一种三叉苦提取物在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种治疗脓毒症致脑损伤药物，特别是三叉苦总黄酮(melicopepteleifolia totalflavone，mptf)在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用。

背景技术：

1、脓毒症相关性脑病是由脓毒症所引起的中枢神经系统功能障碍，是icu病房中常见脑病之一。脓毒症相关性脑病可发生在脓毒症病程的任何时期，临床上表现为从谵妄到深度昏迷的脑功能紊乱。脓毒症相关性脑病以行为、认知、觉醒和意识改变为特征，且在相当部分患者中存在长期认知功能障。在icu病房中，其发病率为9％～71％，目前尚无有效的治疗手段，临床上主要是针对基础疾病脓毒症进行整体治疗、对症治疗以及支持治疗。

2、三叉苦拉丁学名melicopepteleifolia，芸香科植物，广泛分布于中国南方诸省如广东、福建、海南、广西、云南、贵州等省区。其性味苦寒，具有清热解毒、祛风除湿之功效。药理学研究表明，三叉苦提取物或从中分离得到的化合物具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用。研究表明，炎症、氧化应激等因素参与脓毒症相关性脑病的病程。但到目前为止，尚未见三叉苦治疗脓毒症相关性脑病的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供三叉苦总黄酮(melicopepteleifolia totalflavonoids,mptf)在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用，为脓毒症相关性脑病治疗药物的研发提供新的思路，三叉苦易得，可带动药材资源的充分开发和利用。

2、本发明的技术方案：三叉苦提取物在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用。

3、前述三叉苦提取物在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用，所述三叉苦提取物为三叉苦总黄酮。

4、前述的三叉苦提取物在制备治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用，所述三叉苦总黄酮的制备方法按照以下步骤进行：

5、(1)将三叉苦叶粉碎过筛后，加95％乙醇浸泡过夜，用旋转蒸发仪减压浓缩，得到a品；

6、(2)取a品上经95％乙醇预处理的hpd-100型号大孔树脂柱，上样体积4300ml，用3500ml蒸馏水洗脱，然后用70％乙醇4500ml冲洗柱子，收集70％乙醇过柱馏分，得b品；

7、(3)取b品重复步骤(2)一次，收集70％乙醇过柱馏分，蒸干得三叉苦总黄酮浸膏粉末。

8、前述步骤(1)中，三叉苦与95％乙醇的重量比约为1:5-10，所述滤液减压浓缩至原体积的1/5-1/4。

9、前述步骤(1)中，旋转蒸发仪减压至400～600毫米汞柱。

10、一种治疗脓毒症相关性脑病的药物，所述药物原料中包含三叉苦总黄酮。

11、一种治疗脓毒症相关性脑病的药物，所述药物主要由三叉苦总黄酮制备得到。

12、前述治疗脓毒症相关性脑病药物的制备方法，取三叉苦总黄酮，与药物中可接受的辅料进行组合，按照常规方法进行加工，制成相应的药物。

13、前述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或口服液。

14、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

15、1、到目前为止，人们对于脓毒症相关性脑病的发病机制还未清楚，因此还没有研发出有效治疗脓毒症相关性脑病药物。本发明发现，三叉苦总黄酮可以用于脓毒症相关性脑病的治疗，如本发明的后续实验证明中所示：体外，三叉苦总黄酮(14.5μg/ml)体外明显保护lps(50ng/ml)联合inf-γ(200u/ml)刺激的大鼠皮质星形胶质细胞。

16、2、体内，与clp模型组比较，三叉苦总黄酮(30、60mg/kg)明显增加脓毒症小鼠生存数量，差异具有统计学意义。与clp组比较，三叉苦总黄酮(60mg/kg)明显减轻脓毒症小鼠脑组织损伤，减少炎性浸润，维持细胞正常结构等。

17、3、在存活脓毒症小鼠中，相对于地塞米松组，三叉苦总黄酮组中未发现一例小鼠出现脓毒症相关性脑病症状。

18、目前现有技术中尚没有把三叉苦应用于脓毒症相关性脑病的治疗，因此，无法认识到将其作为药物研究其临床价值。本发明通过以下实验，证明三叉苦能用于治疗脓毒症相关性脑病。

