1∶10至1∶10,240。将vsv-sars-cov-2-s粒子在培养基中进行稀释以在化验中获得200个tu。将血清稀释液与假病毒(n＝每种血清每种假病毒2个技术性重复)在室温下1∶1混合30分钟，然后添加至vero 76细胞单层中，并在37℃和7.5％co2下孵育24小时。移除上清液，并用荧光素酶试剂(promega)裂解细胞。在plus酶标仪(bmg labtech)上记录发光，并且中和滴定度被计算为仍然导致发光减少50％的最高血清稀释度的倒数。所有假病毒中和实验的结果都用重复实验的几何平均滴定度(gmt)表示。如果未观察到中和作用，则报告检出限[lod]一半的任意滴定度值。

280、统计分析

281、用于分析抗体滴定度的统计聚合方法为几何平均值且对于sars-cov-2voc滴定度和野生型毒株滴定度的比率来说为几何平均值和相应95％置信区间。几何平均值的使用解释了跨越几个数量级的抗体滴定度的非正态分布。使用对多重比较作出邓恩校正的弗里德曼试验在共同的对照组下对成组几何平均中和抗体滴定度进行成对符号秩检验。使用对多重比较作出邓恩校正的克鲁斯卡尔-沃利斯检验(kruskal-wallis test)来对成组gmt比率进行未配对符号秩检验(unpaired signed-rank test)。使用graphpad prism软件版本9进行所有统计分析。

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326、实施例20：证实包括omicron ba.4/5-特异性疫苗的加强剂量可导致针对omicronba.4/5变体的强烈免疫反应的临床试验结果

327、本实施例提供临床试验数据来证实：ba.4/5-特异性疫苗(例如，如本文所述的二价rna疫苗，所述二价rna疫苗包含编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的第一rna以及编码包含为ba.4/5 omicron变体所特有的一个或多个突变的sars-cov-2 s蛋白的第二rna)可在受试者中导致强烈免疫反应。具体来说，本实施例提供数据来证明：这种rna疫苗可导致针对ba.4/5变体的免疫反应(例如，中和抗体滴定度)高于由编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的rna疫苗导致的免疫反应。这些结果证实了由前面实施例中所描述的ba.4/5-突破性感染数据和小鼠实验数据所提供的关于施用ba.4/5-特异性疫苗(例如，本文所述的疫苗)的好处的见解。

328、本实施例提供的免疫反应数据来自2/3期临床试验，其中向以前已经接受过三个剂量的编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的rna疫苗(例如，bnt162b2)的18岁至55岁的个体(n＝38)和超过55岁的那些个体(n＝36)施用30-μg加强剂量的omicron ba.4/ba.5-适应性二价covid-19疫苗(包含15μg编码mn908947变体的全长sars-cov-2 s蛋白的rna，例如，在一些实施方案中为包含与seq id no：20至少95％或更高(包括并且高达100％)同一的核苷酸序列的rna(例如，在一些实施方案中，为bnt 162b2)；以及15μg编码包含为omicron ba.4/ba.5所特有的一个或多个突变的全长sars-cov-2 s蛋白的rna，例如，在一些实施方案中为包含与seq id no：72至少95％或更高(包括并且高达100％)同一的核苷酸序列的rna)。向一组作为比较者的超过55岁的参与者(n＝40)施用30-μg加强剂量(作为第四剂量)的编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的rna疫苗。在本实施例中，已施用了如本文所述的二价疫苗的受试者在施用二价疫苗之前平均11个月接受其最后一剂编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的疫苗，而已施用了编码mn908947毒株的sars-cov-2蛋白的rna疫苗，例如bnt162b2(作为第四剂量)的受试者平均在6个月前接受了其第三剂。尽管存在这种差异，但在两组中的加强前抗体滴定度是相似的。两组均包括先前有sars-cov-2感染迹象的受试者和先前无sars-cov-2感染迹象的受试者。

329、在被施用omicron ba.4/ba.5-特异性二价疫苗的受试者之间，观察到，与加强剂前的水平相比，omicron ba.4/ba.5-中和抗体滴定度的明显较高增加。对于被施用二价疫苗的18岁至55岁的个体，针对omicron ba.4/ba.5的几何平均滴定度(gmt)为约600(例如，606)，这比加强剂前的水平高9.5倍(95％ci：6.7，13.6)。对于被施用ba.4/5二价疫苗的超过55岁的个体，gmt为约900(例如，896)，这比加强剂前的水平高13.2倍(95％ci：8.0，21.6)。相比之下，对接受了30-μg加强剂量的编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的rna疫苗的超过55岁的参与者观察到，在加强剂之后1个月所测量，针对omicron ba.4/ba.5的中和抗体反应较低。对于这些参与者，gmt为约230(例如，236)，表示比加强剂前的水平高2.9倍(95％ci：2.1，3.9)。在临床试验中对二价疫苗观察到的安全概况是有利的，并且与bnt162b2一致。

330、另外，当检验先前有和无sars-cov-2感染迹象的受试者群体时，在两个群体中都观察到在加强剂量的二价疫苗之后针对omicron ba.4/ba.5的中和抗体有所增加，这证明：不管先前感染状况如何，ba.4/5-二价疫苗均可在接受这种疫苗的受试者中改善保护作用。

331、实施例21：用二价ba.4/5疫苗改善对omicron ba.4/5、ba.4.6、ba.2.75.2、bq.1.1以及xbb.1的中和作用

332、本实施例提供进一步的数据来证明：与编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的单价rna疫苗相比，包含编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的rna和编码包含为ba.4/5omicron变体所特有的一个或多个突变的sars-cov-2 s蛋白的rna的二价rna疫苗(例如本文所述的二价疫苗)可提供改善的免疫反应。例如，在一些实施方案中，这种改善的免疫反应包括针对一个或多个，包括两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个sars-cov-2关注变体的中和滴定度增大。在一些实施方案中，这种改善的免疫反应包括针对一个或多个，包括两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个omicron关注变体的中和滴定度增大。在一些实施方案中，这种改善的免疫反应包括：与对编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的单价rna疫苗所观察到的相比，针对大量omicron关注变体的中和滴定度增大。

333、特别地，本实施例提供数据来证明：当以第四剂量加强剂施用时，与编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的单价rna疫苗相比，这种二价疫苗可诱发针对由ba.5衍生的亚系(例如，ba.4.6、bq.1.1和xbb.1)以及由ba.2衍生的亚系(例如，ba.2.75.2)有所改善的免疫反应(例如，在一些实施方案中更高的中和反应)。本实施例还提供数据来证明：相对于未曾感染过sars-cov-2的受试者来说，具有sars-cov-2感染史的受试者(例如，以前有或者目前有sars-cov-2感染的受试者)在施用第四加强剂量(例如，单价或二价疫苗)之后，可显现更高的免疫反应(例如，更高的中和滴定度)。本实施例证明：无论sars-cov-2感染史如何，与编码mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的单价rna疫苗相比，ba.4/5二价疫苗可诱发改善的免疫反应(例如，改善的中和反应)。本实施例还提供数据来证明：相对于mn908947单价疫苗来说，由ba.4/5二价疫苗提供的针对某些omicron亚系(例如，本文所测试的omicron亚系)的免疫反应在以前未曾感染过sars-cov-2的受试者中与以前感染过sars-cov-2的受试者相比，改善程度更大。

334、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)omicron变体自2021年11月出现以来已经在全球范围内不断演变为许多亚系。为了缓解持续进行中的omicron大流行，美国fda授权在2022年9月紧急使用二价ba.4/5-疫苗。美国fda授权的二价疫苗含有两种mrna：一种编码原始(mn908947)sars-cov-2刺突蛋白(bnt162b2)，且另一种编码包含为omicronba.4/5变体所特有的突变(在一些实施方案中包含seq id no：69的氨基酸序列且在一些实施方案中包含seq id no：72的氨基酸序列)的sars-cov-2 s蛋白。自美国fda批准以来，已经出现新型omicron ba.2-和ba.5-派生亚系(例如，ba.4.6、ba.2.75.2、bq.1.1和xbb.1)并且已经成为流行(https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions)。尽管早期流行病学数据表明疾病严重程度没有增加，但这些新型亚系已经积聚了额外的刺突突变，这些突变可能进一步逃避疫苗-和/或感染引发的抗体中和作用(参考文献2-4)。

335、本实施例描述了来自一项临床试验的数据，其中在从以第四剂量(a)30-μg加强剂量的omicron ba.4/ba.5-适应性二价covid-19疫苗施用的受试者采集的血清中测量针对omicron亚系ba.4/5、ba.4.6、ba.2.75.2、bq.1.1和xbb.1的中和滴定度，所述二价covid-19疫苗在一些实施方案中包含15μg包含与seq id no：20至少95％(包括并且高达100％)同一的核苷酸序列的rna以及15μg编码包含为omicron ba.4/ba.5变体所特有的一个或多个突变的全长sars-cov-2 s蛋白并且包含与seq id no：72至少95％(包括并且高达100％)同一的核苷酸序列的rna。在本实施例中，向所测试的受试者施用包含(i)15μg包含seq id no：20序列的rna以及(ii)15μg包含seq id no：72序列的rna的omicron ba.4/ba.5-适应性二价covid-19疫苗。

336、向以前已经接受过3个剂量的递送mn908947毒株的sars-cov-2 s蛋白的疫苗的超过55岁的参与者(在本实施例中，受试者以前已经接受过3个30-μg剂量的bnt162b2)在第三剂量后约6.6个月时施用包含30-μg单价bnt162b2的第四加强剂量或者在第三剂量后约11个月时施用包含30-μg二价疫苗(15-μg bnt162b2加上15-μg ba.4/5)的第四加强剂量。在施用第四剂量当日(前血清样本)以及在施用第四剂量之后1个月时(1mpd4血清样本)采集血清。利用病毒核衣壳抗体和rt-pcr试验对所有参与者以前和目前的sars-cov-2感染迹象进行筛检；中和分析中的两个疫苗组在有或无感染迹象的人员之间分布均匀。在中和试验中，将来自omicron ba.4/5(ba.4和ba.5编码同一刺突序列)、ba.2.75.2、bq.1.1或xbb.1的完整刺突基因克隆到荧光报告体usa-wa1/2020 sars-cov-2(在2020年1月分离得到的一种株系，参见参考文献5)的骨架中。将所得野生型-(wt)、ba.4/5-、ba.2.75.2-、bq.1.1-以及xbb.1-刺突mng usa-wa1/2020用于测量各个所采集的血清样本的50％荧光焦点减少中和滴定度(ffrnt50)。

337、对于所有参与者(包括有和无sars-cov-2感染迹象的受试者)，发现第四剂单价bnt162b2疫苗分别针对mn908947毒株、ba.4/5、ba.4.6、ba.2.75.2、bq.1.1以及xbb.1导致3.0倍、2.9倍、2.3倍、2.1倍、1.9倍以及1.5倍几何平均中和滴定度升高倍数(gmfr)；发现二价疫苗导致5.8倍、13.0倍、11.1倍、6.7倍、8.7倍以及4.8倍gmfr(图63(a))。对于无sars-cov-2感染史的个体，bnt162b2分别导致4.4倍、3.0倍、2.6倍、2.1倍、1.5倍以及1.3倍gmfr；二价疫苗导致9.9倍、25.9倍、21.2倍、8.6倍、13.0倍以及4.6倍gmfr(图63(b))。对于以前有sars-cov-2感染的个体，bnt162b2分别导致2.0倍、2.8倍、2.1倍、2.1倍、2.2倍以及1.8倍gmfr；二价疫苗导致3.5倍、6.7倍、6.2倍、5.3倍、6.3倍以及4.9倍gmfr(图63c)。尽管第三剂和第四剂之间的间隔不同，但在所有参与者和无感染组中在单价疫苗组和二价疫苗组中第四剂前的中和滴定度是相似的。

338、本实施例提供了至少三个发现。首先，在以第四剂量加强剂施用时，相较于编码sars-cov-2 s蛋白的单价rna疫苗，二价ba.4/5疫苗针对由ba.5衍生的亚系(ba.4.6、bq.1.1和xbb.1)以及由ba.2衍生的亚系(ba.2.75.2)持续引发更高的中和反应。其次，在第四剂量加强剂之后，以前或目前有sars-cov-2感染迹象的个体相较于无感染的人员显现更高的中和滴定度。不管sars-cov-2感染史如何，都观察到由二价疫苗导致中和反应得到改善。再次，对于各个所测试的omicron亚系，以前无感染的血清在bnt162b2-gmfr与二价-gmfr之间的差异比以前有感染的血清的差异要大。

339、在所有omicron亚系之间，ba.2.75.2、bq.1.1和xbb.1对疫苗引发的中和展现最大程度的逃避；然而，在二价加强剂之后的中和滴定度比在编码mn908947毒株的sars-cov-2s蛋白的单价rna之后的中和滴定度要高数倍。这些数据证明：二价疫苗针对循环omicron亚系更具免疫原性且强调监测现实世界有效性的重要性。

340、方法

341、细胞

342、将购自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection；atcc，bethesda，md)的vero e6(crl-1586)和购自sekisui xenotech，llc的表达tmprss2的vero e6细胞在37℃和5％co2下维持在含有10％胎牛血清(fbs；hyclonelaboratories，south logan，ut)和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖杜氏改良的伊氏培养基(dmem)中。培养基和抗生素购自thermo fisher scientific(waltham，ma)。测出细胞系对支原体呈阴性。

343、人血清

344、在以前接受过三个30-μg bnt162b2剂量的超过55岁的参与者中，就刚要使用单价原始30-μg bnt162b2或30-μg二价ba.4/ba.5疫苗(15μg原始型加上15μg ba.4/ba.5)的第四剂量加强剂之前以及在使用加强剂之后的1个月时采集血清样本。参与研究的每个调查中心的机构审查委员会都批准了方案和知情同意书。遵照所有国际协调委员会良好临床实践(international council for harmonisation good clinical practice)指南和赫尔辛基宣言(declaration of helsinki)的伦理原则进行研究。对于bnt162b2和二价ba.4/5疫苗，在第三剂与第四剂之间的中位时间分别为6.3个月和11.3个月.利用sars-cov-2核衣壳ig血清学试验筛检所有参与者先前存在的sars-cov-2感染或利用rt-pcr筛检其现存的感染。选用于中和试验的参与者血清子集(每一疫苗组大约40个)在通过任一试验获悉有和无感染迹象的人员之间分布均匀。在中和试验之后将人血清在56℃下热灭活30分钟。

345、重组omicron亚系-fp sars cov-2病毒

346、通过将来自所指变体的完整刺突基因工程改造到mng usa-wa1/2020的感染性cdna克隆中来建构重组omicron亚系ba.4/5-、ba.4.6-、ba.2.75.2-、bq.1.1-以及xbb.1-刺突荧光蛋白(fp)sars-cov-2s，并且以前有过报道(参考文献6-10)。在电穿孔后的2-3天后拯救病毒并且充当p0原种。p0原种在vero e6细胞上进一步传代一次以产生p1原种。对来自所有p1原种病毒的刺突基因进行测序，以确保没有不需要的突变。利用荧光焦点化验针对vero e6细胞来定量p1病毒的感染滴定度。在中和试验中使用p1病毒。

347、荧光焦点减少中和试验(ffrnt)

348、通过ffrnt使用usa-wa1/2020-、ba.4/5、ba.4.6-、ba.2.75.2-、bq.1.1-以及xbb.1-刺突fp sars-cov-2s来测量人血清的中和滴定度。顺序测试所有血清，先是usa-wa1/2020和ba.4/5，接着为其余的omicron亚系。ffrnt方案的详情以前有过报道(参见参考文献6和10-13)。简单来说，将vero e6细胞按每孔2.5×104个接种于96-孔板(greinerbio-onetm)中。将细胞孵育过夜。在第二天，将每种血清在培养基中进行2倍连续稀释，第一稀释度为1∶20(最终稀释范围为1∶20至1∶20,480)。将所稀释的血清与100-150个ffu的fpsars-cov-2一起在37℃下孵育1小时，在此之后，将血清病毒混合物装载到96孔板中预先接种过的vero e6细胞单层上。在1小时感染之后，移去接种物并且向每个孔中添加100μl覆盖培养基(补充有0.8％甲基纤维素)。在将板在37℃下孵育16小时之后，使用配备宽视场2.5×fl蔡斯(zeiss)物镜的cytationtm 7(biotek)获取fp焦点的原始图像并且使用基因5软件设置(gfp[469，525]阈值4000，对象选择大小50-1000μm)进行处理。对每个孔中的焦点进行计数并且相对于非血清处理的对照组进行归一化，以计算相对感染性。将ffrnt50值定义为抑制＞50％荧光焦点的最小血清稀释度。在重复化验中测定每种血清的中和滴定度，并且取几何平均值。所有在复制上的尝试都是成功的。最初在graphpad prism 9软件中绘制数据并且在adobe illustrator中组装。

