PKM2在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及脊髓损伤修复领域及神经损伤修复领域，具体地，涉及pkm2在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

背景技术：

1、脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是一种严重的中枢创伤性疾病，常导致损伤截面以下神经根或有髓神经束的运动及感觉功能丧失。国内流行病学调查结果显示，近十年sci的发病率为15～61例/百万人，并呈逐年上升趋势，已严重影响了人民生活健康。

2、sci主要包括原发性和继发性损伤两个病理过程，其中继发性sci在我国高发。目前，继发性sci的临床治疗主要是术后短期的大剂量激素冲击疗法，减缓损伤后脊髓微环境中的炎症风暴、水肿等有害病理过程。然而从长期来看，大剂量激素冲击疗法对sci的恢复几乎没有作用，可能因为激素在抗炎、消肿治疗的同时也抑制了神经元的再生活性，所以激素冲击疗法加重了脊髓损伤微环境中神经元本再生能力的恶化。因此，增强神经元的“再生”能力，即重启神经元的细胞周期，是当下sci临床治疗中需要解决的首要问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的继发性脊髓损伤难以治疗的问题，本发明提供了pkm2在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供pkm2蛋白在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

3、本发明的第二个目的是提供pkm2蛋白在制备调节脊髓神经元再生的药物中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供pkm2蛋白在制备调节脊髓神经元细胞周期的药物中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备调节脊髓神经元再生的药物中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备调节脊髓神经元细胞周期的药物中的应用。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、本发明证实了出生3天以内小鼠的脊髓神经元有旺盛的再生能力，且脊髓神经元的代谢模式由胚胎期间的糖酵解供能为主，转变为出生后以葡萄糖有氧氧化供能为主。对此，本发明通过代谢组联合转录组测序分析确定了，以出生后3天左右为界，小鼠脊髓组织的代谢模式由无氧糖酵解供能转变成葡萄糖的有氧氧化供能，并且差异代谢产物及mrna富集到了糖酵解关键酶中的m2型丙酮酸激酶pkm2上。

10、pkm2是细胞无氧糖酵解途径的最后一个关键酶，其催化磷酸烯醇式丙酮酸与adp生成丙酮酸和atp，并且在幼稚神经组织中表达旺盛。本发明构建了脊髓神经元特异性过表达pkm2小鼠nestin-icre pkm2ki，通过细胞增殖特异性染色发现其成年原代脊髓神经元增殖能力与nestin-icre pkm2flox对照组小鼠相比显著提高。脊髓损伤30天后，nestin-icrepkm2ki小鼠与对照组小鼠相比，行为学上运动功能恢复程度提高，形态学上脊髓组织修复较好，神经元再生活性也相应提升。其次，在nestin-icre pkm2ki小鼠体内注射特异性沉默pkm2的腺相关病毒pkm2ko-aav9病毒，发现在nestin-icre pkm2ki小鼠体内下调pkm2后，脊髓损伤后小鼠神经功能恢复现象基本消失。

11、本发明在体外采用代谢流手段对pkm2正反干预的原代脊髓神经元进行代谢异常机制的筛选，发现神经元激活pkm2后，在g6pd的作用下代谢通量13c大量进入磷酸戊糖途径，磷酸戊糖途径的激活会进一步减少神经元损伤后的dna损伤，激活其细胞周期正性因子，进而重启神经元的细胞周期来促进其再生活性。

12、因此，本发明明确了在脊髓损伤后，pkm2会通过提高神经元的再生能力来修复脊髓损伤；pkm2发挥代谢酶活性作用，通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pd操控磷酸戊糖途径来调控神经元细胞周期。

13、pkm2蛋白在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用应在本发明的保护范围之内。

14、优选地，所述脊髓损伤为继发性脊髓损伤。

15、优选地，所述治疗脊髓损伤包括缓解氧化应激和/或减少神经元损伤。

16、pkm2蛋白在制备调节脊髓神经元再生的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

17、pkm2蛋白在制备调节脊髓神经元细胞周期的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

18、优选地，所述调节脊髓神经元细胞周期为调节细胞周期因子的表达。

19、更优选地，所述细胞周期因子包括cyclin d1、cyclin d3、cdk4、cdk6、cyclin e2、cyclin a2、cdk2、cyclin b1、cyclin b2、cdk1、p16、p21和/或p27。

20、pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备调节脊髓神经元再生的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

21、pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

22、优选地，所述脊髓损伤为继发性脊髓损伤。

23、优选地，所述治疗脊髓损伤包括缓解氧化应激和/或减少神经元损伤。

24、pkm2基因和/或pkm2蛋白的激动剂在制备调节脊髓神经元细胞周期的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。

25、优选地，所述调节脊髓神经元细胞周期为调节细胞周期因子的表达。

26、更优选地，所述细胞周期因子包括cyclin d1、cyclin d3、cdk4、cdk6、cyclin e2、cyclin a2、cdk2、cyclin b1、cyclin b2、cdk1、p16、p21和/或p27。

27、优选地，所述激动剂为过表达pkm2的sgrna和/或过表达pkm2的基因编辑载体。

28、核苷酸序列如seq id no.3～4所示的sgrna以pkm2(gene id：ensmusg00000032294)的第2个外显子(seq id no.1)作为过表达pkm2的编辑位点，核苷酸序列如seq id no.5～6所示的sgrna以pkm2(gene id：ensmusg00000032294)的第4个外显子(seq id no.2)作为过表达pkm2的编辑位点，利用crispr-cas9载体对编辑位点定点敲入过表达pkm2的sgrna。

29、更优选地，所述过表达pkm2的sgrna由2条碱基互补配对的单链sgrna经过退火得到；所述2条碱基互补配对的单链sgrna的核苷酸序列如seq idno.3～4所示或如seq idno.5～6所示。

30、进一步优选地，所述2条碱基互补配对的单链sgrna的核苷酸序列如seq id no.3～4所示。

31、优选地，所述过表达pkm2的基因编辑载体为表达上述sgrna的crispr-cas9载体。

32、更优选地，所述crispr-cas9载体以px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9vector质粒作为骨架。

33、进一步优选地，所述crispr-cas9载体表达核苷酸序列如seq id no.3～4所示或如seq id no.5～6所示的sgrna。

34、更进一步优选地，所述crispr-cas9载体表达核苷酸序列如seq id no.3～4所示的sgrna。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明首次证实了pkm2基因和pkm2蛋白可以重启脊髓神经元的细胞周期，促进脊髓神经元再生，进而可以有效修复脊髓损伤。pkm2可以作为弥补脊髓损伤激素冲击疗法副作用的靶标，有利于优化现有脊髓损伤的临床治疗方法，为我国脊髓损伤患者带来福音。