己酮可可碱在角膜移植排斥方面的应用

1.本发明属于医药领域，涉及己酮可可碱在抑制c-rel基因的表达和c-rel调控的炎症因子的表达，从而抑制角膜移植排斥方面的应用。


背景技术：

2.角膜移植是治疗严重感染，化学伤等所致不可逆性角膜盲的唯一治疗手段，移植后排斥是角膜移植失败的主要原因。全球每年角膜移植数量数十万例，其排斥率高达50％以上，尤其是高危角膜移植。造成这一难题的关键在于角膜移植排斥免疫发生机制不明确。
3.临床应用免疫抑制剂是预防和治疗角膜移植免疫排斥最常见的方法，它的优点主要是易于操作和患者医从性较高。目前主要使用的免疫抑制剂是类固醇激素、糖皮质激素、环孢素a、他克莫司、霉酚酸酯、雷帕霉素和fty720等。但临床上使用的各类抗排斥药物防治疗效不佳,并且由于缺乏特异性，药物毒副作用较大，只能短期使用来控制急性炎症。
4.近年来抗体和融合蛋白免疫抑制剂因靶点明确和作用效果明显而受到了广泛的关注，已成功用于角膜移植免疫排斥防治的抗体和融合蛋白免疫抑制剂靶点主要包括il-2、cd25、tnf-α、ctla4-ig、il-10，tlr2，ccr7等。
5.己酮可可碱(ptxf)为二甲基黄嘌呤类衍生物，是一种甲基黄嘌呤抑制物和一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂，可以通过抑制c-rel的表达降低炎症因子的分泌。在临床上，常用于对于新生儿败血症及脓毒血症的辅助免疫治疗。但在眼科疾病中尚未有应用报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为临床预防和治疗角膜移植排斥提供新的手段和策略。
7.在一方面，本发明提供了己酮可可碱(ptxf)在用于制备抑制细胞内c-rel基因的表达和/或c-rel调控的炎症因子的表达的药物中的应用。
8.发明提供了己酮可可碱(ptxf)或其衍生物作为活性成分在用于制备抑制细胞内c-rel基因的表达和/或c-rel调控的炎症因子的表达的药物中的应用。
9.施予个体有效量的己酮可可碱或其衍生物可以抑制个体体内巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、原代t淋巴细胞、cd4+t细胞中一种或多种细胞内c-rel基因的表达和/或抑制c-rel调控的炎症因子的表达。
10.所述c-rel调控的炎症因子包括tnf-α、il-1β、il-17a、ifn-γ、il-2、il-6中的一个或多个。
11.在二方面，本发明提供了己酮可可碱或其衍生物用于制备预防、抑制和/或治疗角膜移植排斥的药物中的应用。
12.优选地，本发明所述己酮可可碱或其衍生物作为活性成分制备成外用或非肠道途径的形式进行给药，施用于角膜移植个体的眼部或眼周，可缓解或治疗其存在的包括但不限于突然流泪、眼红、眼内异物感、视物模糊、角膜植片水肿中的一种或多种症状。
13.本发明所述己酮可可碱或其衍生物用于角膜移植排斥药物的活性成分，可以单独
使用，也可以与其它抑制免疫反应、镇痛消炎、促进损伤愈合的药物或其他药用可接受辅料联合用药，包括但不限于水、生理盐水、pbs缓冲液、葡萄糖、免疫抑制剂(类固醇激素、糖皮质激素、环孢素a、他克莫司、霉酚酸酯、雷帕霉素和fty720等)、靶向c-rel的小分子化合物、多肽或sirna药物(il-2r单克隆抗体、抗cd25单克隆抗体、贝伐单抗、tnf-α单克隆抗体、cd154单克隆抗体、ctla4-ig等)中的一种或多种。
14.本发明所指的联合用药治疗过程中，包括运用己酮可可碱或其衍生物与其他一种或多种抑制免疫反应、镇痛消炎、促进损伤愈合药物一起使用以增加总体疗效。联合用药时的药量和给药时间应根据不同的情况下所取得的最合理治疗效果确定。所涵盖的药剂配伍包括己酮可可碱或其衍生物、近似物的有效剂量。
15.己酮可可碱或其衍生物为活性成分制备成的产品药物，可以通过外用或非肠道途径给药，也可通过其他方法给药，此处所指的外用是指滴于或敷于组织外或组织内，特别是眼表、眼内或眼周；此处所指的非肠道途径给药是指皮下皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、结膜内、创伤部位内、颅内注射或滴注技术等。由技术人员运用常规的方法配比，混合最终成为所需要的药物剂型。可以是滴丸、水悬溶液、水溶液、粉末、粉剂、片剂、胶囊、冲剂、滴眼液、注射液、冻干粉针剂型、胶体、胶体溶液、缓释制剂、纳米制剂或以其他形式的剂型用于动物或临床。
