聚乙二醇生物粘合剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及医用新材料技术领，具体涉及一种聚乙二醇生物粘合剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.半月板损伤是生活中最常见的膝关节运动创伤，已经越来越受到人们的关注。传统的治疗方法一般是采用关节镜下半月板缝合/切除术，将损坏的半月板尽量予以缝合，缝合极度困难的予以修整切除。临床切除/缝合半月板损伤手术术后患者可能出现的并发症包括关节积液/积血，组织间隙水肿，软骨损伤，膝关节僵硬，深静脉血栓，腓总神经损伤，滑膜疝。通常临床切除/修整半月板手术需要手术时间需要半小时左右，缝合半月板损伤处则需要一小时，这对病人来说是比较长的操作时间。而且手术切除后的软骨保护作用消失，患者在终末期发展成为膝骨性关节炎。
3.目前人们开发了生物粘合剂来代替手术中的缝合线，以期望解决复杂类型的半月板损伤。生物粘合剂一般分为天然类和合成类生物粘合剂。天然类生物粘合剂以纤维蛋白胶为代表，由于粘合强度弱而且血液制品交叉感染的问题，极大的限制了其用途。合成类生物粘合剂以氰基丙烯酸盐的衍生物为代表，强度较高，但由于生物相容性差，降解产物有毒，也极大的限制了其临床应用，且这些生物粘合剂都不具有促半月板修复的生物功能。目前研究者在开发一些新型的生物粘合剂，虽然拥有一定强度和较好的生物相容性，但是这些生物粘合剂通常为多组分，应用合成的时候需要高强度的紫外光照射或者高温促凝，操作复杂，需要时间长，破坏正常细胞活性等缺点，极大的提升了操作时间、成本和困难。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种聚乙二醇生物粘合剂及其制备方法和应用。
5.本发明的第一个目的为提供了一种聚乙二醇生物粘合剂的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：（1）将tetra-peg-nh2溶于超纯水中，配制成浓度为5-25重量%的第一溶液置于冰上；（2）将tetra-peg-sc溶于超纯水中，配制成浓度为5-25重量%的第二溶液置于冰上；（3）将氧化淀粉溶于超纯水中，配制成浓度为0.01-0.2重量%的第三溶液置于冰上；（4）将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液混合，得到生物粘合剂；其中所述第一溶液：第二溶液：第三溶液的体积比为5-20：5-20：1。
6.本发明的第二目的为提供上述制备方法制备的聚乙二醇生物粘合剂。
7.本发明的第三目的为提供上述制备方法制备的聚乙二醇生物粘合剂在制备治疗半月板损伤产品中的应用。
8.本发明制备的生物粘合剂有以下多种优点：1、成胶迅速，成胶时间仅为1s-5min，且时间可调控；2、水无毒性；3、粘合性强，韧性强，抗拉升，半月板横断后使用本生物粘合剂粘粘后，利用自制的拉伸器械夹持住半月板的后角，使用200g的砝码夹住半月板的前角，悬
挂起来超过1小时，半月板横断处黏合紧密；4、直接成胶，无需蓝光/紫外光等步骤，对细胞/细胞因子等无损伤，可以作为载体，包装多种成分，应用范围极广；5、代谢，降解时间可控；6、促进半月板修复。
附图说明
9.图1为制备本发明的聚乙二醇生物粘合剂的反应过程式。
10.图2为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂的交联过程。
11.图3为本发明实施例1-4制备的聚乙二醇生物粘合剂成胶后最终产物的固含量电镜观察图。
12.图4为本发明实施例1-4制备的聚乙二醇生物粘合剂成胶后最终产物的恒温恒湿条件下慢性脱水观察图。
13.图5为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂的弹性压力观察图。
14.图6为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂的对比不同胶水体外粘接半月板拉力强度图。
15.图7为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂对比不同胶水的抗关节镜水压图。
16.图8为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂中培养软骨细胞的死活染色的活细胞图。
17.图9为本发明实施例1制备的聚乙二醇生物粘合剂中培养软骨细胞的死活染色的死细胞图。
具体实施方式
18.本发明提供了一种聚乙二醇生物粘合剂的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：（1）将tetra-peg-nh2溶于超纯水中，配制成浓度为5-25重量%的第一溶液置于冰上；（2）将tetra-peg-sc溶于超纯水中，配制成浓度为5-25重量%的第二溶液置于冰上；（3）将氧化淀粉溶于超纯水中，配制成浓度为0.01-0.2重量%的第三溶液置于冰上；（4）将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液混合，得到生物粘合剂；其中所述第一溶液：第二溶液：第三溶液的体积比为5-20：5-20：1。
19.在本发明中，tetra-peg-nh2为带有-nh2修饰基团的四臂peg（polyethylene glycol，聚乙二醇），优选tetra-peg-nh2的分子量为15000-25000，这种四臂peg为市面上可以直接购买的产品。