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363、实施例22：疫苗诱导和恢复期的免疫血清对omicron亚谱系的独特交叉中和作用。

364、从以下个体抽取血液样本：(i)经bnt162b2三重疫苗接种或(ii)经bnt162b2四重疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体，以及接种三剂mrna covid-19疫苗(bnt162b2/mrna-1273同源或异源方案)的随后出现(iii)omicron ba.1、(iv)omicron ba.2或(v)omicronba.4/ba.5的突破性感染的个体。突破性感染发生在各自的关注变体占优势的时间(ba.1：2021年11月至2021年1月，ba.2：2022年3月至5月，ba.4/5：2022年6月中旬至7月中旬)并且/或者通过基因组测序被确认为变异。使用假病毒中和测定使用带有位于表面上的ba.4/5、ba.4.6/bf.7、bq.1.1、ba.2.75、ba.2.75.2或xbb omicron变体的sars-cov-2 s蛋白(例如，使用前面实施例中描述的方法；图65)的假病毒测量中和滴定度。50％假病毒中和滴定度(pvnt50)如图64(a)所示。通过将omicron亚谱系pvnt50针对野生型毒株的pvnt50作归一化来评估中和宽度，而不管抗体滴定度的大小(图64(b))。

365、在没有出现突破性感染的经三重/四重疫苗接种的个体中，针对omicron ba.4/5的pvn50 gmt比针对野生型毒株的gmt低5至6倍(针对ba.4/5的gmt在69-121范围内)(图64(a))。针对ba.4/5的gmt在ba.1恢复期中类似地减少(gmt 263，比野生型低5倍)，而在ba.2和ba.4/ba.5恢复期队列中针对ba.4/5的滴定度仍然较高(gmt分别为386和521；比野生型低3倍和2倍)。

366、在所有三个恢复期队列中，针对omicron ba.4.6/bf.7和ba.2.75的中和滴定度明显高于经三重/四重疫苗接种的未感染sars-cov-2的个体(恢复期的gmt范围为239-525，而未感染者为55-139)。在恢复期中，omicron ba.4.6/bf.7和ba.2.75的gmt在很大程度上与针对omicron ba.4/ba.5的gmt相比没有显着差异。相比之下，针对omicron bq.1.1、ba.2.75.2和xbb的pvn50滴定度在队列中低于针对ba.4/5的滴定度。针对bq.1.1的滴定度在未感染sars-cov-2的经疫苗接种的队列和ba.1恢复期(gmt≤38)队列中总体较低，而在ba.2和ba.4/ba.5恢复期队列中则较高(gmt分别100和154)。针对ba.2.75.2和xbb的滴定度在各队列中相对较低(gmt分别≤88和≤33)。

367、为了评估中和宽度而不考虑抗体滴度的大小，将omicron亚谱系pvn50 gmt针对野生型毒株的pvn50 gmt作归一化。所有omicron亚变体假病毒的gmt比率在bnt162b23和bnt162b24队列中是相当的(图64(b))，表明第四剂没有改善所测试的亚谱系的交叉中和作用。在这两个队列中，ba.4/5、ba.4.6/bf.7和ba.2.75的gmt比率在0.09-0.22的范围内，而bq.1.1、ba.2.75.2和xbb的gmt比率则在≤0.05范围内。

368、ba.4/ba.5和ba.4.6/bf.7的交叉中和作用在来自ba.2.恢复期个体的血清中显著(p＜0.05)高于经三重疫苗接种的个体(gmt比率对于ba.4/ba.5为0.37与0.1，而对于ba.4.6/bf.7为0.23与0.12)，并且在ba.4/ba.5恢复期中对于ba.4/ba.5假病毒(gmt比率为0.48，与bnt162b23相比p＜0.01)和ba.4.6/bf.7假病毒(gmt比率为0.41，p＜0.0001)更是如此。与经四重疫苗接种的个体相比，ba.4.6/bf.7的交叉中和作用在ba.4/ba.5恢复期个体中也显著较强(p＜0.0001)。虽然在所有队列中bq.1.1的交叉中和效率都低于ba.4/5(gmt比率≤0.14)，但ba.4/ba.5和ba.2恢复期个体中的交叉中和作用与未感染sars-cov的经三重或四重疫苗接种并且出现ba.1突破性感染的队列相比则仍然显著更强。ba.2.75、ba.2.75.2和xbb假病毒的交叉中和在不同队列中具有广泛的可比性。这些数据共同表明，某些omicron亚谱系的部分中和作用得以保留，尤其是在ba.4/ba.5恢复期个体中，并且在经疫苗接种且出现突破性感染的个体中观察到的中和抗体反应似乎对亚谱系ba.2.75.2和xbb不太有效。这些数据还表明，在一些实施方案中，包含编码作为xbb变体、bq.1.1变体，或从它们衍生的任何谱系的特征的一个或多个突变的sars-cov-2 s蛋白的rna的疫苗可以提供改善的免疫反应(例如，增加的中和滴定度)。

369、实施例23：t细胞表位和中和b细胞表位在sars-cov-2关注变体之间的保守性。

370、为了估计s糖蛋白中t细胞表位的非同义突变率，利用免疫表位数据库(https://www.iedb.org/)获得在实验测定中确认的t细胞反应性的表位。使用以下标准过滤数据库：生物体：sars-cov2；抗原：刺突糖蛋白；阳性测定；无b细胞测定；无mhc测定；mhc限制类型：i类；宿主：智人(homo sapiens)(人)。通过删除“从反应性重叠肽池中推导出来”的表位以及长度超过14个氨基酸的表位来过滤结果表，以便将数据集限制为仅确认的最小表位。确认这些表位反应性的实验测定依赖于多聚体分析、elispot或elispot样测定、t细胞活化测定等。报告了至少27种不同hla-i等位基因的表位，包括hla-a、hla-b,和hla-c等位基因。在这种方法获得的251个独特表位序列中，有244个是在mn908947毒株刺突糖蛋白中发现的。其中，36个表位(14.8％)包括通过本文所述的序列分析的报告为发生突变的位置。

371、此外，通过计算可能受突变影响的抗体中和表位的数量来计算中和b细胞表位的保守性。它是通过首先使用可用的蛋白质结构(如https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.12.24.474095v2中所述)将在332个实验解析的nab结构中观察到的719个结合表位映射到s蛋白上计算得出的。对于每个结构，每个抗体的表位被计算为与抗体接触的一组位置，如果两个残基的原子之间的最小欧氏(euclidean)距离小于4埃，则认为这两个残基接触。每个nab都会被评估，并且如果某个nab的表位的任何位置都发生突变，则认为该nab会被变体逃避掉。

372、鉴于体液和细胞介导的免疫共同决定了对严重covid-19疾病的易感性，因此评估了omicron亚谱系中s糖蛋白的中和b细胞和t细胞表位之间的保守程度。本文呈现的发现表明，超过80％的bnt162b2编码的s糖蛋白t细胞表位在包括ba.2.75.2、bq.1.1和xbb在内的omicron亚谱系中完全保守(图66)。形成鲜明对比的是，b细胞表位在早期变体alpha、beta和delta中是部分保守的(≥50％)，但这些表位中的大多数在omicron谱系中发生了改变(≤20％保守)，尤其是在ba.2.752和xbb(≤10％)中。这些发现表明，在经疫苗接种的群体中，可以针对包括逃避中和抗体的亚谱系在内的omicron变体维持强大的t细胞介导的免疫。

373、某些序列

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技术实现思路

1、本公开通常涉及受试者的免疫治疗，包括施用编码氨基酸序列的rna，例如疫苗rna，例如包含sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的疫苗抗原，即抗原性肽或蛋白质。因此，疫苗抗原包含sars-cov-2 s蛋白的表位，用于在受试者中诱导针对冠状病毒s蛋白、特别是sars-cov-2 s蛋白的免疫反应。施用编码疫苗抗原的rna以提供(在适当的靶细胞表达多核苷酸之后)用于诱导(即，刺激、引发和/或扩增)免疫反应的抗原，例如靶向靶抗原(冠状病毒s蛋白，特别是sars-cov-2 s蛋白)或其加工产物的抗体和/或免疫效应细胞。在一个实施方案中，根据本公开要诱导的免疫反应是b细胞介导的免疫反应，即抗体介导的免疫反应。另外或替代地，在一个实施方案中，根据本公开要诱导的免疫反应是t细胞介导的免疫反应。在一个实施方案中，免疫反应是抗冠状病毒、特别是抗sars-cov-2免疫反应。

2、本文所述的疫苗包含作为活性成分的单链rna，其在进入接受者的细胞时可以被翻译成相应的蛋白质。除了编码抗原序列的野生型或密码子优化序列之外，rna还可含有就稳定性和翻译效率而言针对rna的最大功效优化的一个或多个结构元件(例如，5’帽、5’utr、3’utr、聚(a)尾及其组合)。在一个实施方案中，rna含有所有这些元件。在一个实施方案中，cap1结构可用作在rna药物物质的5’-端的特异性加帽结构。在一个实施方案中，beta-s-arca(d1)(m27,2’-ogppspg)或m27,3'-ogppp(m12'-o)apg可用作在rna药物物质的5’-端的特异性加帽结构。作为5’-utr序列，可以使用人alpha-球蛋白mrna的5’-utr序列，任选具有优化的‘kozak序列’以提高翻译效率(例如，seq id no：12)。作为3’-utr序列，可以使用来源于“分裂的氨基末端增强子”(aes)mrna(称为f)和线粒体编码的12s核糖体rna(称为i)(例如，seq id no：13)的两个序列元件(fi元件)的组合，其置于编码序列与聚(a)尾之间以确保较高的最大蛋白质水平和mrna的延长的持久性。这些特征通过赋予rna稳定性和增加总蛋白表达的序列的离体选择方法确认(参见以引用的方式并入本文的wo 2017/060314)。或者，3’-utr可以是人beta-球蛋白mrna的两个重复的3’-utr。另外或替代地，在一些实施方案中，聚(a)-尾可包含至少100个腺苷残基的长度(包括例如至少110个腺苷残基、至少120个腺苷残基、130个腺苷残基或更长)。在一些实施方案中，聚(a)-尾可包含约100到约150个腺苷残基的长度。在一些实施方案中，聚(a)-尾可包含中断的聚(a)-尾。例如，在一些这样的实施方案中，可以使用测量长度为110个核苷酸的聚(a)尾，其组成为30个腺苷残基的片段、接着是10个核苷酸接头序列(随机核苷酸的)和另外70个腺苷残基(例如，seq idno：14)。此聚(a)尾序列被设计用于增强rna稳定性和翻译效率。

3、此外，在一些实施方案中，编码分泌信号肽(sec)的核苷酸序列可以与rna的抗原编码区融合，优选在一些实施方案中以sec被翻译为n末端标签的方式融合。在一个实施方案中，sec对应于(例如，mn908947毒株的)sars-cov-2 s蛋白的的分泌信号肽。在一些实施方案中，常用于融合蛋白的编码主要由氨基酸甘氨酸(g)和丝氨酸(s)组成的短接头肽的序列可用作sec与抗原之间的gs/接头。

4、本文所述的疫苗rna可以与蛋白质和/或脂质、优选脂质复合，以产生用于施用的rna颗粒。如果使用不同rna的组合，则rna可以复合在一起，或者单独与蛋白质和/或脂质复合，以产生用于施用的rna颗粒。

5、一方面，本公开涉及包含编码氨基酸序列的rna的组合物或医药制剂，所述氨基酸序列构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。

6、在一个实施方案中，sars-cov-2 s蛋白的免疫原性片段sars-cov-2 s蛋白的s1亚基或sars-cov-2 s蛋白的s1亚基的受体结合结构域(rbd)。

7、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列能够形成多聚体复合物，特别是三聚体复合物。为此，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列可包含允许形成构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的多聚体复合物、特别是三聚体复合物的结构域。在一个实施方案中，允许形成多聚体复合物的结构域包含三聚化结构域，例如，如本文所述的三聚化结构域，例如sars-cov-2 s蛋白三聚化结构域。在一个实施方案中，通过添加三聚化结构域，例如t4-纤维蛋白(fibritin)来源的“折叠子”三聚化结构域(例如，seq id no：10)来实现三聚化，特别是如果构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列对应于sars-cov-2 s蛋白的不包含sars-cov-2 s蛋白三聚化结构域的部分。

8、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列由经密码子优化的和/或其g/c含量与野生型编码序列相比增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或g/c含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。本领域技术人员将认识到，密码子优化涉及在编码相同氨基酸残基的替代密码子之间或当中进行选择。密码子优化通常包括考虑其中要表达序列的特定宿主所优选的密码子。根据本公开，在许多实施方案中，优选的宿主是人。在一些实施方案中，优选的宿主可以是家养动物。替代或另外地，在一些实施方案中，在编码相同氨基酸的可能的密码子之间或当中的选择可考虑一项或多项其它特征，比如总g/c含量(如以上指出的)和/或与特定参考的相似性。例如，在本公开的一些实施方案中，所提供的编码sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的编码序列在氨基酸序列上不同于由本文所述的bnt162b2构建体编码的氨基酸序列，其在这种差异的至少一个位置上利用了密码子，该密码子相对于在这种差异位置上编码相同氨基酸的至少一个替代密码子保留了与bnt162b2构建体序列更大的相似性。

9、在一个实施方案中，

10、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列，与seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

11、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

12、在一个实施方案中，

13、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：30的核苷酸11 1至986的核苷酸序列，与seq idno：30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id n0：30的核苷酸111至986的核苷酸序列或与seq idno：30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

14、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列，与seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列或与seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氯基酸序列的免疫原性片段。

15、在一个实施方案中，

16、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列，与seqid no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

17、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

18、在一个实施方案中，

19、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列，与seqid no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸49至381 9的核苷酸序列或与seq id n0：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

20、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1或7的氨基酸1 7至1273的氨基酸序列，与seq id no：1或7的氨基酸1 7至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1或7的氨基酸1 7至1273的氨基酸序列或与seqid no：1或7的氨基酸1 7至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

21、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列包含分泌信号肽。

22、在一个实施方案中，分泌信号肽与sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段融合，优选n-末端融合。

23、在一个实施方案中，

24、(i)编码分泌信号肽的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列，与seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

25、(ii)分泌信号肽包含seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。

26、在一个实施方案中，

27、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：6的核苷酸序列，与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq idno：6的核苷酸序列或与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

28、(ii) sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：5的氨基酸序列，与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：5的氨基酸序列或与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

29、在一个实施方案中，

30、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：30的核苷酸54至986的核苷酸序列，与seq idno：30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：30的核苷酸54至986的核苷酸序列或与seq idno：30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

31、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列，与seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列或与seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

32、在一个实施方案中，所述rna是修饰的rna，特别是稳定的mrna。在一个实施方案中，所述rna包含修饰的核苷代替至少一个尿苷。在一个实施方案中，所述rna包含修饰的核苷代替每个尿苷。在一个实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。

33、在一个实施方案中，rna包含修饰的核苷代替尿苷。

34、在一个实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。

35、在一个实施方案中，rna包含5’帽。

36、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含：包含seq id no：12的核苷酸序列或与seq id no：12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的5’utr。

37、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含：包含seq id no：13的核苷酸序列或与seq id no：13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的3’utr。

38、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含聚a序列。

39、在一个实施方案中，所述聚a序列包含至少100个核苷酸。

40、在一个实施方案中，所述聚a序列包含seq id no：14的核苷酸序列或由seq idno：14的核苷酸序列组成。

41、在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为液体、固体或其组合。

42、在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为用于注射。

43、在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为用于肌内施用。

44、在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为颗粒。

45、在一个实施方案中，颗粒是脂质纳米颗粒(lnp)或阳离子脂质复合物(1ipoplex，lpx)颗粒。

46、在一个实施方案中，lnp包含((4-羟丁基)氮烷二基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-双十四基乙酰胺、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。

47、在一个实施方案中，rna阳离子脂质复合物可通过将rna与脂质体混合获得。在一个实施方案中，rna阳离子脂质复合物颗粒可通过将rna与脂质混合获得。

48、在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为胶体。在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为颗粒，形成胶体的分散相。在一个实施方案中，50％或更多、75％或更多或85％或更多的rna存在于分散相中。在一个实施方案中，rna被配制或要被配制为包含rna和脂质的颗粒。在一个实施方案中，通过将溶解在水相中的rna与溶解在有机相中的脂质接触来形成颗粒。在一个实施方案中，有机相包含乙醇。在一个实施方案中，通过将溶解在水相中的rna与分散在水相中的脂质接触来形成颗粒。在一个实施方案中，分散在水相中的脂质形成脂质体。

