产酸克雷伯氏菌的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及产酸克雷伯氏菌的应用。


背景技术：

[0002][0003]
目前针对物质成瘾的治疗大多以心理干预和康复治疗为主，药物治疗为辅助，但是个体差异相差较大，总体效果不尽人意。同时药物治疗大多是神经递质的拮抗剂或者激动剂，所产生的副作用较大。因此，研究一种有效的治疗细菌并通过肠道定植，发挥其有效的治疗作用，对药物成瘾的治疗具有深远的意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供产酸克雷伯氏菌的应用。本发明产酸克雷伯氏菌能用于降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求，并能治疗甲基苯丙胺成瘾，有效提高毒品戒断率。
[0005]
本发明提供了产酸克雷伯氏菌应用于制备用于降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求药物中。
[0006]
本发明还提供了产酸克雷伯氏菌应用于制备治疗甲基苯丙胺成瘾的药物中。
[0007]
本发明中，所述产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)，菌种编号为(中国工业菌种保藏中心cicc21518)。
[0008]
本发明还提供了产酸克雷伯氏菌在降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求和/或治疗甲基苯丙胺成瘾中的应用。
[0009]
本发明进一步提供了一种用于降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求和/或治疗甲基苯丙胺成瘾的药物，包括活性成分为产酸克雷伯氏菌和助剂组成。
[0010]
上述的药物中，所述助剂为生理盐水和/或药学可接受的辅料，具体可为生理盐水。
[0011]
上述的药物中，所述药物的剂型为经胃肠道给药的剂型。
[0012]
本发明采用所述用于降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求和/或治疗甲基苯丙胺成瘾的药物或所述产酸克雷伯氏菌的生理盐水溶液进行治疗甲基苯丙胺成瘾的方法，包括如下步骤：
[0013]
将所述用于降低甲基苯丙胺成瘾后潜伏心理渴求和/或治疗甲基苯丙胺成瘾的药物或所述产酸克雷伯氏菌的生理盐水溶液通过口服给药，用于对于戒断甲基苯丙胺的个体，以降低所述个体戒断甲基苯丙胺后的渴求和治疗甲基苯丙胺成瘾。
[0014]
本发明具有以下有益效果：
[0015]
本发明产酸克雷伯氏菌能降低甲基苯丙胺渴求，并能治疗甲基苯丙胺成瘾，通过实验可知，其能够显著抑制大鼠经过甲基苯丙胺自身给药训练成瘾后，戒断30天潜伏心理渴求。本发明通过灌胃的方式，逐渐降低成瘾者对毒品的渴求，以治疗甲基苯丙胺成瘾，有效提高毒品戒断率。
附图说明
[0016]
图1为本发明实验流程。
[0017]
图2为大鼠甲基苯丙胺自身给药训练的结果。
[0018]
图3为大鼠戒断30天消退测试(有效鼻触次数)。
[0019]
图4为大鼠戒断30天消退测试(无效鼻触次数)。
[0020]
图5为大鼠旷场测试。
具体实施方式
[0021]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]
下述实施例中，如果没有明确说明，各实验的结果均为进行三次平行实验后的结果。
[0024]
本发明下述实施例产酸克雷伯氏菌能降低甲基苯丙胺渴求或治疗甲基苯丙胺成瘾的实验，按照如图1所示的实验流程进行：
[0025]
1)大鼠自身给药(甲基苯丙胺给药)训练；
[0026]
2)产酸克雷伯氏菌干预并进行测试。
[0027]
实施例1
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大鼠自身给药训练
[0029]
(1)雄性sprague-dawley(sd)大鼠(spf级)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物按每笼5只群养，适应性饲养7天，大鼠饲养于标准化无特定病原体动物实验室(spf)，温度(22
±
2℃)、湿度(50
±
10％)和照明时间(12小时光照/黑暗交替，8:00-20:00)。大鼠在整个实验过程中自由进食饮水。大鼠体重约320克左右进行实验。
[0030]
甲基苯丙胺盐酸盐，购自公安部禁毒情报技术中心，溶于0.9％生理盐水，配成浓度为0.75mg/ml的甲基苯丙胺盐酸盐溶液。
[0031]
(2)大鼠自身给药箱及软件，购自宁波安来软件科技有限公司。大鼠自身给药训练箱为板状箱底，箱体前后壁和顶壁为透明有机玻璃，两侧为灰色铝质材料。箱底面上方9厘米有两个鼻触装置(nose-poke)。
[0032]
提前给大鼠进行插管手术，在颅骨上固定的自我给药套管，通过橡胶管与给药泵相连，软管外有金属弹簧保护，顶端与旋转轴承相连，以确保动物在自我给药训练箱中可以自由活动。
[0033]
实验过程中，动物触碰有效鼻触(active nose-poke)装置会引发静脉给药，同时伴随灯光-声音条件线索，持续时间为5秒。电脑同步记录动物触碰有效鼻触及触碰无效鼻触(inactive nose-poke)的次数。