20.tetra-peg-sc为带有-sc修饰基团的四臂peg，优选tetra-peg-sc的分子量为15000-25000，这种四臂peg为市面上可以直接购买的产品。
21.本发明对氧化淀粉等的来源没有特别的限制，为市面上可以直接购买的产品，优选氧化淀粉的分子量为650-750。
22.根据一些优选的实施方式，步骤(4)中，所述第一溶液：第二溶液：第三溶液的体积比可以为5-15：5-15：1。
23.根据一些优选的实施方式。所述第一溶液的浓度为5-20重量%，进一步优选为8-12重量%。
24.根据一些优选的实施方式，所述第二溶液的浓度为5-20重量%，进一步优选为8-12重量%。
25.根据一些优选的实施方式，所述第三溶液的浓度为0.05-0.15重量%。
26.根据一些优选的实施方式，所述生物粘合剂的孔隙度为6-16μm；压缩回弹性在25-85
°
c的变化≤1%。
27.本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇生物粘合剂。
28.本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇生物粘合剂在制备治疗半月板损伤产品中的应用。
29.在本发明的一些优选的实施方式中，所述应用包括如下步骤：s1、将生物粘合剂加入损伤的半月板；s2、将所述生物粘合剂固化。优选地，所述固化的温度为10-25
°
c，固化的时间为1s-5min。
30.本发明通过提前将该生物粘合剂成分配制溶液一、溶液二和溶液三，储存在设计完备的三腔注射器中4℃密闭保存，将半月板损伤的患者麻醉消毒准备完备，使用膝关节镜手术清理半月板撕裂边缘不规则毛刺部分，半月板撕裂处相对光滑，对位正确，将该生物粘合剂通过特制的三腔注射器注射至半月板撕裂处，稍将撕裂处对齐，待1s-5min，固化完全即可。
31.下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
32.以下实施例和对比例中涉及的测试方法如下：1.扫描电子显微镜（sem）采用德国zeiss公司生产的sigma 300型场发射扫描电子显微镜，其中孔隙度的测试通过sem进行。
33.2.压缩拉伸仪采用美国instron公司生产的instron 3365型力学测试仪器。
34.3.活死细胞分析采用中国凯基生物公司生产的死活染色检测试剂盒(kgaf001)。
35.荧光显微镜操作、荧光显微镜操作1.1取出钙黄素（calcein am）和碘化丙啶(pi）试剂原液，室温平衡30分钟。
36.1.2加入5μl、16mm的pi储液至10ml的中文（pbs）中，涡旋震荡混匀，得到8μm的pi溶液。
37.1.3将5μl、4mm的钙黄素am储液加入到10ml的pi溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀。
38.1.4所得到的工作液（2μm钙黄素am和8μm的pi）直接用于染色细胞。注意：钙黄素am的水溶液容易发生水解，应当当天用完。
39.准备细胞并开展实验1.5贴壁细胞和非贴壁细胞采用培养瓶或者小室爬片。
40.1.6正式开始实验前，洗涤细胞，确保除去培养基中含有的活性酯酶。用pbs温和洗涤贴壁细胞，去除上清。非贴壁细胞用离心管收集离心，pbs洗涤去除上清。
41.1.7加入足量的上述工作液，保证没过单层细胞。
42.1.8室温孵育30~45分钟。
43.1.9对于贴壁细胞，吸出染色工作液终止孵育。加入10μl的pbs至干净的载玻片，覆以盖玻片，以指甲油密封，防止水分蒸发。
44.2.0荧光显微镜下观察标记细胞。
45.2、荧光微孔板操作制备工作液(2μm的calcein am，8μm的pi)2.1取出钙黄素am和pi试剂原液，室温平衡30分钟。
46.2.2加入5μl、16mm的pi储液至10ml的pbs中，涡旋震荡混匀，得到8μm的pi溶液。
47.2.3将5μl、4mm的钙黄素am储液加入到10ml的pi溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀。
48.2.4所得到的工作液（2μm钙黄素am和8μm的pi）。
49.2.5如需单独计算活、死细胞比例请单独配制1ml、2μm的钙黄素am溶液和1ml、8μm的pi溶液。
50.准备细胞并开展实验每孔细胞的最低监测值大约为200~500个，每孔最大常用细胞检测值约为106。
51.2.6培养贴壁或者悬浮细胞。准备活细胞与死细胞的对照样品。死细胞用0.1%皂角苷或者0.1~0.5%的毛地黄皂苷处理10分钟得到。
52.2.7pbs洗涤细胞。对于贴壁细胞，加入100μl的pbs覆盖孔底，对于悬浮细胞，直接在离心管中操作，再以pbs重悬。将含有细胞的缓冲液，每孔100μl加入至微孔板各孔。细胞样品的洗涤注意要确保除去培养基中的活性酯酶，否则会引起背景。
53.使用荧光酶标仪测量荧光为了获得最佳的灵敏度，所使用的酶标仪，采用带光学过滤器的信号激发器，保证不互相干扰。钙黄素可以用（485
±
10nm）的荧光光学滤光器激发，而pi可以用（530
±
12.5nm）的典型罗丹明光学滤光器来兼容。而发射光信号可以通过滤光器得到很好的分开采集，钙黄素530
±
12.5nm，pi是645
±
20nm。
54.2.8如有需要，准备对照实验样本的死活细胞百分比。如是测量死活细胞的相对增量，那么对照可以不用设置。对照样品可以有：无细胞对照（g、h），活细胞对照（e、f）和死细胞对照（c、d）。
55.2.9每孔加入100μl的钙黄素am和pi工作液，终体积为200μl，每孔含1μm钙黄素和4μm的pi的终浓度。室温孵育30~45分钟。
