一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒及其制备方法和应用

本发明属于生物医用新材料，尤其涉及一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脓毒症是医院重症监护室的主要死亡原因，尽管科学界及医务工作者为改善其死亡率付出了巨大的努力，但成功治疗脓毒症在世界范围内仍是一个巨大的挑战，每年仍有超过1100万人死于脓毒症(参见rudd,k.e.；johnson,s.c.；agesa,k.m.；shackelford,k.a.；tsoi,d.；kievlan,d.r.；colombara,d.v.；ikuta,k.s.；kissoon,n.；finfer,s.；fleischmann-struzek,c.；machado,f.r.；reinhart,k.k.；rowan,k.；seymour,c.w.；watson,r.s.；west,t.e.；marinho,f.；hay,s.i.；lozano,r.；lopez,a.d.；angus,d.c.；murray,c.j.l.；naghavi,m.the lancet 2020,395,200)。在脓毒症发病过程中，主要侵入病原体包括细菌、病毒和真菌。当宿主受到感染时，免疫系统被过度激活，导致包括细胞游离dna(cfdna)、活性氧(ros)、一氧化氮、组蛋白、促炎细胞因子在内的多种炎症介质的产生和释放。如果病原体和炎症介质无法得到及时和有效的清除，就会使宿主进入过度炎症和代偿性免疫抑制的恶性循环。因此，及时清除病原体和消除炎症介质对脓毒症的治疗至关重要(参见van der poll,t.；shankar-hari,m.；wiersinga,w.j.immunity 2021,54,2450)。将抗生素和抗炎药物共同传递到感染部位，既可以快速清除病原体又可以抑制过度激活的免疫系统，不失为一种治疗脓毒症的有效策略(参见shi,c.；wang,x.；wang,l.；meng,q.；guo,d.；chen,l.；dai,m.；wang,g.；cooney,r.；luo,j.nat commun 2020,11,3384，zhang,c.y.；gao,j.；wang,z.adv mater 2018,30,e1803618)。因此，开发同时具有抗菌和抗炎活性的多功能纳米材料具有良好的前景及重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒及其制备方法和应用，该纳米颗粒通过抗菌作用及时清除感染源，通过抗炎作用清除多种炎症介质，控制宿主体内过激的免疫反应，从而实现对肺炎和脓毒症的有效治疗。

2、本发明提供了一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒，包括单宁酸、锰离子和抗生素；

3、所述单宁酸、锰离子和抗生素的质量比为1:(0.1～50):(0.1～50)。

4、在本发明中，所述抗生素选自庆大霉素、加替沙星、多粘菌素e和多粘菌素b中的一种或多种。

5、在本发明中，所述单宁酸具有一定的抗氧化和抗炎特性，其与核酸之间可形成稳定的氢键，能消除炎症过程中产生的活性氧和游离核酸，实现抗炎特性。

6、在本发明中，所述兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒的粒度为100～200nm。

7、本发明提供了一种上述技术方案所述兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

8、将单宁酸水溶液、氯化锰水溶液和抗生素水溶液混合，加入ph值调节剂，析出颗粒，得到兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒。

9、该方法简单，易于操作，制备成本低；制备处的纳米颗粒具有优良的抗菌和抗炎性能，可通过同时清除感染源和清除多种炎症介质，控制宿主体内过激的免疫反应，从而实现对肺炎和脓毒症的有效治疗。

10、在本发明中，单宁酸、氯化锰和抗生素的质量比为1:(0.1～50):(0.1～50)；具体实施例中，所述单宁酸、氯化锰和抗生素的质量比为1:0.1:0.5。

11、在本发明中，所述ph值调节剂选自氨水、氢氧化钠或氢氧化钠溶液。

12、在本发明中，加入ph值调节剂后体系的ph值为7～9。

13、在本发明中，所述单宁酸水溶液、氯化锰水溶液和抗生素水溶液混合的时间为0.1～5h，优选为0.1～0.2h；

14、加入ph调节剂后搅拌0.1～5h，优选为0.2～0.5h。

15、在本发明中，析出颗粒后进行离心、洗涤和浓缩，得到兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒；所述离心的转速为5000～20000rpm，离心的时间为5～30min。

16、本发明提供了一种上述技术方案所述兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒在制备治疗肺炎药物或脓毒症药物中的应用。