49、在一个实施方案中，rna是mrna或sarna。

50、在一个实施方案中，组合物或医药制剂是药物组合物。

51、在一个实施方案中，组合物或医药制剂是疫苗。

52、在一个实施方案中，药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

53、在一个实施方案中，组合物或医药制剂是试剂盒。

54、在一个实施方案中，rna和任选颗粒形成组分在分开的小瓶中。

55、在一个实施方案中，试剂盒进一步包括使用组合物或医药制剂在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫反应的说明书。

56、一方面，本公开涉及本文所述的用于药物用途的组合物或医药制剂。

57、在一个实施方案中，药物用途包括在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫反应。

58、在一个实施方案中，药物用途包括冠状病毒感染的治疗性或预防性治疗。

59、在一个实施方案中，本文所述的组合物或医药制剂用于对人施用。

60、在一个实施方案中，所述冠状病毒是beta冠状病毒。

61、在一个实施方案中，所述冠状病毒是沙贝病毒(sarbecovirus)。

62、在一个实施方案中，所述冠状病毒是sars-cov-2。

63、一方面，本公开涉及在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫反应的方法，包括对受试者施用包含rna的组合物，所述rna编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。

64、在一个实施方案中，sars-cov-2 s蛋白的免疫原性片段包含sars-cov-2 s蛋白的s1亚基或sars-cov-2 s蛋白的s1亚基的受体结合结构域(rbd)。

65、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列能够形成多聚体复合物，特别是三聚体复合物。为此，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列可包含允许形成多聚体复合物的结构域，特别是构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的三聚体复合物。在一个实施方案中，允许形成多聚体复合物的结构域包含三聚化结构域，例如，如本文所述的三聚化结构域。

66、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列由经密码子优化的和/或其g/c含量与野生型编码序列相比增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或g/c含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

67、在一个实施方案中，

68、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列，与seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

69、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1的氨基酸327至528的氯基酸序列，与seq id no：1的氨基酸327至528的氯基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸327至528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

70、在一个实施方案中，

71、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：30的核苷酸111至986的核苷酸序列，与seq idno：30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：30的核苷酸111至986的核苷酸序列或与seq idno：30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

72、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列，与seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列或与seq id no：29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

73、在一个实施方案中，

74、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列，与seqid no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

75、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

76、在一个实施方案中，

77、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列，与seqid no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

78、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列，与seq id no：1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列或与seq id no：1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

79、在一个实施方案中，构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列包含分泌信号肽。

80、在一个实施方案中，分泌信号肽与sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段融合，优选n-末端融合。

81、在一个实施方案中，

82、(i)编码分泌信号肽的rna包含seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列，与seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列或与seq id no：2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

83、(ii)分泌信号肽包含seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列或与seq id no：1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。

84、在一个实施方案中，

85、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：6的核苷酸序列，与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq idno：6的核苷酸序列或与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

86、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：5的氨基酸序列，与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氯基酸序列，或seq id no：5的氨基酸序列或与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

87、在一个实施方案中，

88、(i)编码sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的rna包含seq id no：30的核苷酸54至986的核苷酸序列，与seq idno：30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或seq id no：30的核苷酸54至986的核苷酸序列或与seq idno：30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或

89、(ii)sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列，与seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列或与seq id no：29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。

90、在一个实施方案中，rna是修饰的rna，特别是稳定的mrna。在一个实施方案中，rna包含修饰的核苷代替至少一个尿苷。在一个实施方案中，rna包含修饰的核苷代替每个尿苷。在一个实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。

91、在一个实施方案中，rna包含修饰的核苷代替尿苷。

92、在一个实施方案中，所述修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。

93、在一个实施方案中，rna包含帽。

94、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含：包含seq id no：12的核苷酸序列或与seq id no：12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的5’utr。

95、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含：包含seq id no：1 3的核苷酸序列或与seq id no：13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的3’utr。

96、在一个实施方案中，编码构成sars-cov-2 s蛋白、其免疫原性变体或sars-cov-2s蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna包含聚a序列。

97、在一个实施方案中，聚a序列包含至少100个核苷酸。

98、在一个实施方案中，聚a序列包含seq id no：14的核苷酸序列或由seq id no：14的核苷酸序列组成。

99、在一个实施方案中，rna被配制为液体、固体或其组合。

100、在一个实施方案中，通过注射施用rna。

101、在一个实施方案中，通过肌内施用来施用rna。

102、在一个实施方案中，rna被配制为颗粒。

103、在一个实施方案中，所述颗粒是脂质纳米颗粒(lnp)或阳离子脂质复合物(lpx)颗粒。

104、在一个实施方案中，lnp包含((4-羟丁基)氮烷二基)双(己烷-6，1-二基)双(2-己基癸酸酯)、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-双十四基乙酰胺、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。

105、在一个实施方案中，可通过将rna与脂质体混合获得rna阳离子脂质复合物颗粒。在一个实施方案中，可通过将rna与脂质混合获得rna阳离子脂质复合物颗粒。

106、在一个实施方案中，rna被配制为胶体。在一个实施方案中，rna被配制为颗粒，形成胶体的分散相。在一个实施方案中，50％或更多、75％或更多或85％或更多的rna存在于分散相中。在一个实施方案中，rna被配制为包含rna和脂质的颗粒。在一个实施方案中，通过将溶解在水相中的rna与溶解在有机相中的脂质接触来形成颗粒。在一个实施方案中，有机相包含乙醇。在一个实施方案中，通过将溶解在水相中的rna与分散在水相中的脂质接触来形成颗粒。在一个实施方案中，分散在水相中的脂质形成脂质体。

107、在一个实施方案中，rna是mrna或sarna。

108、在一个实施方案中，本文公开的方法是针对冠状病毒进行疫苗接种的方法。

109、在一个实施方案中，本文公开的方法是用于冠状病毒感染的治疗性或预防性治疗的方法。

110、在一个实施方案中，受试者是人。

111、在一个实施方案中，所述冠状病毒是beta冠状病毒。

112、在一个实施方案中，所述冠状病毒是沙贝病毒。

113、在一个实施方案中，所述冠状病毒是sars-cov-2。

114、在本文所述的方法的一个实施方案中，对受试者施用本文所述的组合物。

115、一方面，本公开涉及用于本文所述的方法的本文所述的组合物或医药制剂。

116、此外，本公开教导了包含脂质纳米颗粒包封的rna的组合物，所述rna编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位)，所述组合物可在根据包括施用至少一个剂量组合物的方案对成人受试者群体施用后7天内达到针对血清中的表位可检测的抗体滴定度。此外，本公开教导了这种抗体滴定度的持久性。在一些实施方案中，当使用修饰的mrna时，与用相应未修饰的mrna达到的滴定度相比，这种抗体滴定度增加。

117、在一些实施方案中，所提供的方案包括至少一个剂量。在一些实施方案中，所提供的方案包括第一剂量和至少一个后续剂量。在一些实施方案中，第一剂量是与至少一个后续剂量相同的量。在一些实施方案中，第一剂量是与所有后续剂量相同的量。在一些实施方案中，第一剂量是与至少一个后续剂量不同的量。在一些实施方案中，第一剂量是与所有后续剂量不同的量。在一些实施方案中，所提供的方案包含两个剂量。在一些实施方案中，所提供的方案由两个剂量组成。

118、在特定实施方案中，免疫原性组合物被配制为在容器(例如，小瓶)中的单剂量。在一些实施方案中，免疫原性组合物被配制为在小瓶中的多剂量制剂。在一些实施方案中，多剂量制剂包括每个小瓶至少2个剂量。在一些实施方案中，多剂量制剂包括每个小瓶总共2-20个剂量，比如，每个小瓶2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个剂量。在一些实施方案中，小瓶中的每个剂量体积相等。在一些实施方案中，第一剂量与后续剂量体积不同。

119、“稳定的”多剂量制剂不表现出不可接受的微生物生长水平，并且基本上没有或没有活性生物分子组分的分解或降解。如本文所用，“稳定的”免疫原性组合物包括当施用给受试者时仍能够引发所需免疫学反应的制剂。

120、在一些实施方案中，在多次或反复接种/插入到多剂量容器中的情况下，多剂量制剂保持稳定达指定的时间。例如，在一些实施方案中，当容纳在多剂量容器内时，多剂量制剂在最多十次使用的情况下可稳定至少三天。在一些实施方案中，在2-20次接种/插入的情况下，多剂量制剂保持稳定。

121、在一些实施方案中，例如根据如本文所述的方案，施用包含脂质纳米颗粒包封的rna(例如在一些实施方案中mrna)的组合物，所述rna编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位)，可在一些受试者中(例如，在所有受试者中，在大多数受试者中，在约50％或更少、在约40％或更少、在约40％或更少、在约25％或更少、在约20％或更少、在约15％或更少、在约10％或更少、在约5％或更少的受试者中等)导致淋巴细胞减少症。此外，本公开教导了这种淋巴细胞减少症可随着时间的推移而消退。例如，在一些实施方案中，淋巴细胞减少症在约14天、约1o天、约9天、约8天、约7天或更短的时间内消退。在一些实施方案中，淋巴细胞减少症为3级、2级或更低级。

122、因此，此外，本公开提供了包含脂质纳米颗粒包封的rna(例如在一些实施方案中mrna)的组合物，所述rna编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位)，所述组合物的特征是当对相关的成人群体施用时表现出如本文所述的某些特征(例如，实现某些效果)。在一些实施方案中，所提供的组合物可在温度不超过特定阈值的条件下制备、储存、运输、表征和/或使用。替代或另外地，在一些实施方案中，所提供的组合物可在它们的制备、储存、运输、表征和/或使用的一些或所有过程期间受到避光(例如，某些波长)保护。在一些实施方案中，所提供的组合物的一项或多项特征(例如，rna稳定性，如可例如通过大小、特定部分的存在或修饰等中的一者或多者来评估；脂质纳米颗粒稳定性或聚集、ph等)可以或已经在施用之前的制备、储存、运输和/或使用期间在一个或多个点进行评估。

123、此外，本公开记载了某些提供的组合物，其中rna(例如在一些实施方案中mrna)内的核苷酸未被修饰(例如，是天然存在的a、u、c、g)，和/或提供的与这类组合物有关的方法，其特征(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)在于固有的佐剂效应。在一些实施方案中，这种组合物和/或方法可诱导抗体和/或t细胞反应。在一些实施方案中，与常规疫苗(例如，非rna疫苗，如蛋白质疫苗)相比，这种组合物和/或方法可诱导更高的t细胞反应。

124、替代或另外地，本公开记载了提供的组合物(例如，包含脂质纳米颗粒包封的rna的组合物，所述rna编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位))，其中rna内的核苷酸被修饰，和/或提供的与这类组合物有关的方法，其特征(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)在于不存在固有的佐剂效应，或在于与结果未改变的另外可比较的组合物(或方法)相比，固有的佐剂效应降低。替代或另外地，在一些实施方案中，这类组合物(或方法)的特征在于，它们(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)诱导抗体反应和/或cd4+t细胞反应。更进一步替代或另外地，在一些实施方案中，这类组合物(或方法)的特征在于，它们(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)诱导比用替代疫苗形式(例如，肽疫苗)观察到的更高的cd4+t细胞反应。在涉及修饰的核苷酸的一些实施方案中，这类修饰的核苷酸可存在于例如3’utr序列、抗原编码序列和/或5'utr序列中。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是或包括一个或多个修饰的尿嘧啶残基和/或一个或多个修饰的胞嘧啶残基。

125、此外，本公开记载了提供的组合物(例如，包含脂质纳米颗粒包封的rna的组合物，所述rna编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位))和/或方法的特征在于(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的蛋白[如s蛋白]或其部分，所述部分在一些实施方案中可以是或包含其表位)的持续表达。例如，在一些实施方案中，这类组合物和/或方法的特征在于，当对人施用时，它们在来自这种人的生物样品(例如，血清)中实现了可检测的多肽表达，并且在一些实施方案中，这种表达持续至少36小时或更长的时间段，包括例如至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少148小时或更长时间。

126、阅读了本公开的本领域技术人员将会认识到，其描述了编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位)的各种rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)。阅读了本公开的普通技术人员将会特别认识到，其描述了编码sars-cov-2 s蛋白的至少一部分(例如sars-cov-2 s蛋白的至少rbd部分)的各种rna(例如在一些实施方案中mrna构建体)构建体。更进一步地，阅读了本公开的普通技术人员将会认识到，其描述了编码sars-cov-2编码的多肽(例如，sars-cov-2编码的s蛋白)的至少一部分(例如，是或包含表位)的rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)的特定特征和/或优点。在一些实施方案中，rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)可编码sars-cov-2编码的多肽的至少一个结构域(例如，如wo 2021/159040中描述的sars-cov-2编码的多肽的一个或多个结构域，包括例如sars-cov-2刺突蛋白的n-末端结构域(ntd)、sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)、sars-cov-2刺突蛋白的七肽重复序列1(hr1)、sars-cov-2刺突蛋白的七肽重复序列2(hr1)和/或其组合)。此外，本公开特别记载了编码sars-cov-2 rbd部分并且在一些实施方案中不编码全长sars-cov-2 s蛋白的某些rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)的意外和有用的特征和/或优点。不希望受任何特定理论的束缚，本公开表明，所提供的编码小于全长sars-cov-2 s蛋白的rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)和特别是编码这种sars-cov-2 s蛋白的至少rbd部分的rna构建体(例如在一些实施方案中mrna构建体)对于用作或用于免疫原性组合物(例如，疫苗)和/或用于实现如本文所述的免疫学效应(例如，产生sars-cov-2中和抗体和/或t细胞反应(例如，cd4+和/或cd8+t细胞反应))可能是特别有用和/或有效的。

127、在一些实施方案中，本公开提供了包含编码多肽的开放阅读框的rna(例如，mrna)，所述多肽包含sars-cov-2 s蛋白的受体结合部分，所述rna适于所述多肽的细胞内表达。在一些实施方案中，这种编码的多肽不包含完整的s蛋白。在一些实施方案中，编码的多肽包含例如如seq id no：5中所示的受体结合结构域(rbd)。在一些实施方案中，编码的多肽包含根据seq id no：29或31的肽。在一些实施方案中，这种rna(例如，mrna)可以与(多聚)阳离子聚合物、(多种)多聚物、(多种)蛋白质或(多种)肽复合。在一些实施方案中，这种rna可以被配制在脂质纳米颗粒(例如，本文所述的那些)中。在一些实施方案中，这种rna(例如，mrna)对于用作或用于免疫原性组合物(例如，疫苗)和/或用于实现如本文所述的免疫学效应(例如，产生sars-cov-2中和抗体和/或t细胞反应(例如，cd4+和/或cd8+t细胞反应))可能是特别有用和/或有效的。在一些实施方案中，这种rna(例如，mrna)可用于人(包括例如，已知已经暴露于和/或感染了sars-cov-2的人，和/或未知已经暴露于sars-cov-2的人)的疫苗接种。

128、阅读了本公开的本领域技术人员将进一步认识到，其描述了包含编码全长sars-cov-2刺突蛋白的核酸序列的各种mrna构建体(例如，包括其中这种编码的sars-cov-2刺突蛋白可包含至少一个或多个氨基酸取代的实施方案，例如，如本文所述的脯氨酸取代，和/或其中mrna序列是密码子优化的实施方案，例如对于哺乳动物，例如人受试者)。在一些实施方案中，这种全长sars-cov-2刺突蛋白可具有seq id no：7中所示的氨基酸序列或包含seq id no：7中所示的氨基酸序列。更进一步地，阅读了本公开的普通技术人员将会认识到，此外其描述了包含编码全长sars-cov-2刺突蛋白的核酸序列的某些mrna构建体的特定特征和/或优点。不希望受任何特定理论的束缚，本公开表明，所提供的编码全长sars-cov-2 s蛋白的mrna构建体对于在特定受试者群体(例如，特定年龄群体)中用作或用于免疫原性组合物(例如，疫苗)可能是特别有用和/或有效的。例如，在一些实施方案中，这种mrna组合物在年轻(例如，不到25岁、20岁、1 8岁、15岁、10岁或更年轻)的受试者中可能是特别有用的；替代或另外地，在一些实施方案中，这种mrna组合物在老年受试者(例如，超过55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或更老)中可能是特别有用的。在特定实施方案中，包含本文提供的这种mrna构建体的免疫原性组合物至少在一些受试者中(例如，在一些受试者年龄组中)表现出剂量水平和/或剂量数依赖性全身反应原性(例如，发热、疲劳、头痛、寒冷、腹泻、肌肉疼痛和/或关节疼痛等)和/或局部耐受性(例如，疼痛、发红和/或肿胀等)的最小至适度增加(例如，不超过30％的增加、不超过20％的增加或不超过10％的增加，或更低)；在一些实施方案中，特别在年轻组(例如，不到25岁、20岁、1 8岁或更年轻)受试者中和/或在年长(例如，老年人)年龄组(例如，65-85岁)中观察到这种反应原性和/或局部耐受性。在一些实施方案中，所提供的编码全长sars-cov-2 s蛋白的mrna构建体对于用作或用于在有患与sars-cov-2感染相关的严重疾病的高风险的受试者群体(例如，老年人群体，例如65-85岁组)中诱导sars-cov-2中和抗体反应水平的免疫原性组合物(例如，疫苗)可能是特别有用和/或有效的。在一些实施方案中，阅读了本公开的普通技术人员将会认识到，此外所提供的编码全长sars-cov-2 s蛋白的mrna构建体在年轻和老年群体中表现出有利的反应原性特征(例如，如本文所述)，其对于用作或用于实现如本文所述的免疫学效应(例如，产生sars-cov-2中和抗体和/或t细胞反应(例如，cd4+和/或cd8+t细胞反应))的免疫原性组合物(例如，疫苗)可能是特别有用和/或有效的。在一些实施方案中，本公开还表明，所提供的编码全长sars-cov-2 s蛋白的mrna构建体可特别有效地针对sars-cov-2感染进行保护，如通过sars-cov-2病毒rna在用包含这种mrna构建体的免疫原性组合物进行免疫并随后被sars-cov-2毒株攻击的非人类哺乳动物受试者(例如，恒河猴)中的早期清除所表征。在一些实施方案中，在用包含这种mrna构建体的免疫原性组合物进行免疫并随后被sars-cov-2毒株攻击的非人类哺乳动物受试者(例如，恒河猴)的鼻子中可以观察到sars-cov-2病毒mrna的这种早期清除。

