一种重组谷氨酸脱羧酶GAD67缓释温敏凝胶及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、脊髓损伤(spinal cord injury,sci)是由炎症、感染、外伤等引起的脊髓功能丧失，临床主要表现为运动感觉功能障碍、尿便失禁、神经痛、性功能障碍等，慢性并发症通常包括呼吸系统、心血管系统、泌尿生殖系统和胃肠系统功能障碍等。sci具有高致残率、高死亡率、高医疗负担的特点，患者可并发一系列感觉、运动或自主功能障碍，严重影响患者的生活质量。sci后的病理损害分为原发性sci和继发性sci。原发性sci是指对脊髓即刻的、机械性挫伤或压迫，从而导致脊髓发生机械性损伤。继发性sci是指损伤后数小时乃至数周内病变脊髓节段的病理演变。可能的机制包括炎症反应及缺血再灌注损伤、脂质过氧化与自由基生成、兴奋性氨基酸毒性作用、内源性阿片肽生成、电解质失衡、细胞凋亡等机制，最终加速神经元丢失和轴突变性。目前认为原发性sci发生在损伤后短时间内，且产生的神经损伤是不可逆的，只能预防而不能控制,但继发性sci的过程是可调控的。尽管临床上采用外科手术、药物、高压氧等措施治疗sci，但远期的临床效果并不显著，对sci仍然缺乏有效的治疗方法。因此，研究治疗sci新疗法具有重要的临床意义。

2、谷氨酸(glu)是中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基酸(excitatory aminoacid,eaa)，在突触可塑性的诱导和神经发生中起重要作用。在神经系统缺血、外伤及退行性变等病理条件下，glu可通过兴奋谷氨酸受体介导神经毒性作用，引起神经功能紊乱。sci后脊髓组织释放的大量glu所致的毒性作用不仅是引起继发性sci的重要原因，而且还可加重继发性sci。sci后细胞外glu明显升高，引起兴奋毒性作用，表现为突触后n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)和ampa/kainite受体活化，受体门控离子通道开放，钙离子内流，神经细胞的脂质和蛋白质代谢紊乱，一系列的变化引起不可逆性蛋白质变性而致神经细胞死亡，影响神经功能，并触发或(和)增强细胞内的钙离子依赖性过程：激活蛋白激酶、磷脂酶和一氧化氮合酶等，兴奋多价小饱和脂肪酸，导致花生四烯酸(aa)代谢增强，钙泵活性降低，atp能量产生不足等；促进突触前膜eaa的大量释放，激活突触后nmda受体操控的钙离子通道，使细胞内钙离子浓度进一步持续升高，加重钙离子内环境稳态失衡，导致神经细胞损伤；同时还产生大量氧自由基，作用于蛋白质、核酸等生物大分子，损伤细胞，从而进一步促进eaa的释放，抑制其再摄取，形成恶性循环，导致细胞损伤，诱导细胞凋亡。

3、谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，gad)主要存在于哺乳动物大脑和胰腺中，有两种异构体形式gad65和gad67。gad65主要表达于轴突终末，而gad67主要表达于抑制性神经元胞体和神经终末。在大鼠和狗的脊髓内，gad65和gad67广泛表达于脊髓灰质。gad催化glu合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)，是脑内合成抑制性神经递质gaba的唯一限速酶。

4、海藻酸钠(sodium alginate，sa)是一类从褐藻中提取出的天然线性多糖，由β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古洛糖醛酸(g)通过1,4-糖苷键结合而成。海藻酸钠自身带有二价阴离子，在二价阳离子存在条件下可交联形成网状水凝胶。该凝胶具有很好的亲水性，营养物质易于渗透扩散，在体内可通过水解及酶解途径降解吸收，且其酶解产物对细胞无毒害作用，故在组织工程研究中日益受到重视。