17、本发明优选按照以下进行：

18、1)细胞培养：在本发明中，选用raw264.7等细胞系，所述细胞培养方法为本领域技术人员熟知的方法，没有特殊的限制。本发明中，优选用含10％胎牛血清的dmem培养基对细胞进行培养，所述培养条件优选在体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养，培养温度优选37℃。

19、2)游离核酸检测：在本发明中选用将picogreen dsdna定量试剂盒检测材料对游离核酸的吸附作用。首先将12.5μl picogreen浓缩液和20μl2.5mg/ml dna标准液加入至10ml te缓冲液中并混合均匀。然后，将不同浓度的材料(样品组)或milli-q水(空白组)和100μl上述混合溶液加入至96孔板中，在37℃下孵育30分钟后用多功能酶标仪测量picogreen-dna复合物的荧光强度(λex＝480nm，λem＝520nm)。dna亲和力按以下公式计算。

20、

21、其中，fb和fs分别为处理过的样品组和空白组的荧光强度。

22、3)活性氧检测：活性氧评价选用raw264.7细胞系。将细胞按照每孔8×103的密度种植于96孔板中，培养过夜。然后用50μm叔丁基过氧化氢(tbhp)和60μg/ml材料处理细胞，其中tbhp可以诱导细胞产生活性氧。24h后用活性氧检测试剂盒处理细胞，并用荧光显微镜成像。

23、4)细胞水平抗炎检测：细胞水平抗炎检测选用raw264.7细胞系。将细胞按照每孔2×104的密度种植于96孔板中。将25ng/ml的脂多糖(lps)和不同浓度的样品在milli-q水中混合，混合物在室温下共孵育1h后离心，其中lps的作用是诱导细胞产生炎症。然后，取离心得到的上清液20μl加入到96孔板中，培养24小时后，用肿瘤坏死因子-α(tnf-α)elisa试剂盒检测培养基中的tnf-α含量，其中tnf-α为巨噬细胞产生的一种炎症细胞因子，其含量与细胞炎症水平呈正相关。

24、5)细胞毒性：细胞毒性评价选用raw264.7等细胞系。将细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，培养过夜。不同浓度的材料与细胞共培养24h后，将96孔板中的液体吸出并加入含有10％cck-8的培养基中，共孵育后，通过酶标仪检测每孔在450nm和600nm下吸光度值。并通过以下公式计算细胞存活率。

25、δa＝a450/a600

26、细胞存活率(％)＝(δa样品/δa空白)×100

27、6)细菌培养：在本发明中，选用e.coli细菌，所述细菌培养方法为本领域技术人员熟知的方法，没有特殊的限制。本发明中，优选用luria-bertani液体培养基对细菌进行培养，所述培养条件优选在培养温度为37℃的培养箱中连续培养。

28、7)动物模型：在本发明中，肺炎模型实验选用balb/c鼠，脓毒症模型实验选用c57鼠。balb/c鼠腹腔注射7％戊巴比妥麻醉，经气管给lps水溶液至小鼠肺部建立肺炎模型，模型建立2h后开始治疗实验。c57小鼠使用异氟醚麻醉系统麻醉，腹部剃须和消毒。在小鼠腹部中线切约1cm开口，轻轻取出盲肠，在距盲肠尾端约1.5cm处用4-0丝线结扎，使用21号针穿刺盲肠，挤压盲肠内容物后，将盲肠放回腹腔，缝合腹部切口，建立脓毒症模型。模型建立1h后开始治疗实验。

29、8)体内炎症检测：在检测肺炎模型中体内炎症时，解剖出小鼠肺部组织，用pbs制备10％的匀浆介质。在3000rpm，4℃下离心20分钟收集上清液。用elisa试剂盒测定肺炎模型小鼠血清和肺组织匀浆上清液中的炎症因子tnf-a和白介素6(il-6)的含量。在检测肺炎模型中体内炎症时，用elisa试剂盒测定脓毒症模型小鼠血清和腹腔灌洗液中的炎症因子tnf-a和il-6的含量。

30、本发明提供了一种兼具抗菌和抗炎作用的纳米颗粒，包括单宁酸、锰离子和抗生素；所述单宁酸、锰离子和抗生素的质量比为1:(0.1～50):(0.1～50)。该纳米颗粒利用单宁酸、锰离子和抗生素之间的配位作用，使其具有优良的抗菌和抗炎性能，可通过同时清除感染源和清除多种炎症介质，控制宿主体内过激的免疫反应，从而实现对肺炎和脓毒症的有效治疗。