129、在一些实施方案中，本公开提供了包含编码全长sars-cov-2 s蛋白(例如，具有一个或多个氨基酸取代的全长sars-cov-2 s蛋白)的开放阅读框的rna(例如，mrna)，所述rna适于多肽的细胞内表达。在一些实施方案中，编码的多肽包含seq id no：7的氨基酸序列。在一些实施方案中，这种rna(例如，mrna)可以被(多聚)阳离子聚合物、(多种)多聚物、(多种)蛋白质或(多种)肽复合。在一些实施方案中，这种rna可以被配制在脂质纳米颗粒(例如，本文所述的那些)中。

130、在一些实施方案中，本文提供的免疫原性组合物可包含sars-cov-2多肽或其变体的多个(例如，至少两个或更多个，包括例如至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个等)免疫反应性表位。在一些这类实施方案中，这种多个免疫反应性表位可由多个rna(例如，mrna)编码。在一些这类实施方案中，这种多个免疫反应性表位可由单个rna(例如，mrna)编码。在一些实施方案中，编码多个免疫反应性表位的核酸序列可在单个rna(例如，mrna)中由接头(例如在一些实施方案中，肽接头)彼此隔开。不希望受任何特定理论的束缚，在一些实施方案中，当考虑sars-cov-2变体的遗传多样性时，所提供的多表位(polyepitope)免疫原性组合物(包括例如，编码全长sars-cov-2刺突蛋白的那些)可特别用于提供针对众多病毒变体的保护，和/或可提供更好的机会来开发多样和/或另外稳健的(例如，持久的，例如在施用一个或多个剂量后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天或更多天可检测到的)中和抗体和/或t细胞反应，特别是特别稳健的th1型t细胞(例如，cd4+和/或cd8+t细胞)反应。

131、在一些实施方案中，本公开记载了所提供的组合物和/或方法的特征在于(例如，当对相关群体施用时，相关群体在一些实施方案中可以是或包括成人群体)，在单次施用的情况下，它们取得了一种或多种特定的治疗结果(例如，如本文所述的有效免疫反应和/或编码的sars-cov-2 s蛋白或其免疫原性片段的可检测的表达)；在一些这类实施方案中，可以对结果进行评估，例如与不存在本文所述的rna疫苗(例如mrna疫苗)情况下观察到的相比。在一些实施方案中，可以在低于一种或多种替代策略所需的剂量下取得特定的结果。

132、在一些实施方案中，本公开提供了包含分离的信使核糖核酸(mrna)多核苷酸的免疫原性组合物，其中所述分离的mrna多核苷酸包含编码多肽的开放阅读框，所述多肽包含sars-cov-2 s蛋白的受体结合部分，且其中所述分离的mrna多核苷酸被配制在至少一种脂质纳米颗粒中。例如，在一些实施方案中，这种脂质纳米颗粒的摩尔比可以为20-60％的可离子化的阳离子脂质、5-25％的非阳离子脂质(例如，中性脂质)、25-55％的固醇或类固醇和o.5-15％的聚合物缀合脂质(例如，peg修饰的脂质)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中包括的固醇或类固醇可以是或包含胆固醇。在一些实施方案中，中性脂质可以是或包含1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)。在一些实施方案中，聚合物缀合脂质可以是或包含peg2000 dmg。在一些实施方案中，这种免疫原性组合物可包含约1mg至10mg或3mg至8mg或4mg至6mg的总脂质含量。在一些实施方案中，这种免疫原性组合物可包含约5mg/ml-15mg/ml或7.5mg/ml-12.5mg/ml或9-11mg/ml的总脂质含量。在一些实施方案中，以在施用至少一个剂量的免疫原性组合物的受试者中有效诱导免疫反应的量提供这种分离的mrna多核苷酸。在一些实施方案中，由所提供的分离的mrna多核苷酸编码的多肽不包含完整的s蛋白。在一些实施方案中，在免疫原性组合物中提供的这种分离的mrna多核苷酸不是自我复制的rna。

133、在一些实施方案中，免疫反应可包括产生针对sars-cov-2蛋白(包括例如在一些实施方案中，产生针对sars-cov-2蛋白(包括例如在一些实施方案中，稳定的预融合刺突三聚体)或其片段的结合抗体滴定度。在一些实施方案中，免疫反应可包括产生针对sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)的结合抗体滴定度。在一些实施方案中，已经确定所提供的免疫原性组合物在施用第一剂量后实现了可检测的结合抗体滴定度，在接受这种提供的免疫原性组合物的受试者群体中有至少70％(包括，例如至少80％、至少90％、至少95％直到100％)例如在约2周内发生血清转化。

134、在一些实施方案中，免疫反应可包括产生针对sars-cov-2蛋白(包括例如在一些实施方案中，稳定的预融合刺突三聚体)或其片段的中和抗体滴定度。在一些实施方案中，免疫反应可包括产生针对sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)的中和抗体滴定度。在一些实施方案中，已经确定所提供的免疫原性组合物在适当的系统中(例如，在感染了sars-cov-2的人和/或其群体中和/或在用于其的模型系统中)实现了中和抗体滴定度。例如，在一些实施方案中，这种中和抗体滴定度可能已经在人类群体、非人灵长类动物模型(例如，恒河猴)和/或小鼠模型中的一者或多者中得到证明。

135、在一些实施方案中，中和抗体滴定度是相对于对适当的对照(例如，未接种疫苗的对照受试者，或接种活减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白亚基病毒疫苗或其组合的受试者)观察到的足以减少b细胞的病毒感染的滴定度(例如，已经确定是)。在一些这类实施方案中，这种减少为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。

136、在一些实施方案中，中和抗体滴定度是相对于对适当的对照(例如，未接种疫苗的对照受试者，或接种活减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白亚基病毒疫苗或其组合的受试者)观察到的足以降低无症状病毒感染率的滴定度(例如，已经确定是)。在一些这类实施方案中，这种降低为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，这种降低可通过sars-cov-2 n蛋白血清学的评估来表征。现实生活中的观察也证实了针对无症状感染的显著保护作用(还参见：dagann.等人，n engl j med.2021，doi：10.1056/nejmoa2101765.epub ahead of print.pmid：33626250)

137、在一些实施方案中，中和抗体滴定度是相对于对适当的对照(例如，未接种疫苗的对照受试者，或接种活减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白亚基病毒疫苗或其组合的受试者)观察到的足以减少或阻断病毒与接种疫苗的受试者的上皮细胞和/或b细胞融合的滴定度(例如，已经确定是)。在一些这类实施方案中，这种减少为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。

138、在一些实施方案中，中和抗体滴定度的诱导可通过b细胞的数量增多来表征，其在一些实施方案中可包括浆细胞、类别转换的igg1和igg2阳性b细胞和/或生发中心b细胞。在一些实施方案中，已经确定所提供的免疫原性组合物在适当的系统中(例如，在感染了sars-cov-2的人和/或其群体中和/或在用于其的模型系统中)实现了这种b细胞数量的增多。例如，在一些实施方案中，这种b细胞数量的增多可能已经在人类群体、非人灵长类动物模型(例如，恒河猴)和/或小鼠模型中的一者或多者中得到证明。在一些实施方案中，这种b细胞数量的增多可能已经在用所提供的免疫原性组合物对这种小鼠模型进行免疫接种后(例如，至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天后)的小鼠模型的引流淋巴结和/或脾中得到证明。

139、在一些实施方案中，中和抗体滴定度的诱导可通过血液中的循环b细胞的数量减少来表征。在一些实施方案中，已经确定所提供的免疫原性组合物在适当系统(例如，在感染了sars-cov-2的人和/或其群体中和/或在用于其的模型系统中)的血液中实现了循环b细胞数量的这种减少。例如，在一些实施方案中，血液中的循环b细胞数量的这种减少可能已经在人类群体、非人灵长类动物模型(例如，恒河猴)和/或小鼠模型中的一者或多者中得到证明。在一些实施方案中，血液中的循环b细胞数量的这种减少可能已经在用所提供的免疫原性组合物对这种小鼠模型进行免疫接种后(例如，至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天后)的小鼠模型中得到证明。不希望受理论的束缚，血液中的循环b细胞的减少可能是由于b细胞向淋巴样区室的归巢。

140、在一些实施方案中，由所提供的免疫原性组合物诱导的免疫反应可包括t细胞数量的增多。在一些实施方案中，这种t细胞数量的增多可包括t滤泡辅助(tfh)细胞数量的增多，其在一些实施方案中可包含icos上调的一个或多个子集。本领域技术人员将理解的是，生发中心中的tfh的增殖对于产生适应性b细胞反应是必要的，而且在人中，疫苗接种后在循环中出现的tfh通常与抗原特异性抗体的高频率相关。在一些实施方案中，已经确定所提供的免疫原性组合物在适当系统中(例如，在感染了sars-cov-2的人和/或其群体中和/或在用于其的模型系统中)实现了t细胞(例如，tfh细胞)数量的这种增多。例如，在一些实施方案中，t细胞(例如，tfh细胞)数量的这种增多可能已经在人类群体、非人灵长类动物模型(例如，恒河猴)和/或小鼠模型中的一者或多者中得到证明。在一些实施方案中，t细胞(例如，tfh细胞)数量的这种增多可能已经在用所提供的免疫原性组合物对这种小鼠模型进行免疫接种后(例如，至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天后)在小鼠模型的引流淋巴结、脾和/或血液中得到证明。

141、在一些实施方案中，已经在用于sars-cov-2的适当模型系统中建立了由所提供的免疫原性组合物诱导的针对sars-cov-2的保护性反应。例如，在一些实施方案中，这种保护性反应可能已经在动物模型中得到证明，例如非人灵长类动物模型(例如，恒河猴)和/或小鼠模型。在一些实施方案中，例如通过鼻内和/或气管内途径用sars-cov-2攻击已经接受了至少一次用所提供的免疫原性组合物进行的免疫接种的非人灵长类动物(例如，恒河猴)或其群体。在一些实施方案中，可以在用所提供的免疫原性组合物进行至少一次免疫接种(包括例如至少两次免疫接种)后数周(例如，5-10周)进行这种攻击。在一些实施方案中，可以当在已经接受用所提供的免疫原性组合物进行至少一次免疫接种(包括例如至少两次免疫接种)的非人灵长类动物(例如，恒河猴)中达到了可检测水平的sars-cov-2中和滴定度(例如，对sars-cov-2刺突蛋白和/或其片段的抗体反应，包括例如但不限于稳定的预融合刺突三聚体、s-2p，和/或对sars-cov-2的受体结合部分的抗体反应)时进行这种挑战。在一些实施方案中，保护性反应的特征在于在受攻击的非人灵长类动物(例如，恒河猴)的支气管肺泡灌洗液(bal)和/或鼻拭子中可检测的病毒rna不存在或减少。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物的特征可在于，与未免疫的动物群体例如非人灵长类动物(例如，恒河猴)相比，在已经接受用所提供的免疫原性组合物进行至少一次免疫接种(包括例如至少两次免疫接种)的群体(例如，恒河猴)中更大百分比的受攻击的动物(例如，非人灵长类动物)在它们的bal和/或鼻拭子中显示不存在可检测的rna。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物的特征可在于，与非免疫的动物群体例如非人灵长类动物(例如，恒河猴)相比，已经接受用所提供的免疫原性组合物进行至少一次免疫接种(包括例如至少两次免疫接种)的受攻击的动物例如群体中的非人者(例如，恒河猴)可在不迟于10天显示出鼻拭子中病毒rna的清除，包括例如不迟于8天、不迟于6天、不迟于4天等。

142、在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物在施用于有需要的受试者时基本上不增加疫苗相关的增强呼吸系统疾病的风险。在一些实施方案中，这种疫苗相关的增强呼吸系统疾病可能与抗体依赖性复制增强和/或与诱导具有差的中和活性和th2偏倚反应的抗体的疫苗抗原相关。在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物在施用于有需要的受试者时基本上不增加抗体依赖性复制增强的风险。

143、在一些实施方案中，单剂量的rna组合物(例如，配制在脂质纳米颗粒中的mrna)可以在疫苗接种不到10天内诱导治疗性抗体反应。在一些实施方案中，这种治疗性抗体反应的特征可在于，当在动物模型中以0.1至10ug或0.2-5ug的剂量进行疫苗接种后10天测量时，这种rna疫苗可诱导产生约10-100ug/ml igg。在一些实施方案中，这种治疗性抗体反应的特征可在于，在动物模型中以0.1至10ug或0.2-5ug的剂量进行疫苗接种的20天时测量，这种rna疫苗诱导约100-1000ug/ml igg。在一些实施方案中，如在动物模型中所测量，单剂量可以在疫苗接种后15天诱导10-200pvn50滴定度的假病毒中和滴定度。在一些实施方案中，如在动物模型中所测量，单剂量可以在疫苗接种后15天诱导50-500pvn50滴定度的假病毒中和滴定度。

144、在一些实施方案中，与不存在编码sars-cov2免疫原性蛋白或其片段(例如，刺突蛋白和/或受体结合结构域)的这种rna构建体观察到的相比，单剂量的rna组合物(例如mrna组合物)可将抗原特异性cd8和/或cd4 t细胞反应扩增至少50％或更多(包括例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多)。在一些实施方案中，与不存在编码sars-cov2免疫原性蛋白或其片段(例如，刺突蛋白和/或受体结合结构域)的这种rna构建体观察到的相比，单剂量的rna组合物可将抗原特异性cd8和/或cd4 t细胞反应扩增至少1.5倍或更多(包括例如，至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多)。

145、在一些实施方案中，与不存在编码sars-cov2免疫原性蛋白或其片段(例如，刺突蛋白和/或受体结合结构域)的这种mrna构建体观察到的相比，方案(例如，单剂量的mrna组合物)可将表现出th1表型(例如，特征在于ifn-gamma、il-2、il-4和/或il-5的表达)的t细胞扩增至少50％或更多(包括例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多)。在一些实施方案中，与不存在编码sars-cov2免疫原性蛋白或其片段(例如，刺突蛋白和/或受体结合结构域)的这种mrna构建体观察到的相比，方案(例如，单剂量的mrna组合物)可将表现出th1表型(例如，特征在于ifn-gamma、il-2、il-4和/或il-5的表达)的t细胞扩增至少例如至少1.5倍或更多(包括例如，至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多)。在一些实施方案中，t细胞表型可以是或包含th1-显性细胞因子谱(例如，特征在于inf-gamma阳性和/或il-2阳性)，和/或不在于或没有生物学上不显著的il-4分泌。

146、在一些实施方案中，如本文所述的方案(例如，一个或多个剂量的mrna组合物)诱导和/或实现了rbd特异性cd4+t细胞的产生。此外，本公开记载了编码sars-cov-2刺突蛋白的含rbd的部分(例如，并且不编码全长sars-cov-2刺突蛋白)的mrna组合物在rbd特异性cd4+t细胞的这种诱导和/或产生中可能是特别有用和/或有效的。在一些实施方案中，由本文所述的mrna组合物(例如，由编码sars-cov-2刺突蛋白且在一些实施方案中不编码全长sars-cov-2刺突蛋白的mrna组合物)诱导的rbd特异性cd4+t细胞表现出th1-显性细胞因子谱(例如，特征在于inf-gamma阳性和/或il-2阳性)，和/或在于没有生物学上不显著的il-4分泌。

147、在一些实施方案中，可以使用收集自受试者的pbmc采用离体测定法对接受rna组合物(例如，如本文所述)的受试者中的cd4+和/或cd8+t细胞反应(例如，本文所述)进行表征。