[0034]
(3)大鼠自身给药手术：异氟烷将大鼠麻醉后，右侧颈部开口顿性分离出颈静脉约1厘米，将提前预备好的尖端静脉插管埋置于右侧颈静脉处，插管尖端位于右心房开口。静脉插管固定后经皮下穿过耳后置于颅骨上方(提前将头皮用酒精、碘伏消毒)，与静脉自我给药套管相连。静脉插管完成后将大鼠置于脑立体定位仪上(俯卧位)，用耳棒在水平方向固定好大鼠，动脉夹暴露颅骨，调整颅骨位置，使前囟与后囟在同一水平(高度相差小于0.1mm)，用棉签去除颅骨结缔组织，用螺丝钉和混匀的牙科水泥将套管固定在颅骨上，将不
锈钢内芯插入套管，使之保持通畅，并预防感染。水泥凝固后，将大鼠从定位仪上取下，单笼饲养，给予5-7天的恢复时间，术后待大鼠体重恢复至手术前即可进行甲基苯丙胺自身给药训练实验，每日注射青霉素和肝素钠以防止静脉给药套管堵塞或发生感染。待大鼠开始自身给药训练后，停止青霉素给药。
[0035]
(4)大鼠甲基苯丙胺自身给药训练：大鼠进行为期10天的甲基苯丙胺自身给药训练(每次有效鼻触后给药量为0.1mg/kg/infusion)，每天训练6小时，每小时之间休息5分钟。自身给药训练在大鼠的夜间周期进行。训练采用固定比率1(fixed ratio1)强化程序，每次给药之间有20秒的不应期。每个训练期以笼灯开启为信号，动物触碰有效鼻触后笼灯关闭，并引发甲基苯丙胺自动给药，同时伴有持续时间为5秒的声音和灯光线索，20秒不应期结束后笼灯将再次开启。为防止动物给药过量发生死亡，每小时甲基苯丙胺给药次数被限制在15次。在训练结束后，根据训练期间的给药次数对动物进行分组，每组动物给药次数均值无统计学差异。
[0036]
(5)自然戒断：在自然戒断过程中，动物正常饲养在饲养笼中，不进行甲基苯丙胺暴露和用药相关线索暴露。饲养在温度(22
±
2℃)、湿度(50
±
10％)和照明时间(12小时光照/黑暗交替，上午8点关灯，晚上8点开灯)固定的动物房中，自由进食饮水，戒断期间对大鼠隔2-3天进行抚摸一次。得到完成自身给药训练的大鼠。
[0037]
实施例2
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大鼠自身给药训练后进行细菌干预
[0039]
(1)细菌灌胃：产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)购自中国工业微生物菌种保藏中心(编号：cicc21518)，使用营养肉汤培养基进行扩大培养，经过高速离心(5000
×
g，20分钟)富集后，使用生理盐水洗涤两次，收集细菌(2
×
108cfu/次)，在戒断第2天后开始进行细菌灌胃为期28天，每天两次(早晚各一次)，于戒断30天进行消退测试。
[0040]
产酸克雷伯氏菌灌胃干预大鼠为细菌干预组，细菌干预组的大鼠为本发明实施例1中完成自身给药训练的大鼠；
[0041]
生理盐水灌胃大鼠作为对照，记为生理盐水干预组，生理盐水干预组的大鼠为本发明实施例1中完成自身给药训练的大鼠。
[0042]
(2)消退测试：在本发明实施例1中甲基苯丙胺自身给药训练结束后的第二天(即戒断第1天)和戒断第30天，将大鼠再次放入自身给药训练箱中进行消退测试。在消退测试过程中，测试期以笼灯开启为信号，动物触碰有效鼻触后笼灯关闭，同时伴有持续时间为5秒的声音和灯光线索，但每次碰触有效鼻触后不再伴有甲基苯丙胺，每次测试时间为30分钟。电脑同步记录测试期间细菌干预组和生理盐水干预组动物触碰有效或无效鼻触的次数。
[0043]
(3)旷场测试：自发活动箱为黑色自制的有机玻璃，正上方1米处有数码摄像头，实验在安静的环境下进行。将大鼠放入角落，同时采集录像并计时，观察5分钟后，更换下一只大鼠进行测试。中间需要清洗箱体，以免大鼠粪便、气味影响下次行为测试。行为数据分析用动物运动轨迹跟踪系统(ethovision xt 10)，统计大鼠在旷场中的运动距离。
[0044]
结果：
[0045]
1、经过10天甲基苯丙胺自身给药训练，结果如图2所示，由图2中可知，两条曲线均上升，证明大鼠习得显著的自身给药，说明两组大鼠均造模成功，能用于进行后期药物干
预。
[0046]
2、经过28天的产酸克雷伯氏菌细菌灌胃干预，在戒断第30天进行消退测试，如图3中结果可见，与生理盐水干预组相比，产酸克雷伯氏菌干预组大鼠表现出渴求降低。
[0047]
3、如图4所示，在戒断第30天，产酸克雷伯氏菌干预组与生理盐水干预组的无效鼻触次数无显著差异，说明本发明产酸克雷伯氏菌干预能使大鼠戒断30天后对甲基苯丙胺渴求消退。
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4、同时分析了大鼠自发活动(测试时间5分钟)，产酸克雷伯氏菌干预组的总运动距离1353厘米，而生理盐水干预组的总运动距离1438厘米，如图5所示，结果显示产酸克雷伯氏菌干预组与生理盐水干预组(对照)之间无显著差异，进一步说明本发明产酸克雷伯氏菌干预能使大鼠戒断30天后对甲基苯丙胺渴求降低。
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因此，通过本发明上述实施例结果表明，大鼠经过产酸克雷伯氏菌干预后，可显著降低大鼠对甲基苯丙胺的渴求，并治疗了大鼠对甲基苯丙胺的成瘾，为甲基苯丙胺成瘾治疗提供新的方法和思路。