16.本发明还提供了一种用于预防、抑制和/或治疗角膜移植后排斥反应的方法，即施予角膜移植后个体有效量的己酮可可碱或其衍生物。
17.本发明说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
18.在本发明中，术语“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。优选地，所述患者是人。这样的“个体”或“患者”典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述药物、药用组合来预防或治疗的病症，包括但不限于如下角膜移植排斥症状：突然流泪、眼红、眼内异物感、视物模糊、角膜植片水肿明显等；包括但不限于c-rel基因的表达增高、c-rel调控的炎症因子表达增高，例如tnf-α、il-1β、il-17a、ifn-γ、il-2、il-6中的一个或多个。
19.本发明中，术语“有效量”、“有效剂量”是指向“个体”或“患者”赋予治疗或抑制作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述药物、药用组合物。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、角膜移植排斥的严重性、个体体重和总体健康状况、以及有经验者根据不同情况的建议。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。可以制成任何可使用的制剂剂型。
20.有益效果
21.ptxf能够有效抑制角膜移植排斥个体细胞内c-rel基因的表达和/或抑制c-rel调控的炎症因子的表达，有力切断先天性免疫与适应性免疫间的恶性炎症回路，并且副作用小、安全性较高，还具有广谱抗炎作用，能应用于治疗多种自身免疫病、移植排斥和炎症等疾病。
附图说明
22.图1、a:实施例2中，同系组和异系组小鼠角膜western-blot检测c-rel表达量的结果，异系组c-rel表达高于同系组；b:实施例2中，同系组和异系组小鼠角膜移植后排斥情况评分曲线，异系组排斥率显著高于同系组；c：实施例2中，同系组和异系组角膜植片生存曲线，异系组生存率显著低于同系组。
23.图2、实施例3中，受c-rel调控的炎症因子表达elisa检测结果。
24.图3、a:实施例4中，野生组(wt)和敲除组(c-rel ko)小鼠排斥情况评分曲线；b：角膜植片生存曲线。
25.图4、实施例5中，pbmc细胞c-rel表达rt-pcr及western blot检测结果。
26.图5、实施例5中，受c-rel调控的炎症因子表达elisa检测结果。
27.图6、实施例6中，实验组及对照组小鼠角膜实物图。
28.图7、实施例6中，实验组及对照组小鼠排斥情况评分曲线；实验组及对照组角膜植片生存曲线。
29.图8、实施例6中，两组小鼠elisa检测结果和western-blot检测结果。
30.图9、实施例7中，ptxf处理后c-rel表达western blot检测结果。
31.图10、实施例7中，ptxf处理后受c-rel调控的炎症因子表达elisa检测结果。
32.图11、在使用ptxf处理人类cd4+t后受c-rel调控的炎症因子rt-pcr检测结果。
33.图12、实施例9中，小鼠泪液分泌量及角膜敏感度。
34.图13、实施例9中，细胞的凋亡率。
具体实施方式
35.为了研究ptxf靶向c-rel在防治角膜移植排斥中的应用，发明人首先利用同系及异系角膜移植排斥小鼠角膜中c-rel及其调控的下游炎症因子在蛋白水平的表达量。同时对处于角膜移植术后排斥期及非排斥期的患者血液中c-rel在蛋白水平的表达量进行测定，结果证明角膜移植排斥过程中c-rel表达升高，受c-rel调控的炎症因子分泌增加。
36.然后使用c-rel全身敲除小鼠(c-rel ko)和野生型(wt)小鼠，说明c-rel促进角膜移植排斥。