148、在一些实施方案中，可通过以下血清学免疫原性测定法中的一种或多种来评估本文所述的rna(例如mrna)组合物的免疫原性：检测接受所提供的rna组合物的受试者的血液样品中存在的针对sars-cov-2 s蛋白的igg、igm和/或iga，和/或使用sars-cov-2假病毒和/或野生型sars-cov-2病毒的中和测定法。

149、在一些实施方案中，在以10ug-100ug或1ug-50ug的剂量进行疫苗接种后7天内，rna组合物(例如，如本文所述)提供了相对低的副作用(例如，1级-2级疼痛、发红和/或肿胀)。在一些实施方案中，在以10ug-100ug的剂量进行疫苗接种后7天内，rna组合物(例如，如本文所述)提供了相对低的全身性事件(例如，1级-2级发热、疲劳、头痛、寒战、呕吐、腹泻、肌肉疼痛、关节疼痛、用药及其组合)的观察结果。

150、在一些实施方案中，rna(例如mrna)组合物的特征在于，当以10-100ug剂量或1ug-50ug对受试者施用时，针对sars-cov2免疫原性蛋白或其片段(例如，刺突蛋白和/或受体结合结构域)的igg可在疫苗接种后21天以100-100,000u/ml或500-50,000u/ml的水平产生。

151、在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码sars-cov-2的天然折叠的三聚体受体结合蛋白。在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码这种受体结合蛋白的变体，使得编码的变体以10pm或更低的kd与ace2结合，包括例如以9pm、8pm、7pm、6pm、5pm、4pm或更低的kd结合。在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码这种受体结合蛋白的变体，使得编码的变体以5pm的kd与ace2结合。在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码sars-cov-2的包含ace2受体结合位点的三聚体受体结合部分。在一些实施方案中，rna(例如mrna)包含sars-cov-2的受体结合部分的编码序列和三聚化结构域(例如，t4纤维蛋白的天然三聚化结构域(折叠子))，使得编码序列指导具有ace2受体结合位点并结合ace2的三聚体蛋白的表达。在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码sars-cov-2或其变体的三聚体受体结合部分，使得其kd小于sars-cov-2的单体受体结合结构域(rbd)的kd。例如，在一些实施方案中，rna(例如mrna)编码sars-cov-2或其变体的三聚体受体结合部分，使得其kd比sars-cov-2的rbd的kd小至少10倍(包括例如，至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1 000倍等)。

152、在一些实施方案中，当rna(例如，如本文所述)编码的sars-cov-2的三聚体受体结合部分以闭合构象与ace2和b0at1中性氨基酸转运蛋白复合时，可以确定其大小为约3-4埃，如通过电子低温显微镜检查(cryoem)所表征。在一些实施方案中，通过如本文所述的rna组合物或方法表征和/或实现的几何平均sars-cov-2中和滴定度可达到covid-19恢复期人员组(例如，在症状发作后20-40天和无症状恢复期开始后至少14天获得的来自covid-19恢复期人员的一组血清)的至少1.5倍，包括至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或更高。

153、在一些实施方案中，如本文提供的rna组合物的特征可在于，已经用这类组合物(例如，用至少一个剂量、至少两个剂量等)治疗的受试者与适当的对照(例如，没有经过这样的治疗并且在合理可比较的暴露条件下暴露于病毒的可比较的受试者或群体的确定预期水平)相比可显示出病毒rna在相关部位(例如，鼻子和/或肺等和/或易受感染的任何其它组织)的存在减少和/或更短暂。

154、在一些实施方案中，由mrna构建体(例如，如本文所述)表达的rbd抗原可通过添加t4-纤维蛋白来源的“折叠子”三聚化结构域进行修饰，例如以增加其免疫原性。

155、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于某些局部反应(例如，疼痛、发红和/或肿胀等)和/或全身性事件(例如，发热、疲劳、头痛等)可能会在疫苗接种后第2天出现和/或达到高峰。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于某些局部反应(例如，疼痛、发红和/或肿胀等)和/或全身性事件(例如，发热、疲劳、头痛等)可能会到疫苗接种后第7天消退。

156、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在接受rna组合物(例如，如本文所述)的受试者中没有观察到常规临床实验室值的1级或更大的变化或实验室异常。这类临床实验室测定法的实例可包括淋巴细胞计数、血液学变化等。

157、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，到第一次给药(例如，10-100ug(含)或1ug-50ug(含))后21天，针对sars-cov-2 s多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的几何平均浓度(gmc)可达到200-3000单位/ml或500-3000单位/ml或500-2000单位/ml，相比之下，covid-19恢复期人血清组为602单位/ml。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，到第二次给药(例如，10-30ug(含)；或1ug-50ug(含))后7天，针对sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的几何平均浓度(gmc)可增加至少8倍或更高，包括例如至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍或更高。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，到第二次给药(例如，10-30ug(含)；或1ug-50ug(含))后7天，针对sars-cov-2 s多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的几何平均浓度(gmc)可增加到1500单位/ml至40,000单位/ml或4000单位/ml至40,000单位/ml。在一些实施方案中，本文所述的抗体浓度可在第一次给药后持续至少20天或更长时间，包括例如至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天，或在第二次给药后持续至少10天或更长时间，包括例如至少15天、至少20天、至少25天或更长时间。在一些实施方案中，抗体浓度可持续到第一次给药后35天，或第二次给药后至少14天。

158、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，当在第二次给药(例如，1-50ug(含))后7天测量时，针对sars-cov-2 s多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的gmc与在covid-19恢复期人血清组中观察到的抗体浓度相比高至少30％(包括例如，高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少95％)。在许多实施方案中，本文所述的igg的几何平均浓度(gmc)是rbd结合igg的gmc。

159、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，当在第二次给药(例如，1-50 ug(含))后7天测量时，针对sars-cov-2 s多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的gmc与在covid-19恢复期人血清组中观察到的抗体浓度相比高至少1.1倍(包括例如，至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少15倍、高至少20倍、高至少25倍、高至少30倍)。在许多实施方案中，本文所述的igg的几何平均浓度(gmc)是rbd结合igg的gmc。

160、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，当在第二次给药后21天测量时，针对sars-cov-2 s多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的igg的gmc与在covid-19恢复期人血清组中观察到的抗体浓度相比高至少5倍(包括例如，高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少15倍、高至少20倍、高至少25倍、高至少30倍)。在许多实施方案中，本文所述的igg的几何平均浓度(gmc)是rbd结合igg的gmc。

161、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在第一次给药后21天观察到sars-cov-2中和几何平均滴定度(gmt)的增加(例如，至少30％、至少40％、至少50％或更多)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物的特征在于，在受试者接受第二剂量(例如，10μg-30μg(含))后7天获得了基本上更大的血清中和gmt，达到了150-300，相比之下covid-19恢复期血清组为94。

162、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在施用第二剂量后7天，保护功效为至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在施用第二剂量后7天，保护功效为至少70％。在一个实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在施用第二剂量后7天，保护功效为至少80％。在一个实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在施用第二剂量后7天，保护功效为至少90％。在一个实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，在施用第二剂量后7天，保护功效为至少95％。

163、在一些实施方案中，本文提供的rna组合物的特征在于，其在给药后(例如，第二次给药后)至少7天后诱导针对sars-cov-2的免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的rna组合物的特征在于，其在给药后(例如，第二次给药后)不到14天内诱导针对sars-cov-2的免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的rna组合物的特征在于，其在疫苗接种方案后至少7天后诱导针对sars-cov-2的免疫反应。在一些实施方案中，疫苗接种方案包括第一剂量和第二剂量。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量相隔至少21天施用。在一些这类实施方案中，在第一次给药后至少28天后诱导针对sars-cov-2的免疫反应。

164、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，如在来自接受本公开的rna(例如mrna)组合物(例如，剂量为10-30(含))的受试者的血清中测量，针对sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的抗体的几何平均浓度(gmc)显著高于恢复期血清组(例如，如本文所述)。在其中受试者可接受第二剂量(例如，第1次给药后21天)的一些实施方案中，如在来自受试者的血清中测量，针对sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的抗体的几何平均浓度(gmc)可比恢复期血清组gmc高8.0倍至50倍。在其中受试者可接受第二剂量(例如，第1次给药后21天)的一些实施方案中，如在来自受试者的血清中测量，针对sars-cov-2刺突多肽或其免疫原性片段(例如，rbd)的抗体的几何平均浓度(gmc)与恢复期血清组gmc相比可以为至少8.0倍或更高，包括例如至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍或更高。

165、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，与恢复期血清组的中和gmt相比，如在第一次给药后28天或第二次给药后7天测量，sars-cov-2中和几何平均滴定度可以为至少1.5倍或更高(包括例如，至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍或更高)。

166、在一些实施方案中，对受试者施用的方案可以是或包含单剂量。在一些实施方案中，对受试者施用的方案可包含多个剂量(例如，至少两个剂量、至少三个剂量或更多)。在一些实施方案中，对受试者施用的方案可包含第一剂量和第二剂量，它们相隔至少2周、相隔至少3周、相隔至少4周或更长时间给予。在一些实施方案中，这类剂量可以相隔至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。在一些实施方案中，剂量可以相隔数天施用，如相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60天或更多天。在一些实施方案中，剂量可相隔约1至约3周或相隔约1至约4周或相隔约1至约5周或相隔约1至约6周或相隔约1至超过6周施用。在一些实施方案中，剂量可隔开约7至约60天的时段，比如约14至约48天等。在一些实施方案中，剂量之间的最少天数可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天或更多。在一些实施方案中，剂量之间的最大天数可以为约60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21天或更少。在一些实施方案中，剂量可相隔约21至约28天。在一些实施方案中，剂量可相隔约19至约42天。在一些实施方案中，剂量可相隔约7至约28天。在一些实施方案中，剂量可以是约14至约24天。在一些实施方案中，剂量可以是约21至约42天。

167、在一些实施方案中，特别是对于经建立以在长于约3周的时间段内实现升高的抗体和/或t细胞滴定度的组合物，例如，在一些实施方案中，所提供的组合物经建立以在长于约3周的时间段内实现升高的抗体和/或t细胞滴定度(例如，对sars-cov-2刺突蛋白的相关部分具有特异性)；在一些这样的实施方案中，给药方案可以仅涉及单次剂量，或者可以涉及两次或更多次剂量，在一些实施方案中，所述两次或更多次剂量可以彼此相隔长于约21天或三周的时间段。例如，在一些这样的实施方案中，这样的时间段可以是约4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更长，或者约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长，或者在一些实施方案中约一年或更长。

168、在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量(和/或其它后续剂量)可通过肌内注射施用。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量可在三角肌中施用。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量可在同一臂中施用。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物作为相隔21天的一系列两次剂量(例如，每次0.3ml)施用(例如，通过肌内注射)。在一些实施方案中，每次剂量为约30ug。在一些实施方案中，每次剂量可以高于30ug，例如约40ug、约50ug、约60ug。在一些实施方案中，每次剂量可以低于30ug，例如，约20ug、约10ug、约5ug等。在一些实施方案中，每次剂量为约3ug或更低，例如约1ug。在一些这样的实施方案中，将本文所述的rna(例如mrna)组合物施用于16岁或更大(包括例如16-85岁)的受试者。在一些这样的实施方案中，将本文所述的rna(例如mrna)组合物施用于18-55岁的受试者。在一些这样的实施方案中，将本文所述的rna(例如mrna)组合物施用于56-85岁的受试者。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物作为单次剂量施用(例如，通过肌内注射)。

169、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，与具有sars-cov-2 rbd结合亲和力的参考人单克隆抗体(例如，如在j.ter meulen等人，plosmed.3，e237(2006).中所述的cr3022)相比，由此类rna组合物和/或方法诱导的rbd特异性igg(例如，多克隆反应)对rbd表现出更高的结合亲和力。

170、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清在一组(例如至少10种、至少15种或更多种)sars-cov-2刺突变体中(例如在本文所述的一组变体中)表现出中和活性。在一些实施方案中，此类sars-cov-2刺突变体包括rbd突变(例如但不限于与seq id no：1相比，q321l、v341i、a348t、n354d、s359n、v367f、k378r、r408i、q409e、a435s、n439k、k458r、1472v、g476s、s477n、v483a、y508h、h519p等)和/或刺突蛋白突变(例如但不限于与seq id no：1相比，d614g等)。本领域技术人员知晓各种刺突变体和/或记载它们的资源(例如，由covid-19病毒基因组分析管道维护并在https：//cov.lanl.gov/components/sequence/cov/int_sites_tbls.comp发现的刺突中的突变位点的表)(最后一次访问是2020年8月24日)，并且阅读本说明书，将理解，本文所述的rna组合物和/或方法可被表征为它们在接种疫苗的受试者中诱导血清的能力，所述血清对任何或所有此类变体和/或其组合表现出中和活性。

171、在特定实施方案中，编码sars-cov-2刺突蛋白的rbd的rna组合物的特征在于，接种疫苗的受试者的血清在一组(例如，至少10种、至少15种或更多种)sars-cov-2刺突变体中表现出中和活性，所述sars-cov-2刺突变体包括rbd变体(例如但不限于与seq id no：1相比，q321l、v341i、a348t、n354d、s359n、v367f、k378r、r408i、q409e、a435s、n439k、k458r、1472v、g476s、s477n、v483a、y508h、h5 19p等)和刺突蛋白变体(例如但不限于与seq idno：1相比，d614g)。

172、在特定实施方案中，编码在s2亚基的中心螺旋的顶部，在氨基酸位置986和987包括两个连续脯氨酸取代的sars-cov-2刺突蛋白变体的rna(例如mrna)组合物的特征在于，接种疫苗的受试者的血清在一组(例如，至少10种、至少15种或更多种)sars-cov-2刺突变体中表现出中和活性，所述sars-cov-2刺突变体包括rbd变体(例如但不限于与seq id no：1相比，q321l、v341i、a348t、n354d、s359n、v367f、k378r、r408i、q409e、a435s、n439k、k458r、1472v、g476s、s477n、v483a、y508h、h519p等)和刺突蛋白变体(例如但不限于与seqid no：1相比，d614g)。例如，在一些实施方案中，编码seq id no 7(s p2)的rna(例如mrna)组合物引发针对任何一种sars-cov-2刺突变体的免疫反应，所述sars-cov-2刺突变体包括rbd变体(例如但不限于与seq id no：1相比，q321l、v341i、a348t、n354d、s359n、v367f、k378r、r408i、q409e、a435s、n439k、k458r、1472v、g476s、s477n、v483a、y508h、h519p等)和刺突蛋白变体(例如但不限于与seq id no：1相比，d614g)。

173、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白501位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的n501y突变。

174、所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白501位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的n501y突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失等)。

175、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“关注变体202012/01”(voc-202012/o1；也称为谱系b.1.1.7)表现出中和活性。该变体之前在2020年12月被英国公共卫生部(public health england)命名为首个接受调查的变体(variant under investigation)(vui一202012/01)，但被重新分类为关注变体(voc-202012/01)。voc-202012/01是sars-cov-2的一种变体，于2020年10月在英国covid-19广泛流行期间从前一个月采集的样本中首次检测到，并于12月中旬迅速开始传播。它与英国covid-19感染率的显著增加相关；这种增加被认为至少部分是由于刺突糖蛋白受体结合结构域内n501y的改变，这是在人细胞中结合ace2所需要的。voc-202012/01变体由23种突变定义：13种非同义突变、4种缺失和6种同义突变(亦即，存在17种改变蛋白质的突变和6种不改变蛋白质的突变)。voc 202012/01中的刺突蛋白变化包括缺失69-70、缺失144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a和d1118h。voc-202012/o1中最重要的变化之一似乎是n50ly，即在氨基酸位点501从天冬酰胺(n)变为酪氨酸(y)。这种突变单独存在或与n末端结构域(ntd)中69/70位的缺失相结合，可能会增强病毒的可传播性。

176、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，缺失69-70、缺失144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a和d1118h。

177、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。该变体最早在2020年10月的样本中观察到，此后在南非，通过全基因组测序(wgs)已经证实了501.v2变体的超过300个病例，在2020年12月，它是该病毒的主要形式。初步结果表明，该变体可能具有增加的可传播性。501.v2变体由多种刺突蛋白变化定义，包括：d80a、d215g、e484k、n501y和a701v，并且最近收集的病毒有其它变化：l18f、r246i、k417n和缺失242-244。

178、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y和a701v，以及任选存在的：与seq id n0：1相比的l18f、r246i、k417n和缺失242-244。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与se0 id no：1相比的d614g突变。

179、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的h69/v70缺失。

180、在一些实施方案中，一种或多种与seq id no：1相比包括刺突蛋白中的h69/v70缺失的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，y144缺失、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、1692v、s1147l、m1229i等)。