5、泊洛沙姆407(poloxamer 407)，商品名pluronic f127，是一种温敏型即位凝胶的赋形剂，由不同比例的聚氧乙烯和聚氧丙烯组成的非离子型表面活性剂，平均相对分子质量约为12600。具有高亲和性、缓释、定点释放等多种功能及特殊的反向热胶凝作用，即低温时(4～5℃)为液体，体温(37℃)下转变为凝胶。可以注射操作，包埋搭载多肽、蛋白、细胞以及大分子药物。由于具有在接近人体温度时由液态转变为凝胶状态的特点，使它在体内原位载药释放以及组织工程支架领域有着广阔的应用前景。

6、目前，未见利用基因工程手段合成gad67，将其制备成一种缓释温敏凝胶，实现gad67在脊髓损伤部位的局部缓释，促进脊髓损伤修复的研究。

技术实现思路

1、发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶及其制备方法与应用。

2、为了能够降低sci后脊髓组织局部高钙，本发明拟联合海藻酸钠凝胶，利用海藻酸钠与ca2+原位交联，减少ca2+诱导的sci继发性损伤。

3、为了能够让gad67在脊髓损伤部位局部缓释，本发明拟使用温敏凝胶赋形剂，优选pluronic f127，利用其体内温度下迅速转变为凝胶的优势，使得包载的gad67与脊髓损伤部位产生良好接触，减少流失同时在受损脊髓周围得以长久停留，促进脊髓损伤的修复。

4、技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、本发明提供了一种重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶，由1～20ng/μl重组谷氨酸脱羧酶gad67、1～4％w/w海藻酸钠、15～30％w/w温敏凝胶赋形剂制备而成。

6、优选地，所述温敏凝胶赋形剂选自泊洛沙姆407或泊洛沙姆188。

7、本发明还提供上述重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)制备重组谷氨酸脱羧酶gad67；

9、(2)制备缓释温敏凝胶；

10、(3)在步骤(2)制得的凝胶中加入重组谷氨酸脱羧酶gad67，搅拌即得所述重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶。

11、一种优选地具体实施方式是，

12、步骤(1)中，根据e.colik-12的gad67基因序列设计引物，5’和3’端分别加入ecori和hind iii酶切位点；以e.colik-12的基因组dna为模板，用高保真酶pcr扩增gad67基因序列；pcr产物和pet28a载体分别经ecor i和hind iii双酶切，并用t4dna连接酶连接，转化e.coli dh 5α感受态细胞；用ecor i和hind iii消化重组质粒，pcr筛选阳性克隆，并进行dna测序；重组质粒pet28a-gad67转化宿主菌e.colibl21，加入iptg诱导，制得gad67粗酶液，纯化得到重组谷氨酸脱羧酶gad67。

13、一种优选地具体实施方式是，步骤(2)中，将海藻酸钠加入水中，搅拌混合，冷却至4℃，加入温敏凝胶赋形剂，搅拌混合，直至得到黏稠透明溶液，即为所述缓释温敏凝胶。

14、进一步地，所述温敏凝胶赋形剂的最终浓度为20％w/w。

15、进一步地，所述海藻酸钠的最终浓度为2％w/w。

16、优选地，步骤(3)中，所述重组谷氨酸脱羧酶gad67加入浓度为10ng/μl。

17、本发明还提供了上述重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶在脊髓损伤修复中的应用。

18、所述重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶将脊髓损伤时过表达的glu转换为gaba，同时利用海藻酸钠与ca2+原位交联降低局部高钙，促进脊髓损伤的修复。

19、有益效果：

20、本发明将制备的重组谷氨酸脱羧酶gad67包载于含有温敏凝胶赋形剂的海藻酸钠凝胶中，获得一种重组谷氨酸脱羧酶gad67缓释温敏凝胶，使得包载的gad67与脊髓损伤部位产生良好接触，减少流失同时在受损脊髓周围得以长久停留，促进脊髓损伤的修复。本发明通过在细胞和动物水平对所述gad67缓释温敏凝胶治疗sci能力的研究，证实本发明制备的凝胶能够治疗脊髓损伤，为sci的治疗提供了新的思路和方法。