37.后续使用20mg/ml的c-rel小分子抑制剂ptxf滴眼治疗已经建立异系角膜移植排斥模型小鼠，防治角膜移植排斥。在体外，使用ptxf处理多种免疫细胞，包括骨髓来源巨噬细胞(bmdm：bone-marrow derived macrophage)、巨噬细胞细胞系(raw264.7)，骨髓来源树突状细胞(bmdc：bone-marrow derived dendritic cell)、人白血病淋巴细胞细胞系(jurkat)、原代t淋巴细胞。并且，通过检测发现ptxf处理过的上述各种免疫细胞在蛋白水平降低c-rel的表达，以及在这些免疫细胞中，受c-rel调控的炎症因子表达。在体内实验中，通过建立角膜移植排斥动物模型，分别对实验组及对照组小鼠使用20mg/ml的ptxf滴眼治疗，发现在ptxf治疗后，实验组小鼠排斥率明显降低，植片发生排斥更晚。剪取术后14-21天排斥高峰期小鼠角膜进行匀浆，通过elisa检测实验组及对照组小鼠角膜组织中炎症因子分泌情况，发现，ptxf治疗组小鼠炎症因子分泌显著降低。另外，通过检测发现ptxf治疗后小鼠c-rel表达在蛋白水平出现下调。
38.下面进一步由解释本发明的以下实施例进行示例性说明，下列实施例仅用于说明
本发明，而不应视为限定本发明的范围。除非另有说明，本文所使用的技术和科学术语为本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
39.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
40.实验材料
41.balb/c、c57bl/6j小鼠购买于斯贝福公司；
42.骨髓来源巨噬细胞(bmdm：bone-marrow derived macrophage)、骨髓来源树突状细胞(bmdc：bone-marrow derived dendritic cell)由c57bl/6j小鼠股骨及胫骨提取，原代t淋巴细胞由小鼠脾脏细胞提取后使用stemcell公司原代t淋巴细胞阴性分选试剂盒分离巨噬细胞细胞系(raw264.7)，人白血病淋巴细胞细胞系(jurkat)购于中科院上海细胞库。
43.人全血单个核细胞分离液购自于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：lds1075；人外周血cd4
+
t细胞分选试剂盒购自于stemcell technologies公司，货号:17952。
44.野生型和c-rel敲除小鼠购买于上海南方模生物公司。
45.角膜移植后发生排斥患者(选择年龄大于18岁，角膜移植术后，移植排斥症状包括但不限于：突然流泪、眼红、眼内异物感、视物模糊、角膜植片水肿明显等)及正常人新鲜外周血来源于青岛眼科医院。
46.实验方法
47.小鼠角膜匀浆制备方法：
48.(1)使用颈椎脱臼法处死小鼠，用15cm弯头镊小心摘取整个眼球，注意不宜用力过大损伤眼球，将眼球置于装有pbs缓冲液的1.5ml离心管中，置于冰上待用。
49.(2)在体式显微镜下操作，利用6cm培养皿放少量pbs缓冲液使眼球漂浮于表面，使用有齿镊固定眼球，角巩膜剪沿角膜缘外1mm的巩膜剪开，用齿镊去除晶状体、虹膜和睫状体组织。
50.(3)将2.0mm ep管中放入4-5颗3mm研磨珠，加入蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液70μl及剪好的角膜组织，并用封口膜紧密封口后使用匀浆仪充分匀浆，每30s一次，后冰上静置30s，重复5次。
51.(4)取出研磨珠，上机离心，参数设为4℃，12000g，5min，吸取上清存于-80℃备用。
52.elisa检测
53.试剂包括：
54.bca蛋白浓度测定试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司)包括bca试剂a、bca试剂b、蛋白标准品(5mg/ml bsa)。
55.1.制备蛋白标准品：取完全溶解好的蛋白标准品10μl及90μl pbs混匀，所得蛋白
标准品浓度0.5mg/ml，稀释后的标准品保存于-20℃冰箱。
56.2.制备工作液：按照50体积bca试剂a与1体积试剂b工作液充分混匀。
57.3.蛋白浓度测定：
58.将0.5mg/ml的蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔平底板中，用pbs加入上述孔中，保持终体积为20μl，则蛋白标品浓度可以计为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
59.4.加入4μl样本至96孔板中，同样需要使用pbs将每孔补足至体积20μl。