181、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“关注变体202012/01”(voc-202012/01；也称为谱系b.1.1.7)表现出中和活性。

182、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，缺失69-70、缺失144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a和d1118h。

183、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“cluster 5”表现出中和活性，所述变体也被丹麦国家血清研究所(danish state serum institute，ssi)称为δfvi刺突。它是在north jutland，denmark发现的，据信是通过水貂养殖场从水貂传播给人类的。在cluster5中，已证实病毒的刺突蛋白中存在几种不同的突变。特定突变包括69-70δhv(蛋白质69和70位的组氨酸和缬氨酸残基缺失)、y453f(453位从酪氨酸变为苯丙氨酸)、i692v(692位从异亮氨酸变为缬氨酸)、m1229i(1229位从甲硫氨酸变为异亮氨酸)和任选存在的s1147l(1147位从丝氨酸变为亮氨酸)。

184、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，缺失69-70、y453f、i692v、m1229i和任选存在的s1147l。

185、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白614位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的d614g突变。

186、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白614位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的d614g突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、n501y、a570d、p681h、t716i、s982a、d11 18h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、1692v、s1147l、m1229i等)。

187、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“关注变体202012/01”(voc-202012/01；也称为谱系b.1.1.7)表现出中和活性。

188、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，缺失69-70、缺失144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a和d1118h。

189、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和d614g，以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i、k417n和缺失242-244。

190、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白501和614位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的n501y突变和d614g突变。

191、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白501和614位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的n501y突变和d614g突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、a570d、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、i692v、s1147l、m1229i等)。

192、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“关注变体202012/01”(voc-202012/01；也称为谱系b.1.1.7)表现出中和活性。

193、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，缺失69-70、缺失144、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a和d1118h。

194、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和d614g，以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i、k417n和缺失242-244。

195、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白484位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的e484k突变。

196、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白484位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的e484k突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、i692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、h655y、t1027i、v1176f等)。

197、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。

198、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y和a701v，以及任选存在的：与seq id no：1相比的l1 8f、r246i、k41 7n和缺失242-244。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与seq id no：1相比的d614g突变。

199、谱系b.1.1.248被称为巴西变体，是sars-cov-2的一种变体，被命名为p.1谱系，并且具有17个独特的氨基酸变化，其中10个在其刺突蛋白中，包括n501y和e484k。b.1.1.248源自b.1.1.28。e484k存在于b.1.1.28和b.1.1.248中。b.1.1.248具有多种s蛋白多态性[l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、h655y、t1027i、v1176f]，并且在某些关键的rbd位置(k417、e484、n501)与南非描述的变体相似。

200、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“b.1.1.28”表现出中和活性。

201、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“b.1.1.248”表现出中和活性。

202、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、h655y、t1027i和v1176f。

203、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白501和484位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的n501y突变和e484k突变。

204、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白501和484位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的n501y突变和e484k突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、i692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、h655y、t1027i、v1176f等)。

205、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。

206、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y和a701v，以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i、k417n和缺失242-244。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与seq id no：1相比的d614g突变。

207、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“b.1.1.248”表现出中和活性。

208、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、h655y、t1027i和v1176f。

209、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白501、484和614位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的n501y突变、e484k突变和d614g突变。

210、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白501、484和614位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的n501y突变、e484k突变和d614g突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、a570d、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、a701v、l18f、r246i、k417n、l242/a243/l244缺失、y453f、i692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、h655y、t1027i、v1176f等)。

211、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和d614g，以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i、k417n和缺失242-244。

212、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的l242/a243/l244缺失。

213、在一些实施方案中，一种或多种与seq id no：1相比包括刺突蛋白中的l242/a243/l244缺失的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、k417n、y453f、i692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、h655y、t1027i、v1176f等)。

214、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。

215、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和缺失242-244以及任选存在的：与seq idno：1相比的l18f、r246i和k417n。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与seq id no：1相比的d614g突变。

216、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白417位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的k417n或k417t突变。

217、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白417位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的k417n或k417t突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq id no：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、e484k、a701v、l18f、r246i、l242/a243/l244缺失、y453f、i692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、h655y、t1027i、v1176f等)。

218、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。

219、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和k417n以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i和缺失242-244。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与seq id no：1相比的d614g突变。

220、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“b.1.1.248”表现出中和活性。

221、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、h655y、t1027i和v1176f。

222、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括在刺突蛋白417和484和/或501位的突变。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对一种或多种sars-cov-2刺突变体表现出中和活性，所述刺突变体与seq id no：1相比，包括刺突蛋白中的k417n或k417t突变以及e484k和/或n501y突变。

223、在一些实施方案中，一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白417和484和/或501位突变的sars-cov-2刺突变体或所述一种或多种包括与seq id no：1相比刺突蛋白中的k417n或k417t突变以及e484k和/或n501y突变的sars-cov-2刺突变体可包括与seq idno：1相比的一种或多种其它突变(例如但不限于与seq id no：1相比，h69/v70缺失、y144缺失、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h、d80a、d215g、a701v、l18f、r246i、l242/a243/l244缺失、y453f、1692v、s1147l、m1229i、t20n、p26s、d138y、r190s、h655y、t1027i、v1176f等)。

224、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“501.v2”表现出中和活性。

225、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比的d80a、d215g、e484k、n501y、a701v和k417n以及任选存在的：与seq id no：1相比的l18f、r246i和缺失242-244。所述sars-cov-2刺突变体还可包括与seq id no：1相比的d614g突变。

226、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体“b.1.1.248”表现出中和活性。

227、在特定实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，l18f、t20n、p26s、d138y、r190s、k417t、e484k、n501y、h655y、t1027i和v1176f。

228、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对sars-cov-2刺突变体omicron(b.1.1.529)变体表现出中和活性。omicron(b.1.1.529)变体是在南非检测到的sars-cov-2变体。出现了多种omicron变体或亚系，包括例如ba.1、ba.2、ba.2.12.1、ba.3、ba.4、ba.5和ba.2.75亚系。如本文所用，除非另有说明，否则“omicron变体”是指首次公开的omicron变体(ba.1)或此后出现的它的任何变体(例如本文所述的omicron变体)。在一些实施方案中，omicron(b.1.1.529)ba.1变体中的刺突蛋白变化包括a67v、δ69-70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe(在氨基酸214之后插入epe)、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f。在一些实施方案中，omicron(b.1.1.529)变体中的刺突蛋白变化包括a67v、δ69-70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe(在氨基酸214之后插入epe)、g339d、s371l、s373p、s375f、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f。在一些实施方案中，omicron ba.2变体中的刺突变化包括t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。在一些实施方案中，ba.4和ba.5具有相同的刺突蛋白氨基酸序列，在这种情况下，“ba.4/5”用于任一omicron变体。在一些实施方案中，omicron ba.4/5中的刺突变化包括：t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。在一些实施方案中，omicronba.2.75中的刺突变化包括t19i、δ24-26、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、n354d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

229、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变中的至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36或至少37个的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，t547k、h655y、d614g、n679k、p681h、n969k、s373p、s371l、n440k、g339d、g446s、n856k、n764k、k417n、d796y、q954h、t95i、a67v、l981f、s477n、g496s、t478k、q498r、q493r、e484a、n501y、s375f、y505h、v143del、h69del、v70del、n211del、l212i、ins214epe、g142d、y144del、y145del、l141del、y144f、y145d、g142del。

230、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变中的至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24个或所有以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，t547k、h655y、d614g、n679k、p681h、n969k、s373p、s371l、n440k、g339d、g446s、n856k、n764k、k417n、d796y、q954h、t95i、a67v、l981f、s477n、g496s、t478k、q498r、q493r、e484a。所述sars-cov-2刺突变体可包括以下突变中的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5个或所有以下突变：与seq id no：1相比，n501y、s375f、y505h、v143del、h69del、v70del，以及/或者可包括以下突变中的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5个或所有以下突变：与seq id no：1相比，n211del、l212i、ins214epe、g142d、y144del、y145del。在一些实施方案中，所述sars-cov-2刺突变体可包括以下突变中的至少1、至少2、至少3个或所有以下突变：与seq id no：1相比，l141del、y144f、y145d、g142del。

231、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变中的至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33个的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，a67v、δ69-70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f。

232、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变中的至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30或至少31个的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。

233、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变中的至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34个的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

234、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，a67v、δ69-70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f。

235、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：t19i、δ24-26、a27s、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、s477n、t478k、e484a、q493r、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov2刺突变体表现出中和活性：与seq id no：1相比，t19i、δ24-26、a27s、δ69/70、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

236、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，a67v、δ69-70、t95i、g142d、δ143-145、δ211、l212i、ins214epe、g339d、s371l、s373p、s375f、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f。

237、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法的特征在于，接种疫苗的受试者的血清针对包括以下突变的sars-cov-2刺突变体表现出中和活性：与seqid no：1相比，t19i、δ24-26、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、1210v、v213g、g257s、g339h、n354d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、q498r、n501y、y505h d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

238、与seq id no：1相比，由本文所述rna(例如mrna)编码的sars-cov-2刺突蛋白可能包括，也可能不包括d614g突变。

239、在一些实施方案中，由本文所述rna(例如mrna)编码的sars-cov-2刺突蛋白包含弗林蛋白酶切割位点中的突变(例如，在一些实施方案中，seq id no：1的残基682-685)。在一些实施方案中，由本文所述rna(例如mrna)编码的sars-cov-2刺突蛋白包含防止被弗林蛋白酶(例如，人弗林蛋白酶)切割的弗林蛋白酶切割位点中的突变。在一些实施方案中，本文所述的sars-cov-2蛋白包含wo2021163365或wo2021243122中公开的弗林蛋白酶突变(例如，gsas突变)，两案的内容通过引用整体并入本文。

240、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或方法可在至少50％的接受此类rna(例如mrna)组合物和/或方法的受试者中提供抗sars-cov-2保护和/或降低sars-cov-2感染的严重程度。

241、在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括18-55岁的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括56-85岁的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括老年受试者(例如，超过60、65、70、75、80、85岁等的受试者，例如年龄为65-85岁的受试者)。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括18-85岁的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括18岁或更年轻的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括12岁或更年轻的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括10岁或更年轻的受试者。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括青少年群体(例如，大约12岁至大约17岁的个体)。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括儿童群体(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括婴儿(例如，小于1岁)。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体不包括其母亲在妊娠期间已接受本文所述此类rna(例如mrna)组合物的婴儿(例如，小于1岁)。不希望受任何特定理论的束缚，一项大鼠研究表明，在妊娠期间给予此类rna(例如mrna)组合物的雌性大鼠中诱导的sars-cov-2中和抗体反应可传递给胎儿。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体包括其母亲在妊娠期间未接受本文所述此类rna(例如mrna)组合物的婴儿(例如，小于1岁)。在一些实施方案中，待用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括孕妇；在一些实施方案中，其母亲在妊娠期间接种疫苗(例如，接受至少一次剂量的，或可选择地仅接受两次剂量的)的婴儿在出生后最初的几周、几个月或甚至几年(例如，1、2、3、4、5、6、7、8周或更长，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或更长，或者1、2、3、4、5年或更长)内不接种疫苗。可选择地或另外地，在一些实施方案中，其母亲在妊娠期间接种疫苗(例如，接受至少一次剂量的，或可选择地仅接受两次剂量的)的婴儿在出生后，例如在出生后最初的几周、几个月或甚至几年(例如，1、2、3、4、5、6、7、8周或更长，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或更长，或者1、2、3、4、5年或更长)内接受减少的疫苗接种(例如更低的剂量和/或更少的施用次数，例如加强剂，和/或在给定的时间段内更低的总暴露量)，或者可能需要减少的疫苗接种(例如在给定的时间段内更低的剂量和/或更少的施用次数，例如加强剂)。在一些实施方案中，将本文提供的组合物施用于不包括孕妇的群体。

242、在一些特定实施方案中，根据包括在妊娠约24周后(例如，妊娠约22、23、24、25、26、27、28或更多周后)施用第一剂量的方案将本文提供的组合物施用于孕妇；在一些实施方案中，根据包括在妊娠约34周之前(例如，妊娠约30、31、32、33、34、35、36、37、38周之前)施用第一剂量的方案将本文提供的组合物施用于孕妇。在一些实施方案中，根据包括在妊娠约24周后(例如，妊娠约27周后，例如，妊娠约24周至34周之间，或妊娠约27周至34周之间)施用第一剂量和约21天后施用第二剂量的方案将本文提供的组合物施用于孕妇；在一些实施方案中，两次剂量均在分娩前施用。不希望受任何特定理论的束缚，提出这样的方案(例如，包括在妊娠约24周或27周之后和任选地在妊娠约34周之前施用第一剂量和任选地在约21天内(理想地在分娩之前)施用第二剂量)在安全性(例如，减少早产或胎儿发病率或死亡率的风险)和/或疗效(例如，给予婴儿的残转疫苗接种)方面相对于替代的给药方案(例如，在妊娠期间的任何时间给药，在妊娠期间避免给药，和/或例如在妊娠后期给药，使得在妊娠期间仅施用一次剂量)具有某些优势。在一些实施方案中，由例如根据本文所述的特定方案在妊娠期间接种疫苗的母亲所生的婴儿在出生后的一段时间(例如，如本文所述)内可能不需要进一步接种疫苗，或者可能需要减少的疫苗接种(例如更低的剂量和/或更少的施用次数，例如加强剂，和/或在给定的时间段内更低的总暴露量)。

243、在一些实施方案中，将本文提供的组合物施用于其中建议女性在接种疫苗后(例如，在接受第一剂量的疫苗后、在接受最后剂量的疫苗后等)的一段时间内不妊娠的群体；在一些这样的实施方案中，所述时间段可以是至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周或更长，或者可以是至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或更长。

244、在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括具有一种或多种特别高风险病症或病史的一个或多个群体，例如，如本文所述。例如，在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括其职业和/或环境暴露可显著增加其感染sars-cov-2风险的受试者(包括，例如但不限于，公共交通运输人员、囚犯、杂货店工人、长期护理机构中的居民、屠夫或其他肉类加工工人、医护人员和/或第一反应人员，例如应急反应人员)。在特定实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括医护人员和/或第一反应人员，例如应急反应人员。在一些实施方案中，用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括有吸烟或吸电子烟史(例如，在6个月、12个月或更长时间内，包括慢性吸烟或吸电子烟史)的群体。在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括已被确定为更易受sars-cov-2感染的某些族群。

245、在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括具有可能已被确定为更易受sars-cov-2感染的血型的某些群体。在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括免疫功能低下的受试者(例如，患有hiv/aids的受试者；癌症患者(例如，接受抗肿瘤治疗)；正在服用某些免疫抑制药物的患者(例如，移植患者、癌症患者等)；自身免疫性疾病或预期需要免疫抑制治疗的其他生理状况(例如，3个月内、6个月内或更长时间内)；以及患有影响免疫系统的遗传性疾病(例如，先天性无丙种球蛋白血症、先天性iga缺乏)的患者)。在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括患有感染性疾病的群体。例如，在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可以包括那些感染人类免疫缺陷病毒(hiv)和/或肝炎病毒(例如，hbv、hcv)的群体。在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括具有基础性医学状况的群体。这类基础性医学状况的例子可以包括但不限于高血压、心血管疾病、糖尿病、慢性呼吸系统疾病，例如慢性肺病、哮喘等，癌症以及其他慢性疾病，例如狼疮、类风湿性关节炎、慢性肝病、慢性肾病(例如，3期或更糟，例如在一些实施方案中以肾小球滤过率(gfr)小于60ml/min/1.73m2为特征)。在一些实施方案中，用本文所述rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括超重或肥胖受试者，例如，具体而言包括体重指数(bmi)高于约30kg/m2的受试者。在一些实施方案中，用本文所述的rna(例如mrna)组合物治疗的群体可包括有既往covid-19诊断，或者有当前或既往sars-cov-2感染证据(例如根据血清学或鼻拭子)的受试者。在一些实施方案中，所治疗的群体包括白人和/或非西班牙裔/非拉丁裔。

246、在一些实施方案中，可选择某些本文所述的rna(例如mrna)组合物施用至亚洲人群体，或在特定实施方案中施用至较年长的亚洲人群体(例如60岁或以上，例如60-85岁或65-85岁)。

247、在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至已被确定在施用前不显示既往感染和/或当前感染证据的受试者，和/或在这些受试者中对所述组合物进行评估；在一些实施方案中，既往感染和/或当前感染的证据可以是或者包括受试者中(例如其生物样本中，如血液、细胞、粘液和/或组织)存在完整病毒或任何病毒核酸、蛋白质、脂质等的证据，和/或受试者对其的免疫反应的证据。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至已被确定在施用前显示既往感染和/或当前感染的证据的受试者，和/或在这些受试者中对所述组合物进行评估；在一些实施方案中，既往感染和/或当前感染的证据可以是或者包括受试者中(例如其生物样本中，如血液、细胞、粘液和/或组织)存在完整病毒或任何病毒核酸、蛋白质、脂质等的证据，和/或受试者对其的免疫反应的证据。在一些实施方案中，基于在第1剂当日具有阳性n-结合抗体检测结果或阳性核酸扩增检测(naat)结果，认为受试者有既往感染。