19、实验证明：

20、1mptf的提取、纯化

21、1.1大孔树脂预处理

22、hpd-100型号大孔树脂，采用95％乙醇浸泡过夜，用95％乙醇洗至无浑浊现象，用蒸馏水洗至无醇味，采用湿法上柱，柱高52cm，直径9.3cm柱体积(bv)，3530.52cm3。

23、1.2提取

24、称取1.1kg三叉苦原药材，采用上述方法制备总黄酮提取液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，上样总体积4300ml(1.2bv)，用3500ml蒸馏水洗脱，然后用70％乙醇(4500ml，1.3bv)以2bv/h冲洗柱子，收集70％乙醇过柱馏分，得第一次过柱样品，然后将第一次得到样品根据上述方法进行第二遍纯化。

25、2纯化样品总黄酮含量测定

26、第二次纯化样品，浓缩蒸干，得总黄酮浸膏粉末，取0.1222g样品，采用200ml 70％乙醇溶解，从中取0.5ml置于有塞试管中，参照na2no2-al(no3)3-naoh显色法测定总黄酮含量。

27、根据标准曲线和公式y(％)＝[(cv*10-3)d/m]*100，计算得出样品总黄酮含量为81.3％。

28、y为三叉苦总黄酮含量，mg/g；c为试样的测定质量浓度，mg/ml；v为滤液体积，ml；d为稀释倍数；m为原料质量，平行称量三叉苦总黄酮样品1.1546g、1.1593g，分别命名为zht-1、zht-2，根据标准曲线与吸光度关系计算得到二者含量(表2)。

29、表1.标曲浓度与吸光度

30、

31、表2.样品浓度与吸光度

32、

33、3hplc分析mptf

34、取适量mptf样品，用于hplc分析。实验条件：agilent c18柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温30℃，检测波长240nm，流速1ml/min，进样量2μl，流动相：甲醇/水。

35、结果表明，在18min时hplc图谱上有一明显且单一出峰，经分析为三叉苦总黄酮(图1)。

36、4细胞实验

37、4.1mptf对大鼠皮质星形胶质细胞的毒性作用

38、采用cck-8法测定不同浓度三叉苦总黄酮对大鼠皮质星形胶质细胞的毒性。细胞毒作用实验中三叉苦总黄酮的给药浓度分别为232、116、58、29、14.5、7.25μg/ml。

39、大鼠皮质星形胶质细胞，购自青旗(上海)生物技术发展有限公司。

40、收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度至1×106/ml，接种于96孔细胞培养板中，每个孔中加入10ml细胞悬液，5％co2，37℃孵育。待孔内细胞汇合度达到90％左右时，同时加入不同浓度三叉苦总黄酮(溶于dmso)，使之终浓度分别达到232、116、58、29、14.5、7.25μg/ml，每个梯度设3个复孔。同时，设立空白组(只有细胞)。孵育24h后，分别加入cck-8试剂10μl，并在孵育箱内继续培养。1.5h后取出96孔板，使用酶标仪于450nm处测定各待测样品od值，并计算抑制率，抑制率＝(od空白-od处理)/od空白×100％，分析三叉苦总黄酮对大鼠皮质星形胶质细胞增殖的影响。

41、结果

42、cck-8结果表明，与空白比较，结果表明，三叉苦总黄酮在其浓度小于或等于29μg/ml时对大鼠皮质星形胶质细胞无明显细胞毒性，当三叉苦总黄酮浓度大于或等于58μg/ml时对大鼠皮质星形胶质细胞有明显抑制作用(p<0.01)(表3)。