60.5.每孔加入200μl bca工作液，37℃孵育20分钟
61.6.使用酶标仪于562nm读数，根据od值绘制标准曲线，并得出公式。将样本od值代入公式，得出所测浓度。
62.western-blot检测
63.1.配制10％sds-page凝胶
64.(1)使用双蒸水清洗灌胶板，直至清亮透明，无残留水渍、胶渍，使用吹风机正反吹干。
65.(2)将灌胶玻璃板对齐夹于塑胶板上，保证玻璃板与灌胶架连接完好，以防止漏液。
66.(3)配制下层胶：将3.3ml双蒸水，4.0ml 30％的丙烯酰胺溶液，2.5ml 1.5m tris(ph＝8.8)，0.1ml 10％过硫酸铵溶液及0.1ml 10％sds，0.004ml tmemd充分混合，使用1ml加样枪迅速灌入两板之间的缝隙，至玻璃板2/3高度。并加入双蒸水，使液面压平。室温静置15min，待胶层与水层之间出现明显界限，则胶凝固完好。倒置制胶架，倾倒水封。折叠滤纸，尽可能吸干多余液体。
67.(4)配制上层胶，具体成分如下：将3.4ml双蒸水，0.38ml 30％的丙烯酰胺溶液，0.63ml 1.0m tris(ph＝8.8)，0.05ml 10％过硫酸铵溶液及0.05ml 10％sds，0.005ml tmemd。
68.(5)将上述液体充分混匀，使用1ml加样枪快速加入玻璃板中，尽量避免气泡，随后缓慢、垂直地插入加样梳。
69.(6)室温静置30min后可置于4℃保存或直接上样。
70.2.加样并电泳
71.(1)将配制好的page胶转移至电泳槽中，固定牢固后加入tris甘氨酸电泳液。
72.(2)取下加样梳，每孔按照计算数值上样
73.(3)按照正负极连接好电泳槽电泳。当样本于上层胶泳道电泳时，设定电压为80v左右，直至样本电泳至上层胶与下层胶交汇处，增大电压为120v左右。
74.待到样本电泳至电泳槽底部，方可停止电泳。
75.3.半干转转膜
76.(1)提前配置半干转转膜液：将转膜液、甲醇、双蒸水按照1:1:3的比例混匀，预冷备用。
77.(2)准备好5.5cm
×
8.0cm的pvdf膜，提前浸入盛有15ml甲醇的孵育盒中充分激活。
78.(3)准备pvdf膜大小的滤纸
79.(4)电泳结束后，小心撬开胶板，取出page凝胶。
80.(5)将海绵、滤纸、pvdf膜、page凝胶、滤纸、海绵浸入转膜液，并一层一层铺放整齐于半干转槽中，放置过程中需用滚轮滚平，防止气泡产生。盖好转膜夹夹紧上述“三明治”结构，转膜时间为9min。
81.(6)转膜后，可见ladder marker转移至pvdf膜上，确定转模成功，使用镊子将其小心转移至孵育盒里，tbst洗涤2次，5min每次。
82.4.目的蛋白充分杂交
83.(1)洗涤结束后，将pvdf膜置于无蛋白快速封闭液当中，室温封闭1小时。
84.(2)一抗：使用抗体稀释液稀释目的蛋白c-rel及内参β-actin抗体(按照说明书建议稀释浓度配制)。4℃孵育过夜。
85.(3)次日，取出孵育盒，于常温复温约20min。回收一抗，保存于-20℃。
86.(4)使用tbst洗膜，3-4次，每次10min。
87.(5)加入相应二抗孵育1h，弃二抗，使用tbst漂洗3次，每次15min。
88.5.曝光：提前配置发光液，置于避光ep管中。使用加样枪均匀涂于目的蛋白分子量位置，反复涂匀。置于曝光机器内部曝光。所得条带使用image lab软件分析。
89.实施例1构建小鼠穿透性角膜移植(pkp)模型
90.以balb/c小鼠、c57bl/6j小鼠构建穿透性角膜移植模型。
91.分组：
92.异系(allo)组：以balb/c小鼠为受体，以c57bl/6j为供体；
93.同系(syn)组：以balb/c小鼠同时作为供体和受体
94.敲除组：以c-rel基因敲除小鼠(c57bl/6j)作为受体，balb/c小鼠作为供体
95.野生组：以野生小鼠(c57bl/6j)作为受体，balb/c小鼠作为供体
96.实验组：balb/c小鼠为受体，c57bl/6j小鼠作为供体，使用ptxf治疗。
97.对照组：balb/c小鼠为受体，c57bl/6j小鼠作为供体，使用ptxf治疗。
98.构建步骤：
99.(1)根据供受体小鼠体重及大小取0.25
±
0.05ml麻药，腹腔注射麻醉小鼠，同时滴加托吡卡胺滴眼液扩散瞳孔。