248、在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至已被告知有副作用风险的受试者，副作用可能包括例如以下一种或多种：寒战、发热、头痛、注射部位疼痛、肌肉疼痛、疲劳；在一些实施方案中，将rna(例如，mrna)组合物施用至受试者，如果发生了一种或多种此类副作用，表现为超过轻度或中度，持续了一天以上或几天，或者如果出现了受试者有合理的理由认为可能与接受所述组合物相关的任何严重或意外的事件，则要求受试者告知医疗服务提供者。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至受试者，所述受试者已被要求将特定的医学状况告知医疗服务提供者，所述医学状况可包括例如过敏、出血性疾病或服用血液稀释剂药物、母乳喂养、发烧、免疫受损状态或服用影响免疫系统的药物、妊娠或计划妊娠等中的一种或多种。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如，mrna)组合物施用至受试者，所述受试者已被要求将已接受另一种covid-19疫苗告知医疗服务提供者。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如，mrna)组合物施用至不具有以下医学状况之一的受试者：出现发热性疾病、接受免疫抑制剂治疗、接受抗凝血剂治疗、患有出血性疾病(例如，禁忌肌内注射的疾病)、或妊娠和/或哺乳/授乳。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至未接受另一种covid-19疫苗的受试者。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如mrna)组合物施用至对所述rna(例如mrna)组合物的任何组分没有过敏反应的受试者。这种过敏反应的例子包括但不限于呼吸困难、呼吸道和/或喉咙肿胀、心跳加快、皮疹、头晕和/或虚弱。在一些实施方案中，将本文提供的rna(例如，mrna)组合物施用至接受了第一剂且对第一剂没有(例如，如本文所述的)过敏反应的受试者。在受试者接受一剂本文提供的rna(例如，mrna)组合物后发生过敏反应的一些实施方案中，可对所述受试者采取一种或多种干预措施，例如治疗以控制和/或减轻此类过敏反应的症状，例如，使用退热剂和/或抗炎剂。

249、在一些实施方案中，告知已接受至少一剂本文提供的rna(例如，mrna)组合物的受试者避免暴露于冠状病毒(例如，sars-cov-2)，除非且直至从施用第二剂以来已经过去数天(例如，至少7天、至少8天、9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天等)。例如，告知已接受至少一剂本文提供的rna(例如mrna)组合物的受试者采取预防sars-cov-2感染的措施(例如保持社交距离、戴口罩、频繁洗手等)，除非并且直至从施用第二剂以来已经过去数天(例如，至少7天、至少8天、9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天等)。因此，在一些实施方案中，施用本文提供的rna(例如mrna)组合物的方法包括将第二剂本文提供的这种rna(例如mrna)组合物施用至接受了第一剂并采取预防措施以避免暴露于冠状病毒(例如sars-cov-2)的受试者。

250、在一些实施方案中，本文所述的rna组合物可递送至需要其的受试者的引流淋巴结，例如，用于疫苗启动。在一些实施方案中，这种递送可以通过肌内施用所提供的rna组合物来进行。

251、在一些实施方案中，不同的特定rna组合物可施用至不同的受试者群体；另一选择为或另外地，在一些实施方案中，不同的给药方案可以施用至不同的受试者群体。例如，在一些实施方案中，施用至特定受试者群体的rna组合物的特征可以是在这些受试者群体中的一种或多种特定效应(例如，发生率和/或影响度)。在一些实施方案中，这样的效应可以是或包括例如中和抗体和/或t细胞(例如th1型t细胞，例如cd4+和/或cd8+t细胞)的滴定度和/或持久性，对抗攻击的保护(例如通过注射和/或鼻暴露等)，副作用(例如反应原性)的发生率、严重性和/或持久性等。

252、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可根据建立的方案施用以降低每1000人-年covid-19发病率，所述方案是例如基于实验室检测如核酸扩增检测(naat)。在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可根据建立的方案施用以降低每1000人-年covid-19发病率，所述方案是在接受至少一剂所提供的rna(例如mrna)组合物且无既往sars-cov-2感染的血清学或病毒学证据(例如，在接受最后一剂之后至多7天)的受试者中基于实验室检测(例如核酸扩增检测(naat))而建立的。在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可根据建立的方案施用以降低每1000人-年确诊严重covid-19发病率。在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可根据建立的方案施用，以降低接受至少一剂所提供rna(例如mrna)组合物且无既往sars-cov-2感染的血清学或病毒学证据的受试者中每1000人-年确诊严重covid-19发病率。

253、在一些实施方案中，可根据建立的方案施用一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物，以在一段时间内产生针对sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)的中和抗体，如在达到或超过参考水平(例如，基于人sars-cov-2感染/covid-19恢复期血清确定的参考水平)的受试者的血清中所测量，和/或在一段时间内诱导细胞介导的免疫反应(例如，针对sars-cov-2的t细胞反应)，包括，例如在一些实施方案中，诱导识别sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)内的至少一个或多个mhc限制性(例如，mhc i类限制性)表位的t细胞。在一些这样的实施方案中，所述一段时间可以是至少2个月、3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。在一些实施方案中，由疫苗诱导的t细胞(例如，cd8+t细胞)识别的一个或多个表位可存在于mhc i类等位基因上，所述等位基因存在于群体中至少50％的受试者中，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多；在一些这样的实施方案中，mhc i类等位基因可以是hla-b*0702、hla-a*2402、hla-b*3501、hla-b*4401或hla-a*0201。在一些实施方案中，表位可以包含hla-a*0201 ylqprtfll；hla-a*0201 rlqslqtyv；hla-a*2402 qyikwpwyi；hla-a*2402 nynylyrlf；hla-a*2402kwpwyiwlgf；hla-b*3501 qptesivrf；hla-b*3501 ipfamqmay；或hla-b*3501 lpfndgvyf。

254、在一些实施方案中，功效被评估为在疫苗接种方案之前和期间无既往sars-cov-2感染的血清学或病毒学证据的个体中每1000人-年covid-19发病率；另一选择为或另外地，在一些实施方案中，功效被评估为在疫苗接种方案之前和期间有和无既往sars-cov-2感染证据的受试者中每1000人-年covid-19发病率。在一些这样的实施方案中，这样的发病率是在最后一剂疫苗(例如，单剂方案中的第一剂；两剂方案中的第二剂等)后的一段特定时间内的covid-19确诊病例的发病率；在一些实施方案中，这样的一段时间可以是在特定天数(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多)内(即，最多并包括7天)。在一些实施方案中，这样的一段时间可以是在7天内或14天内或21天内或28天内。在一些实施方案中，这样的一段时间可以是在7天内。在一些实施方案中，这样的一段时间可以是在14天内。

255、在一些实施方案中(例如，在评估功效的一些实施方案中)，如果以下一项或多项成立，则确定受试者出现covid-19感染：在来自受试者的样本中检测到sars-cov-2核酸，检测到特异性识别sars-cov-2(例如，sars-co-v-2刺突蛋白)的抗体，有covid-19感染的一种或多种症状，及其组合。在一些这样的实施方案中，sars-cov-2核酸的检测可以包括，例如，对中鼻甲拭子样本的naat试验。在一些这样的实施方案中，相关抗体的检测可以包括血液样本或其部分的血清学测试。在一些这样的实施方案中，covid-19感染的症状可以是或包括：发热、新发或加重的咳嗽、新发或加重的气短、寒战、新发或加重的肌肉疼痛、新发味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、腹泻、呕吐及其组合。在一些这样的实施方案中，covid-19感染的症状可以是或包括：发热、新发或加重的咳嗽、新发或加重的气短、寒战、新发或加重的肌肉疼痛、新发味觉或嗅觉丧失、喉咙痛、腹泻、呕吐、疲劳、头痛、鼻塞或流鼻涕、恶心及其组合。在一些这样的实施方案中，如果受试者出现了一种这样的症状并且sars-cov-2核酸检测阳性或抗体检测阳性，或二者同时为阳性，则确定受试者出现covid-19感染。在一些这样的实施方案中，如果受试者出现了一种这样的症状并且sars-cov-2核酸检测阳性，则确定受试者出现了covid-19感染。在一些这样的实施方案中，如果受试者出现了一种这样的症状并且sars-cov-2抗体检测阳性，则确定该受试者出现了covid-19感染。

256、在一些实施方案中(例如，在评估功效的一些实施方案中)，如果受试者出现了以下一种或多种情况，则确定受试者出现了严重的covid-19感染：静息时临床征象指示严重全身性疾病(例如，下列中的一种或多种：呼吸率大于或等于每分钟30次，心率每分钟125次或以上，海平面室内空气条件下spo2低于或等于93％，或pao2/fio2低于300m hg)，呼吸衰竭(例如，需要高流量吸氧、无创通气、机械通气、ecmo中的一种或多种)，休克迹象(收缩压低于90mm hg、舒张压低于60mm hg，需要升压药)，明显的急性肾、肝或神经功能障碍，入住重症监护室，死亡，及其组合。

257、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可以根据建立的方案施用，以降低报告至少一种以下情况的受试者的百分比：(i)每次施用后长达7天的一种或多种局部反应(例如，如本文所述)；(ii)每次施用后长达7天的一次或多次全身性事件；(iii)从第一剂到最后一剂后1个月的不良事件(例如，如本文所述)；和/或(iv)从第一剂至最后一剂后6个月的严重不良事件(例如，如本文所述)。

258、在一些实施方案中，可以监测已经接受本文所述rna(例如mrna)组合物的一名或多名受试者(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间)，以评估例如对施用的组合物的组分的免疫反应的存在、暴露于sars-cov-2或另一冠状病毒和/或对其免疫反应的证据、任何不良事件的证据等。在一些实施方案中，可以通过远程访问进行监测。另一选择为或另外地，在一些实施方案中，监测可以是在场进行的。

259、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物所赋予的治疗效果的特征在于：(i)sars-cov-2抗s1结合抗体水平高于预定阈值；(ii)sars-cov-2抗rbd结合抗体水平高于预定阈值；和/或(iii)sars-cov-2血清中和滴定度高于阈值水平，例如在基线、疫苗接种完成后1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和/或24个月时。在一些实施方案中，抗s1结合抗体和/或抗rbd结合抗体水平和/或血清中和滴定度可以用几何平均浓度(gmc)、几何平均滴定度(gmt)或几何平均升高倍数(gmfr)来表征。

260、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物所赋予的治疗效果的特征可在于，显示sars-cov-2血清中和滴定度高于预定阈值(例如，在基线时、疫苗接种完成后1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和/或24个月)的治疗受试者的百分比高于显示sars-cov-2血清中和滴定度高于此一预定阈值(例如，如本文所述)的未治疗受试者的百分比。在一些实施方案中，血清中和滴定度可以用几何平均浓度(gmc)、几何平均滴定度(gmt)或几何平均升高倍数(gmfr)来表征。

261、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物所赋予的治疗效果可以通过sars-cov-2 nva特异性结合抗体的检测来表征。

262、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物所赋予的治疗效果可以通过核酸扩增检测进行的sars-cov-2检测来表征。

263、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物所赋予的治疗效果可以通过下列来表征：细胞介导的免疫反应(例如，针对sars-cov-2的t细胞反应)的诱导，包括例如在一些实施方案中，识别sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)内的至少一个或多个mhc限制性(例如，mhc i类限制性)表位的t细胞的诱导。在一些实施方案中，疫苗诱导的t细胞(例如，cd8+t细胞)识别的一种或多种表位可存在于mhc i类等位基因上，所述等位基因存在于群体中至少50％的受试者中，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多；在一些这样的实施方案中，mhc i类等位基因可以是hla-b*0702、hla-a*2402、hla-b*3501、hla-b*4401或hla-a*0201。在一些实施方案中，表位可包含hla-a*0201 ylqprtfll；hla-a*0201 rlqslqtyv；hla-a*2402 qyikwpwyi；hla-a*2402nynylyrlf；hla-a*2402 kwpwyiwlgf；hla-b*3501 qptesivrf；hla-b*3501 ipfamqmay；或hla-b*3501 lpfndgvyf。

264、在一些实施方案中，当有足够的证据(后验概率)表明主要ve1或者主要ve1和主要ve2两者都＞30％或更高(包括例如大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或更高)时，可以建立一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物的主要疫苗功效(ve)，其中主要ve被定义为主要ve＝100×(1-irr)；而irr计算为疫苗组中covid-19患病率与安慰剂组中相应患病率的比率。主要ve1表示本文所述预防性rna(例如mrna)组合物针对疫苗接种前无感染证据的参与者中确诊的covid-19的ve，主要ve2表示本文所述预防性rna(例如mrna)组合物针对疫苗接种后所有参与者中确诊的covid-19的ve。在一些实施方案中，可以顺序评估主要ve1和ve2，以控制2.5％的总i型误差(分级检测)。在一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物被证明可实现如上所述的主要ve终点的一些实施方案中，可例如通过如上所述的用于主要ve终点评估(分级检测)的相同方法来依次评估次要ve终点(例如，在疫苗接种前没有感染证据的参与者中确诊的严重covid-19以及在所有参与者中确诊的严重covid-19)。在一些实施方案中，主要和/或次要ve终点的评估可以基于以与疫苗或安慰剂组1∶1的比例随机分配的至少20,000名或更多受试者(例如，至少25,000名或更多受试者)，例如，基于以下假设：(i)安慰剂组中每年1.0％的患病率，和(ii)20％的参与者不可评估或有既往感染sars-cov-2的血清学证据，这有可能使他们对进一步感染具有免疫力。

265、在一些实施方案中，一种或多种本文所述的rna(例如mrna)组合物可根据建立的方案施用，以实现免疫反应的维持和/或继续加强。例如，在一些实施方案中，施用方案可以包括第一剂，任选地随后施用一个或多个后续剂次；在一些实施方案中，可以选择对任何这样的后续剂次的需要、时间和/或量，以维持、增强和/或改进一种或多种免疫反应或其特征。在一些实施方案中，剂次的数量、时间和/或量已确定以在施用至相关群体时有效。在一些实施方案中，可以针对个体受试者调整剂次的数量、时间和/或量；例如，在一些实施方案中，个体受试者中的免疫反应的一个或多个特征可以在接受第一剂之后评估至少一次(并且可选地多于一次，例如多次，一般间隔开，通常以预选的间隔期)。例如，可以评估抗体、b细胞和/或t细胞(例如cd4+和/或cd8+t细胞)的存在和/或由其分泌的细胞因子的存在，和/或特定抗原和/或表位的识别和/或对其反应的程度。在一些实施方案中，可根据此类评估确定对后续剂次的需要、时间和/或量。

266、如上所述，在一些实施方案中，可从接受任何特定剂次起，对已接受本文所述rna(例如mrna)组合物的一名或多名受试者进行监测(例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或更长时间，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间)，以评估例如对所施用的组合物的组分的免疫反应的存在、暴露于sars-cov-2或另一种冠状病毒和/或对其免疫反应的证据、任何不良事件的证据等，包括评估下列中的一项或多项：抗体、b细胞和/或t细胞(例如cd4+和/或cd8+t细胞)的存在，和/或由其分泌的细胞因子的存在，和/或特定抗原和/或表位的识别和/或对其反应的程度。本文所述的组合物可以根据包括一个或多个这样的监测步骤的方案进行施用。

267、例如，在一些实施方案中，评估、确定和/或选择对相对于第一剂次的第二剂次(和/或相对于前一剂次的随后剂次)的需要、时间和/或量，使得施用这样的第二(或随后)剂次实现在第一(或其他前一)剂次之后观察到的免疫反应(例如，如本文所述)的放大或改进。在一些实施方案中，与第一剂后观察到的免疫反应水平相比，免疫反应(例如本文所述的免疫反应)的这种放大可以是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。在一些实施方案中，与第一剂后观察到的免疫反应水平相比，免疫反应的这种放大可以是至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或更高。

268、在一些实施方案中，评估、确定和/或选择对相对于第一(或其他前一)剂次的第二(或随后的)剂次的需要、时间和/或量，使得较晚剂次的施用延长在较早剂次之后观察到的免疫反应(例如，如本文所述)的持续时间；在一些这样的实施方案中，持续时间可以延长至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月或更长时间。在一些实施方案中，第一剂后观察到的免疫反应可以由下列来表征：针对sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)的中和抗体的产生(在来自受试者的血清中测量)，和/或细胞介导的免疫反应(例如，针对sars-cov-2的t细胞反应)的诱导，包括，例如在一些实施方案中，识别sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)内的至少一个或多个mhc限制性(例如，mhc i类限制性)表位的t细胞的诱导。在一些实施方案中，疫苗诱导的t细胞(例如，cd8+t细胞)识别的一个或多个表位可存在于mhc i类等位基因上，所述等位基因存在于群体中至少50％的受试者中，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多；在一些这样的实施方案中，mhc i类等位基因可以是hla-b*0702、hla-a*2402、hla-b*3501、hla-b*4401或hla-a*0201。在一些实施方案中，表位可包含hla-a*0201 ylqprtfll；hla-a*0201 rlqslqtyv；hla-a*2402 qyikwpwyi；hla-a*2402 nynylyrlf；hla-a*2402 kwpwyiwlgf；hla-b*3501qptesivrf；hla-b*3501 ipfamqmay；或hla-b*3501 lpfndgvyf。