56.2.10用合适的激发和发射滤光片收集样本数据。
57.下面通过具体实施例描述本发明。
58.实施例1（1）称取tetra-peg-nh2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700212，分子量2w）0.05mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
59.（2）称取tetra-peg-sc（购自河北利华生物，产品编号65996-62-5，分子量2w）0.05mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第二溶液。
60.（3）称取氧化淀粉（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702012，分子量690.6）0.001mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第三溶液。
61.（4）量取第一/二/三溶液按照10：10：1的体积比在室温下混合1s，得到聚乙二醇生物粘结剂。胶连的过程如图2所示。胶连后的微观结构如图3所示。本发明实施例的制备聚乙
二醇生物粘结剂的交联过程是极为迅速的，在常温下1s即可胶连完成，该聚乙二醇生物粘结剂的胶连过程安全简单，无需要其他高温紫外等条件，为该聚乙二醇生物粘结剂进一步生物应用奠定了良好的生物安全反应基础。
62.实施例2（1）称取tetra-peg-nh2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700212，分子量2w）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
63.（2）称取tetra-peg-sc（购自河北利华生物，产品编号65996-62-5，分子量2w）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第二溶液。
64.（3）称取氧化淀粉（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702012，分子量690.6）0.001mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第三溶液。
65.（4）量取第一/二/三溶液按照10：10：1的体积比在室温下混合1s，得到聚乙二醇生物粘结剂。交联后的微观结构如图3所示。
66.实施例3（1）称取tetra-peg-nh2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700212，分子量2w）0.15mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
67.（2）称取tetra-peg-sc（购自河北利华生物，产品编号65996-62-5，分子量2w）0.15mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第二溶液。
68.（3）称取氧化淀粉（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702012，分子量690.6）0.001mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第三溶液。
69.（4）量取第一/二/三溶液按照10：10：1的体积比在室温下混合1s，得到聚乙二醇生物粘结剂。交联后的微观结构如图3所示。
70.实施例4（1）称取tetra-peg-nh2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700212，分子量2w）0.2mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
71.（2）称取tetra-peg-sc（购自河北利华生物，产品编号65996-62-5，分子量2w）0.2mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第二溶液。
72.（3）称取氧化淀粉（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702012，分子量690.6）0.001mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第三溶液。
73.（4）量取第一/二/三溶液按照10：10：1的体积比在室温下混合1s，得到聚乙二醇生物粘结剂。交联后的微观结构如图3所示。
74.如图3所示，本发明实施例的制备聚乙二醇改性化合物生物粘合剂成胶后的微观结构充满了空腔结构，随着不同的固含量空腔结构的孔隙直径有所变化，用扫描电镜可以清晰的观察到实施例1-4显微视野下生物粘合剂的大量孔隙结构存在，因此，生物应用时，细胞可以自由穿梭于该生物粘合剂，依附于该生物粘合剂爬行生长。
75.如图4所示，本发明实施例的制备聚乙二醇改性化合物生物粘合剂的微观结构充满了空腔结构和含有大量水分，随着时间的延长，该生物粘合剂在恒温恒湿的环境中逐渐脱水直至稳定，观察到实施例1-4固含量的生物粘合剂的脱水效率是不同的。
76.如图5所示，本发明实施例的制备聚乙二醇改性化合物生物粘合剂的压缩回弹性能极佳，在使用压缩拉伸仪反复压缩观察到实施例1-4多个循环后，无明显形变产生，仍能
够完全回弹，在生物应用时可以有效对抗压力的环境。