100.(2)小鼠麻醉后，剪去供、受体胡须及睫毛，暴露角膜，使用纱布将小鼠头部垫高，调整眼球至水平位，滴加盐酸利多卡因滴眼液表面麻醉，待瞳孔充分散大，以用0.12mm平镊轻轻扩张穹隆结膜，使麻醉充分接触整眼球。使用直径2.0mm的环钻钻切供体小鼠角膜，动作轻柔，避免伤及晶状体。使用前房穿刺刀沿环钻印记，做一侧切口，房水流出，前房内压力下降，角膜塌陷，将透明质酸钠于穿刺口处注入前房，后用维纳斯剪沿钻切痕迹剪下供体小鼠角膜，即植片，取下后浸泡于0.9％的生理盐水中防止植片干涸。
101.(3)发现受体小鼠瞳孔充分散大，以相同方式钻切剪取受体小鼠角膜。
102.(4)植片缝合：滴加一滴0.9％生理盐水滋润植床，将植片展开铺平于植床上，注意保护植片内皮及受体小鼠晶状体，用11-0尼龙线间断缝合8针，尽量做到针距均匀，线结留约0.5mm，充分对合后，使用2ml注射器连32g无菌针头注入适量无菌空气以形成前房，使用10-0尼龙线缝合眼睑中央间断缝合1针，注意防止挤塌前房，涂适量左氧氟沙星眼膏于眼表，防止感染。
103.(5)术后第3天拆除眼睑缝线，手术7天后于全麻下拆除受体角膜缝线。
104.实施例2c-rel的表达及排斥观察
105.检测异系(allo)组、同系(syn)组小鼠角膜中c-rel的表达及排斥情况。
106.在14-21天排斥高峰期，取同系组及异系组小鼠角膜匀浆提取蛋白，使用western-blot检测，异系穿透性角膜移植小鼠c-rel的表达量显著升高(p＜0.05)(图1a)。
107.对已经建立同系及异系小鼠角膜移植模型的小鼠，术后第7天起，每3天裂隙灯观察受体小鼠排斥情况并拍照记录，评分观察至术后30天。参考文献qin q,luo d,shi y,et al.cd25 sirna induces treg/th1 cytokine expression in rat corneal transplantation models.exp eye res.2016；151:134-141.doi:10.1016/j.exer.，根据角膜植片混浊水肿程度及新生血管分级评分，判定排斥情况，绘制评分曲线，异系移植小鼠排斥率显著高于同系小鼠(p＜0.001)(图1b)；同时作角膜植片生存曲线，异系小鼠植片生存率显著低于同系小鼠(p＜0.001)(图1c)。
108.实施例3受c-rel调控的炎症因子
109.在14-21天排斥高峰，取同系组及异系组小鼠角膜匀浆(参见实施例2)，通过elisa检测c-rel靶点的炎症因子分泌情况，结果见图2，角膜移植后发生异系小鼠角膜组织中tnf-α、il-1β、il-17a、ifn-γ表达量明显高于同系移植小鼠(p＜0.05)。
110.实施例4c-rel敲除实验
111.对野生组(wt)和敲除组(c-rel ko)小鼠，在术后3天起，根据角膜植片水肿、透明度、新生血管生长情况进行评分(参见实施例3)，计算总排斥指数(ri)。当ri≥5分计为该植片发生排斥，绘制角膜植片生存曲线。结果如图3所示，c-rel基因敲除小鼠角膜植片排斥率更低，排斥发生更晚，存活时间更长(p＜0.05)。
112.实施例5人血液细胞检测
113.收集角膜移植后发生排斥患者及正常人新鲜外周血，利用人全血单个核细胞分离液，密度梯度离心法分离单个核细胞(pbmc)，具体步骤：取一支15ml离心管，加入3ml分离液，用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，22℃，500g，刹车升1降0，离心30min，离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层，用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一15ml离心管中，向所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。250g，离心10min，弃上清，用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞，250g，离心10min。利用trizol(invitrogen:15596018)直接裂解pbmc细胞提取总rna，并反转成cdna(takara：rr047a)，然后通过rt-pcr在mrna水平以及利用ripa裂解pbmc，抽提细胞总蛋白，并用western blot在蛋白水平分别检测。结果如图4、图5所示，角膜移植排斥患者(reject)血浆pbmc中c-rel的表达在mrna水平及蛋白水平较正常人(normal)均有升高；角膜移植排斥组患者pbmc中c-rel所调控下游靶点炎症因子的表达高于正常对照组，提示c-rel在角膜移植排斥中可能起重要作用。