269、在一些实施方案中，评估、确定和/或选择对相对于第一剂次的第二剂次(或相对于前一剂次的其他后续剂次)的需要、时间和/或量，使得施用所述第二(或后续)剂次维持或超过免疫反应的参考水平；在一些这样的实施方案中，参考水平是基于从受试者抽取的人sars-cov-2感染/covid-19恢复期血清和/或pbmc样本确定的(例如，在pcr确认的诊后至少一段时间，例如至少14天或更长时间，包括例如15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天或更长时间，当受试者无症状时)。在一些实施方案中，免疫反应可以由下列表征：针对sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)的中和抗体的产生(在来自受试者的血清中测量)，和/或细胞介导的免疫反应(例如，针对sars-cov-2的t细胞反应)的产生，包括，例如在一些实施方案中，识别sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)内的至少一个或多个mhc限制性(例如，mhc i类限制性)表位的t细胞的诱导。在一些实施方案中，疫苗诱导的t细胞(例如，cd8+t细胞)识别的一个或多个表位可存在于mhc i类等位基因上，所述等位基因存在于群体中至少50％的受试者中，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多；在一些这样的实施方案中，mhc i类等位基因可以是hla-b*0702、hla-a*2402、hla-b*3501、hla-b*4401或hla-a*0201。在一些实施方案中，表位可包含hla-a*0201 ylqprtfll；hla-a*0201 rlqslqtyv；hla-a*2402 qyikwpwyi；hla-a*2402 nynylyrlf；hla-a*2402 kwpwyiwlgf；hla-b*3501qptesivrf；hla-b*3501 ipfamqmay；或hla-b*3501 lpfndgvyf。

270、在一些实施方案中，确定对第二(或随后)剂次的需要、时间和/或量可包括在第一(或其他前一)剂次之后(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天或更长时间后)，对下列进行评估的一或多个步骤：针对sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)的中和抗体的存在和/或表达水平(在来自受试者的血清中测量)，和/或细胞介导的免疫反应(例如，针对sars-cov-2的t细胞反应)的诱导，包括，例如在一些实施方案中，识别sars-cov-2刺突多肽和/或其免疫原性片段(例如，rbd)内的至少一个或多个mhc限制性(例如，mhc i类限制性)表位的t细胞的诱导。在一些实施方案中，疫苗诱导的t细胞(例如，cd8+t细胞)识别的一个或多个表位可存在于mhc i类等位基因上，所述等位基因存在于群体中至少50％的受试者中，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多；在一些这样的实施方案中，mhc i类等位基因可以是hla-b*0702、hla-a*2402、hla-b*3501、hla-b*4401或hla-a*0201。在一些实施方案中，表位可包含hla-a*0201 ylqprtfll；hla-a*0201 rlqslqtyv；hla-a*2402 qyikwpwyi；hla-a*2402 nynylyrlf；hla-a*2402kwpwyiwlgf；hla-b*3501 qptesivrf；hla-b*3501 ipfamqmay；或hla-b*3501 lpfndgvyf。

271、在一些实施方案中，本文提供的试剂盒可包括实时监测日志记录装置，例如在一些实施方案中，所述装置能够提供运送温度、运送时间和/或定位。

272、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物可以在容器(例如小瓶或注射器)，例如玻璃容器(例如玻璃小瓶或注射器)中运送、储存和/或使用，在一些实施方案中，所述容器可以是单剂容器或多剂容器(例如，可以被布置和构造成容纳，和/或在一些实施方案中可以容纳单剂或多剂的用于施用的产品)。在一些实施方案中，多剂容器(例如多剂小瓶或注射器)可被布置和构造成容纳，和/或可容纳2、3、4、5、6、7、8、9、10剂或更多剂；在一些特定实施方案中，它可以被设计成容纳和/或可以容纳5剂。在一些实施方案中，单剂或多剂容器(例如单剂或多剂小瓶或注射器)可被布置和构造成容纳和/或可容纳大于所指示数量的剂次的体积或量，例如，以便允许在转移和/或施用中出现一些损失。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物可在不含防腐剂的玻璃容器(例如不含防腐剂的玻璃小瓶或注射器，例如单剂或多剂不含防腐剂的玻璃小瓶或注射器)中运送、储存和/或使用。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物可在不含防腐剂的玻璃容器(例如，不含防腐剂的玻璃小瓶或注射器，例如，单剂或多剂不含防腐剂的玻璃小瓶或注射器)中运送、储存和/或使用，所述玻璃容器包含冷冻液体，例如，在一些实施方案中包含0.45ml的冷冻液体(例如，包括5剂)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在低于室温、4℃或以下、0℃或以下、-20℃或以下、-60℃或以下、-70℃或以下、-80℃或以下、-90℃或以下等的温度下进行运送、储存和/或使用。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在-80℃至-60℃之间的温度下进行运送、储存和/或使用，并且在一些实施方案中避光。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在低于约25℃的温度下进行运送、储存和/或使用，并且在一些实施方案中避光。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在低于约5℃(例如低于约4℃)的温度下进行运送、储存和/或使用，并且在一些实施方案中避光。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在低于约-20℃的温度下进行运送、储存和/或使用，并且在一些实施方案中避光。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)可以保持在高于约-60℃的温度下进行运送、储存和/或使用(例如，在一些实施方案中在约-20℃或高于约-20℃，在一些实施方案中在约4-5℃或高于约4-5℃，在两种情况下任选地在约25℃以下)，并且在一些实施方案中避光，或不采取积极措施(例如，冷却措施)使储存温度实质上低于-20℃左右。

273、在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)与热保护材料或容器和/或温度调节材料一起和/或在热保护材料或容器和/或温度调节材料的背景下运送、储存和/或使用。例如，在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物和/或放置其的容器(例如小瓶或注射器)与冰和/或干冰和/或与隔热材料一起运送、储存和/或使用。在一些特定实施方案中，将放置有rna(例如，mrna)组合物的容器(例如，小瓶或注射器)放在托盘或其他保持装置中，并进一步与温度调节(例如，冰和/或干冰)材料和/或隔热材料接触(或在温度调节(例如，冰和/或干冰)材料和/或隔热材料的存在下)。在一些实施方案中，放置有所提供的rna(例如mrna)组合物的多个容器(例如，多个小瓶或注射器，例如本文所述的单次使用或多次使用的小瓶或注射器)是放置在一起的(例如，在共同的盘、架、盒等中)，并与温度调节(例如，冰和/或干冰)材料和/或隔热材料一起包装(或在温度调节(例如，冰和/或干冰)材料和/或隔热材料的存在下)。仅举一个例子，在一些实施方案中，放置有rna(例如mrna)组合物的多个容器(例如，多个小瓶或注射器，例如本文所述的单次使用或多次使用的小瓶或注射器)被放在共同的托盘或架子中，并且多个这样的托盘或架子被堆叠在纸箱中，纸箱在热(例如，隔热)运送器中被温度调节材料(例如，干冰)包围。在一些实施方案中，周期性地补充温度调节材料(例如，在到达地点的24小时内，和/或每2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天等)。优选地，重新放入热运送器应当不频繁，并且理想地应当一天不超过两次。在一些实施方案中，热运送器在被打开后的5、4、3、2或1分钟或更短时间内被重新关闭。在一些实施方案中，所提供的rna(例如mrna)组合物在热运送器内储存一段时间(任选地在特定温度范围内)仍是有用的。例如，在一些实施方案中，如果如本文所述的含有所提供的rna(例如mrna)组合物的热运送器被或已经被保持(例如储存)在约15℃至约25℃的温度范围内，则rna(例如mrna)组合物可使用长达10天；亦即，在一些实施方案中，向受试者施用已在热运送器(热运送器处于约15℃至约25℃范围内的温度下)内保持不超过10天的所提供的rna(例如mrna)组合物。另一选择为或另外地，在一些实施方案中，如果所提供的rna(例如mrna)组合物被或已经被保持(例如储存)在热运送器内(热运送器已经被保持(例如储存)在约15℃至约25℃的温度范围内)，则其可以被使用长达10天；亦即，在一些实施方案中，向受试者施用保持在热运送器(热运送器已保持在约15℃至约25℃范围内的温度下不超过10天)中的所提供的rna(例如mrna)组合物。

274、在一些实施方案中，所提供的rna(例如mrna)组合物以冷冻状态运送和/或储存。在一些实施方案中，所提供的rna(例如mrna组合物)以冷冻悬浮液的形式运送和/或储存，在一些实施方案中其不含防腐剂。在一些实施方案中，将冷冻的rna(例如mrna)组合物解冻。在一些实施方案中，解冻的rna(例如mrna)组合物(例如悬浮液)可包含白色至灰白色的不透明无定形颗粒。在一些实施方案中，如果将解冻的rna(例如mrna)组合物保持(例如储存)在室温或低于室温的温度(例如低于约30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、8℃、4℃等)，则组合物可在解冻后最多使用很短的天数(例如1、2、3、4、5或6天)。在一些实施方案中，解冻的rna(例如mrna)组合物可在约2℃至约8℃的温度下储存(例如储存如此短的天数)后使用；另一选择为或另外地，解冻的rna(例如mrna)组合物可以在室温解冻后的很短的小时数(例如，1、2、3、4、5、6小时)内使用。因此，在一些实施方案中，向受试者施用已解冻并在室温或低于室温的温度下，在一些实施方案中在约2℃和约8℃之间保持不超过6、5、4、3、2或1天的所提供的rna(例如mrna)组合物。另一选择为或另外地，在一些实施方案中，向受试者施用已解冻并在室温下保持不超过6、5、4、3、2或1小时的所提供的rna(例如mrna)组合物。在一些实施方案中，以浓缩状态运送和/或储存所提供的rna(例如mrna)组合物。在一些实施方案中，这样的浓缩组合物在施用前被稀释。在一些实施方案中，稀释的组合物在稀释后约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时内施用；在一些实施方案中，这种施用是在稀释后6小时内进行。因此，在一些实施方案中，将所提供的rna(例如mrna)组合物的稀释制剂在稀释后6小时内施用至受试者(例如，如本文所述在已保持在适当温度下后，例如在低于室温的温度下、在4℃或以下、在0℃或以下、在-20℃或以下、在-60℃或以下、在-70℃或以下、在-80℃或以下等，且通常在约2℃或以上，例如在约2℃与约8℃之间或在约2℃与约25℃之间)。在一些实施方案中，在稀释后数小时(例如，约10、约9、约8、约7、约6、约5小时或更少的小时数)内丢弃未使用的组合物；在一些实施方案中，未使用的组合物在稀释6小时内被丢弃。

275、在一些实施方案中，储存、运送或使用的rna(例如mrna)组合物(例如冷冻组合物、液体浓缩组合物、稀释液体组合物等)可能已在实质上高于-60℃的温度下保持了至少1、2、3、4、5、6、7天或更长时间，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长时间，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间；在一些这样的实施方案中，这样的组合物可能已在约-20℃或以上的温度下保持这样一段时间，和/或在至多或约4-5℃的温度下保持这样一段时间，和/或可以在高于约4-5℃的温度下保持这样一段时间，和任选地在约25℃的温度下保持一段时间，该段时间小于两(2)个月和/或任选地至多约一(1)个月。在一些实施方案中，这种组合物可能没有在实质上高于约4-5℃的温度下储存、运送或使用(或以其他方式暴露)，特别是没有在约25℃的温度或接近约25℃的温度下储存、运送或使用(或以其他方式暴露)长达约2周的时间，或在一些实施方案中1周的时间。在一些实施方案中，这种组合物可能没有在实质上高于约-20℃的温度下储存、运送或使用(或以其他方式暴露)，特别是没有在约4-5℃的温度下或接近于约4-5℃的温度下储存、运送或使用(或以其他方式暴露)长达约12个月、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月的时间，或者在一些实施方案中，长达约8周或6周或实质上超过约2个月或在一些实施方案中为3个月或在一些实施方案中为4个月的时间。

276、在一些实施方案中，储存、运送或使用的rna(例如mrna)组合物(例如冷冻组合物、液体浓缩组合物、稀释液体组合物等)可以避光。在一些实施方案中，可采取一个或多个步骤以减少或最小化这类组合物的光暴露(例如，可将组合物置于容器如小瓶或注射器内)。在一些实施方案中，避免暴露于阳光直射和/或紫外光。在一些实施方案中，稀释的溶液可以在正常的室内光条件下处理和/或使用(例如，不采取特别的步骤来最小化或减少室内光暴露)。应当理解，在处理(例如稀释和/或施用)本文所述的rna(例如mrna)组合物的过程中，需要严格遵守无菌技术。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物不经静脉内施用(例如不静脉注射)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物不经皮内施用(例如，不皮内注射)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物不经皮下施用(例如，不皮下注射)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物不以静脉内、皮内或皮下的任何方式施用(例如不以静脉内、皮内或皮下的任何方式注射)。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物不施用至对其任何成分具有已知超敏反应的受试者。在一些实施方案中，监测施用了rna(例如mrna)组合物的受试者是否出现一种或多种过敏反应征象。在一些实施方案中，施用rna(例如mrna)组合物的受试者既往已经接受了至少一剂不同的sars-cov-2疫苗；在一些实施方案中，施用了rna(例如mrna)组合物的受试者既往没有接受过不同的sars-cov-2疫苗。在一些实施方案中，在施用rna(例如，mrna)组合物之前(例如，在解冻、稀释和/或施用这种组合物之前或之后不久)，迅速测量受试者的体温；在一些实施方案中，如果确定此受试者是发热的，则延迟或取消施用。在一些实施方案中，如本文所述的rna(例如mrna)组合物不施用至正在接受抗凝治疗或正患有或易患将禁忌肌内注射的出血障碍或病症的受试者。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物由医疗专业人员使用，所述医疗专业人员已将与副作用和风险相关的信息告知接受所述组合物的受试者。在一些实施方案中，本文所述的rna(例如mrna)组合物由医疗专业人员使用，所述医疗专业人员已同意提交任何严重不良事件的不良事件报告，严重不良事件可包括例如下列中的一种或多种：死亡、出现残疾或先天性异常/出生缺陷(例如，在受试者的孩子中)、住院(包括现有住院延长)、危及生命的事件、防止死亡的药物或手术干预、进行正常生活功能的能力的持续或显著或实质破坏；或可能危害个体并且可能需要药物或手术干预(治疗)以防止其他结局之一的另一重要医学事件。

277、在一些实施方案中，将所提供的rna组合物施用至18岁以下、或17岁以下、或16岁以下、或15岁以下、或14岁以下、或13岁以下的个体群体，例如根据所建立的对于下文所述一种或多种局部反应事件具有不超过下文所述发生率的发生率的方案施用：

278、·注射部位疼痛(第一剂和/或第二剂后75％，和/或第二剂后更低的发生率，例如第二剂后65％)；

279、·注射部位发红(第一剂和/或第二剂后小于5％)；和/或

280、·注射部位肿胀(第一剂和/或第二剂后小于5％)。

281、在一些实施方案中，将所提供的rna组合物施用至18岁以下、或17岁以下、或16岁以下、或15岁以下、或14岁以下、或13岁以下的个体群体，例如根据所建立的对于下文所述一种或多种全身反应事件具有不超过下文所述发生率的发生率的方案施用：

282、·疲劳(第一剂和/或第二剂后55％)；

283、·头痛(第一剂和/或第二剂后50％)；

284、·肌肉疼痛(第一剂和/或第二剂后40％)；

285、·寒战(第一剂和/或第二剂后40％)；

286、·关节痛(第一剂和/或第二剂后20％)；

287、·发热(第一剂和/或第二剂后25％)；

288、·呕吐(第一剂和/或第二剂后10％)；和/或

289、·腹泻(第一剂和/或第二剂后10％)。

290、在一些实施方案中，将减轻一种或多种(例如，本文所述)局部反应和/或全身反应事件的一种或多种症状的药物施用至18岁以下、或17岁以下、或16岁以下、或15岁以下、或14岁以下、或13岁以下的个体，所述个体已经被施用所提供的rna组合物并且已经出现了(例如，本文所述)局部和/或全身反应事件中的一种或多种。在一些实施方案中，可以将解热药物和/或镇痛药物施用至这些个体。