77.本发明实施例的制备聚乙二醇改性化合物生物粘合剂生物安全性高，将软骨细胞培养在生物粘合剂实施例1中，2周后观察，使用死活染色结果显示，图8中活细胞比例超过99%，图9中死细胞比例低于1%，说明该生物粘合剂生物安全性高，临床应用潜力较大。
78.应用实施例1（1）称取tetra-peg-nh2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700212，分子量2w）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
79.（2）称取tetra-peg-sc（购自河北利华生物，产品编号65996-62-5，分子量2w）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第二溶液。
80.（3）称取氧化淀粉（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702012，分子量690.6）0.001mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第三溶液。
81.（4）量取第一/二/三溶液按照10：10：1的体积比在室温下混合1s，得到聚乙二醇生物粘结剂。
82.（5）取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用第四步得到的聚乙二醇生物粘结剂加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，室温下稍加固定5秒生物胶水胶连完成。
83.应用对比例1取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用手术缝合线的两个“8字”缝合半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，备用。
84.应用对比例2取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用商业化504胶水加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，室温下稍加固定5秒待生物胶水胶连完成，备用。
85.应用对比例3（1）称取cellulose（购自上海源叶，产品编号9004-32-4，分子量263.1976）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
86.（2）取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用第一溶液加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，室温下稍加固定5秒待生物胶水胶连完成，备用。
87.应用对比例4（1）称取frbrin glue（购自中国华兰生物，产品编号s20020085）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
88.（2）取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用第一溶液加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，室温下稍加固定5秒待生物胶水胶连完成，备用。
89.应用对比例5（1）称取gelatin（购自美国sigma公司，产品编号9000-70-8）0.1mg加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
90.（2）取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用第一溶液加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，室温下稍加固定5秒待生物胶水胶连完成，备用。
91.应用对比例6
（1）称取0.1mg的gel-ma（购自苏州永沁泉智能，产品编号efl-gm-90，分子量2w），和0.001mg的lap，加入至1ml超纯水中，4℃条件下搅拌反应5min，得到第一溶液。
92.（2）取狗膝关节内侧半月板，横断后作为半月板损伤模型，使用第一溶液加入到半月板损伤模型的裂隙处，将裂隙两端对齐，蓝光照射5s，室温下稍加固定5秒待生物胶水胶连完成，备用。
93.本发明图6和图7中，横坐标中的英文与应用实施例和对比例的对应关系如下：tetra-peg：代表应用实施例1；suture：代表应用对比例1组；504：代表应用对比例2组；cellulose：代表应用对比例3组；fibrin glue：代表应用对比例4组；gelatin：代表应用对比例5组；gel-ma：代表应用对比例6组。
94.如图6所示，本发明实施例1的制备聚乙二醇改性化合物生物胶水的半月板粘接性能极佳，在体外粘接半月板后，放在密闭潮湿培养皿中，模拟膝关节湿润的环境，后垂直持续性拉伸至横断，应用实施例1拉伸强度可以达到600kpa，对比应用对比例1-6组具有较大粘接强度优势，如图7所示，本发明实施例的制备聚乙二醇改性化合物生物胶水的半月板粘接后抗关节镜冲洗能力极佳，在体外粘接半月板后，使用关节镜持续性冲洗粘接后的半月板，实施例1抗冲洗强度可以达到30kpa，远超临床关节镜冲洗所需要的10kpa的水压强度，对比应用对比例1-6组具有较大抗关节镜下水压冲洗优势，临床应用潜力较大。