43、表3.不同浓度三叉苦总黄酮对大鼠皮质星形胶质细胞增殖的影响

44、

45、*p<0.05，**p<0.01vs.空白。

46、4.2三叉苦总黄酮对lps联合inf-γ刺激大鼠皮质星形胶质细胞的保护作用

47、采用cck-8法测定不同浓度三叉苦总黄酮对lps联合inf-γ刺激大鼠皮质星形胶质细胞的保护作用。

48、细胞保护作用实验中三叉苦总黄酮的给药浓度分别为7.25、14.5、29μg/ml。

49、细胞孵育同上。待培养孔中细胞汇合度达到90％左右时，同时加入lps和inf-γ，使孔内lps终浓度达到50ng/ml，inf-γ达到200u/ml。同时立即加入不同浓度三叉苦总黄酮，使之浓度分别达到7.25、14.5、29μg/ml。每个梯度设3个复孔。同时，设立空白组(只有细胞)。孵育24h后，分别加入cck-8试剂10μl，操作同上读取od450，并计算细胞增殖率。

50、结果

51、与空白相比，lps联合inf-γ明显抑制大鼠皮质星形胶质细胞增殖(p<0.05)；与lps联合inf-γ相比，14.5μg/ml三叉苦总黄酮明显促进细胞增殖(p<0.05)，差异具有统计学意义(表4)，表明三叉苦总黄酮明显保护lps联合inf-γ所致细胞损伤。

52、表4.三叉苦总黄酮对lps联合inf-γ刺激大鼠皮质星形胶质细胞的保护作用

53、

54、*p<0.05vs.空白；#p<0.05vs.lps+inf-γ。

55、5动物实验

56、5.1三叉苦总黄酮保护clp诱导的脓毒症小鼠

57、采用kaplan-meier法测定比较组间小鼠生存率的差异。

58、三叉苦总黄酮的给药剂量分别为15、30、60mg/kg。

59、将spf级icr雄性小鼠随机分为溶媒组、clp组、三叉苦总黄酮低剂量组(15mg/kg)、三叉苦总黄酮中剂量组(30mg/kg)、三叉苦总黄酮高剂量组(60mg/kg)、地塞米松组(5mg/kg)，每组12只动物。参考文献采用盲肠结扎穿孔(clp)法复制脓毒症小鼠模型，同时设立假手术组。造模后，各给药组连续给药三天，每天一次，clp组、假手术组给予等体积的纯净水。观察动物一般情况，记录并比较各组小鼠168h内死亡差异。

60、结果

61、除假手术组外，其余组小鼠出现死亡。其中clp组72h内动物死亡率为100％，死亡集中出现在24-48h，表明造模成功。与clp组比较，三叉苦总黄酮(30、60mg/kg)明显增加脓毒症小鼠的生存数量，差异具有统计学意义(p<0.05)(图2、表5)。

62、表5.不同时间点各组动物生存数量(只)

63、

64、5.2三叉苦总黄酮降低脓毒症相关性脑病发生率

65、另外，经地塞米松处理后存活的少数脓毒症小鼠出现明显的中枢神经系统症状(动物在笼中不停转圈，持续10min以上)机率明显增加(20～30％左右)，初步判断为脓毒症相关性脑病。而经三叉苦总黄酮处理后，未见一例存活动物出现此类神经系统症状。这一结果提示，三叉苦总黄酮降低脓毒症小鼠脓毒症相关性脑病的发生率(表6)。

66、表6.脓毒症小鼠脓毒症相关性脑病发生情况

67、

68、5.3mptf减轻脓毒症小鼠脑组织病理损伤

69、h&e切片病理检查提示，模型组动物神经元排列紊乱，胞质深染，核固缩。三叉苦总黄酮明显减轻脓毒症小鼠脑组织的病理损伤，包括减少炎性浸润，维持细胞正常结构等(图3)。

70、综上所述：本发明的实验结果发现，本发明实验结果发现，三叉苦总黄酮体外明显增加lps联合inf-γ刺激的大鼠皮质星形胶质细胞增殖率。体内提高clp致脓毒症小鼠的生存率，并明显降低脓毒症小鼠脑组织的病理损伤。

71、所以，本发明提供三叉苦在治疗脓毒症相关性脑病药物中的应用，为脓毒症的药物治疗提供新的思路。三叉苦易得，可以带动药材资源的充分开发和利用，并产生有益效果。