114.实施例6动物实验
115.使用20mg/ml的c-rel小分子抑制剂ptxf滴眼治疗已经建立异系角膜移植排斥模型小鼠。
116.ptxf溶液的配制：称取0.12g ptxf粉末(购于东京化成工业株式会社)，溶于6ml pbs液体中，充分混匀，制成20mg/ml的溶液。在体内实验中，分别自角膜移植手术后每天对
实验组和对照组小鼠使用ptxf和pbs缓冲液滴眼，实验组20mg/ml的ptxf每天点眼一次，10ul每眼；对照组pbs每天点眼一次，10ul每眼。如图6、7所示在ptxf治疗后，实验组小鼠排斥率明显降低，植片发生排斥更晚。
117.剪取术后14-21天排斥高峰期小鼠角膜进行匀浆，通过elisa检测实验组及对照组小鼠角膜组织中炎症因子分泌情况，如图8所示，ptxf治疗组小鼠炎症因子分泌显著降低。另外，通过western-blot检测(图8)，ptxf治疗后小鼠c-rel表达在蛋白水平出现下调。
118.实施例7
119.使用ptxf处理多种免疫细胞，包括骨髓来源巨噬细胞(bmdm：bone-marrow derived macrophage)、巨噬细胞细胞系(raw264.7)，骨髓来源树突状细胞(bmdc：bone-marrow derived dendritic cell)、人白血病淋巴细胞细胞系(jurkat)、原代t淋巴细胞。并且，我们通过检测发现ptxf处理过的上述各种免疫细胞在蛋白水平降低c-rel的表达，以及在这些免疫细胞中，受c-rel调控的炎症因子表达。
120.蛋白水平的检测(ptxf处理免疫细胞后，各细胞分泌c-rel靶点炎症因子的情况)：将骨髓来源巨噬细胞(bmdm：bone-marrow derived macrophage)、巨噬细胞细胞系(raw264.7)，骨髓来源树突状细胞(bmdc：bone-marrow derived dendritic cell)、原代t淋巴细胞分别种于96孔板：将细胞密度调整为0.4m/ml种板，实验孔及对照孔细胞量保持一致，使用无菌pbs将ptxf溶解为500μg/ml的溶液加入实验组孔，将等体积pbs加入对照组孔，预处理30分钟，两组同时使用400ng/ml脂多糖lps刺激(jurkat:pma(pkc激活剂)-ionomycin(离子霉素)浓度分别为50ng/ml及1μm刺激)，于36-48h后收取细胞上清，冻存于-80℃。去上清，使用70μl加入蛋白酶抑制剂的ripa裂解细胞，放置于冰上充分裂解，待30min以后，收取蛋白，观察蛋白状态，确定是否需要超声，4℃，12000g，5min离心，取上清。冻于-80℃备用。提取蛋白后进行蛋白印迹实验western blot。
121.mrna水平的检测：将骨髓来源巨噬细胞(bmdm：bone-marrow derived macrophage)、巨噬细胞细胞系(raw264.7)，骨髓来源树突状细胞(bmdc：bone-marrow derived dendritic cell)、原代t淋巴细胞分别种板96孔板：将细胞密度调整为0.4m/ml种板，实验孔及对照孔细胞数目保持一致，3-6h后至细胞完全贴壁,使用无菌pbs将ptxf溶解为500μg/ml的溶液加入实验组孔，将等体积pbs加入对照组孔，预处理30分钟，然后加入脂多糖lps刺激36-48h后收取细胞上清，冻于-80℃备用。jurkat：将细胞密度调整为0.4m/ml种板，实验孔及对照孔细胞量保持一致，使用无菌pbs将ptxf溶解为500μg/ml的溶液加入实验组孔，将等体积pbs加入对照组孔，预处理30分钟，然后加入pma(pkc激活剂)-ionomycin(离子霉素)浓度分别为50ng/ml及1μm刺激24-36h后收取细胞上清，冻于-80℃备用。提取各细胞mrna后备用进行实时荧光定量实验rt-pcr。
122.ptxf相关细胞实验的结果如图9、图10所示，ptxf可以降低上述细胞中c-rel及c-rel靶点炎症因子的表达。
123.实施例8有效性实验
124.分离正常人的新鲜外周血pbmc后，利用stemcell公司人外周血cd4
+
t细胞分选试剂盒(stemcell:17952)，评估ptxf的有效性。具体步骤如下：
125.(1)分离外周血pbmc；
126.(2)用分选细胞缓冲液(pbs+2％ fbs+1mm edta)将细胞重悬成5
×
107细胞/ml，以
每毫升细胞中加入50μl的比例，加入相应体积的大鼠血清，轻弹管壁混匀。
127.(3)将细胞悬液移入5ml聚苯乙烯圆底管中，以每毫升细胞中加入50μl的比例，加入相应体积的isolation cocktail，轻弹管壁混匀，室温孵育5min。
128.(4)取streptavidin rapidspherestm充分涡旋30s，以每毫升细胞中加入50μl的比例加入试管中，室温孵育2.5min。
129.(5)加分选缓冲液至2.5ml，用1000μl移液枪轻柔吹吸2-3次混匀细胞，将试管移至磁力架上，室温孵育5min。
130.(6)用3ml巴氏管小心地将细胞悬液吸出，移入新的圆底管中。
131.(7)离心，室温，200
×
g，10min，弃上清，轻柔刮弹离心管使细胞沉淀分散。
132.(8)用500μl分选缓冲液重悬细胞。弃去上清，重复步骤2遍。用完全培养基重悬细胞至实验需要的浓度。培养于rpim164+10％胎牛血清+1％双抗+50ul/ml il-2中，首先我们先将ptxf溶于无菌pbs，制成浓度为500μg/ml的溶液加入实验组，对照组加入等体积的无菌pbs，预处理30min，然后按照iba life science公司(货号：6-8900-050)步骤加anti-cd3/anti-cd28混合物刺激pbmc 48h，蛋白裂解液充分裂解后使用western-blot测定蛋白，细胞上清收取后用于elisa测定c-rel下游靶点炎症因子的表达；24h后使用trizol(invitrogen:15596018)直接裂解cd4+t细胞提取总rna。
133.如图9、10、11所示，ptxf对cd4+t细胞具有调控作用，可以降低c-rel的表达。
134.实施例9毒副作用
135.我们使用20mg/ml的ptxf滴眼处理正常balb/c小鼠，第1、2、3、7和14天对三组小鼠眼睛进行眼常规检查，主要检测三组小鼠泪液分泌，角膜敏感度情况，如图12所示，发现差异不具有统计学意义(p＞0.05)；同时使用arpe-19、a549、jurkat、b16、mda-mb-231、el4细胞株(均购买于上海细胞库)检测细胞增殖情况，如图13所示，发现三组处理间细胞凋亡差异无统计学意义(p＞0.05)。
136.实施例10联合使用
137.将包装有c-rel特异性核糖核酸的腺相关病毒aav6-shrel与ptxf协同应用。
138.对应鼠c-rel(ncbi，nm-009044)的特异性核糖核酸(c-rel-specific shrna)，其序列为：
139.正义链5’caaccggacatacccgtct 3’140.反义链5’agacgggtatgtccggttg 3’141.将上述特异性核糖核酸序列连接于酶切位点bamhi和hindiii中间，构建重组质粒，连接产物转化为大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选测序后的重组质粒作为骨架载体与辅助质粒ad helper vector和aav-rep/cap vector共转染包装细胞hek293t，以常规方法转染收毒。最终包装的腺相关病毒aav6-shrel购自山东维真生物科技有限公司，aav6-shrel病毒滴度为6.15
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10e
12
vg/ml。
142.将完成异系角膜移植的小鼠分别分为若干组，a组仅用ptxf(20mg/ml)10ul每眼，每日1次，自手术完成之日起点眼治疗；b组用ptxf(20mg/ml)5ul每眼，每日1次，滴眼治疗，同时结膜下注射aav6-shrel 2ul每眼结膜下注射，每3天注射一次；c组用ptxf(20mg/ml)5ul每眼，每日1次，滴眼治疗，同时结膜下注射aav6-shrel 6ul每眼结膜下注射，每3天注射一次；d组用ptxf(20mg/ml)5ul每眼，每日1次，滴眼治疗，同时结膜下注射aav6-shrel 10ul
每眼结膜下注射，每3天注射一次；发现b、c、d组排斥率均未低于a组。
143.以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。