一种脱细胞外基质及其制备方法与应用

本发明属于医疗材料领域，具体涉及一种脱细胞外基质及其制备方法与应用。

背景技术：

1、脱细胞外基质因具有良好的生物相容性和生物活性而被广泛的应用于组织工程和再生医学邻域。而目前常用的脱细胞外基质主要来源于人或动物的组织和器官，通过物理、化学和酶解等方法获得脱细胞外基质。然而在组织工程和再生医学应用过程中，人或动物组织、器官来源的脱细胞外基质仍具有一定的局限性。如人来源的脱细胞外基质，因组织、器官的有限性使该类来源的脱细胞外基质无法实现大规模生产，因此其应用也受到了相应的局限；同时该类来源的脱细胞基质也可因供体疾病而存在病毒的携带。而动物来源的脱细胞基质虽能实现量产而得到广泛的应用，但在临床应用中动物源性脱细胞基质属于异种来源性脱细胞外基质，应用过程中极易引起免疫反应，所以在脱细胞过程中需更加注重免疫源的清除，因此使脱细胞的过程更加繁琐，这不仅造成脱细胞周期的延长，而且也会因繁琐的脱细胞过程造成脱细胞外基质含有的成分以及三维结构的破坏，从而影响其应用中应具有的生物活性。

2、基质胶(matrigel)作为一种基底膜基质，主要提取于engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤的细胞外基质。其成分主要有含细胞粘附位点的层粘连蛋白、胶原iv、巢蛋白及各种细胞因子等，因此具有良好的生物活性，并被广泛的应用于细胞培养、三维组织工程应用及类器官构建等。然而因其其他成分的复杂性及批次间成分的差异，极易导致基质胶在应用过程中产生的结果不一致，因此其应用的生物效果需谨慎商榷。同时作为一种动物源性的脱细胞外基质，同样存在异种的免疫原性风险以及病毒携带的可能性，如研究发现基质胶存在有乳酸脱氢酶增高症病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，ldhv)的携带，因此其使用也受到一定的局限。

3、基底膜作为ecm中一类，广泛分布于血管，肌组织及神经纤维中。而其成分主要包含有层粘连蛋白(laminin)、胶原iv及少部分的基底膜聚糖和巢蛋白1/2等。研究发现，laminin富含干细胞，表皮细胞、内皮细胞及肿瘤细胞黏附位点，能够促进细胞黏附。同时，胶原iv也富含细胞粘附受体的多价配体并作为其他蛋白质稳定的支架，在刺进细胞粘附、组织发生、分化、内稳态和重塑中起着关键作用。因此，含有laminin和胶原iv的ecm能够很好的促进细胞粘附、增殖及分化作用，然而，目前尚未有相关的原始内胚层样细胞脱细胞外基质制备与组织工程应用的研究，探索其脱细胞基质的制备，有利于该基质成分组成的分析及其在未来相应组织工程中的深入应用。

4、近年，基于人及动物组织源性脱细胞外基质的缺点，细胞源性的脱细胞外基质(cell-drived matrix，c-decm)也逐渐的被开发应用于组织工程及再生医学领域。研究发现c-decm同样是一种功能性的细胞外基质，具有类似组织微环境的生物大分子及信号通路因子等。而且相对于组织源性的脱细胞外基质，c-decm可通过不同细胞的培养及培养条件的调控实现脱细胞外基质大规模及定制化的生产，并且能够保障批次间脱细胞外基质成分的稳定性。同时细胞培养生产的c-decm在免疫原性及病毒携带方面同样具有优于组织源性脱细胞外基质。因此，在未来组织工程和再生医学中，c-decm将是一种潜在首选性的功能性生物材料。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种脱细胞外基质的制备方法。

2、本发明还提出一种通过上述方法制备得到的脱细胞外基质。

3、本发明还提出一种上述脱细胞外基质的应用。

4、根据本发明的一个方面，提出了一种脱细胞外基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：

5、s1、将经消化后的小鼠畸胎瘤细胞进行分化培养，形成原始内胚层样细胞；

6、s2、将步骤s1得到的原始内胚层样细胞加入脱细胞试剂进行脱细胞处理后，进行透析，得到脱细胞外基质。

7、在本发明的一些实施方式中，小鼠畸胎瘤细胞的数目为3×106～5×106。

8、在本发明的一些实施方式中，所述消化是通过将消化液加入小鼠畸胎瘤细胞，进行消化。

9、在本发明的一些实施方式中，所述消化液包括0.1～0.3％trypsin和0.6～0.6mmedta。

10、在本发明的一些实施方式中，所述消化的时间为0.5-2min。

11、在本发明的一些实施方式中，所述分化培养采用的培养基中包括全反式维甲酸和联丁酰-环磷酸腺苷。

12、在本发明的一些实施方式中，所述全反式维甲酸的浓度为0.05～0.3μm。

13、在本发明的一些实施方式中，所述联丁酰-环磷酸腺苷的浓度为100～500μm。

14、在本发明的一些实施方式中，所述分化培养采用的培养基中还包括dmem基础培养基、胎牛血清和双抗。

15、在本发明的一些实施方式中，所述双抗为青霉素和链霉素的混合液。

16、在本发明的一些实施方式中，所述双抗添加量为培养基中液体总体积的0.5-1.5％(v:v)。

17、在本发明的一些实施方式中，所述胎牛血清添加量为培养基中液体总体积的5-15％(v:v)。

18、在本发明的一些实施方式中，所述分化培养的条件为32～39℃，培养3-5天。

19、在本发明的一些实施方式中，所述脱细胞试剂包括氨水、脱氧胆酸钠、dnase-i和triton x100中的至少一种。

20、在本发明的一些实施方式中，所述脱细胞试剂包括氨水、脱氧胆酸钠和dnase-i中的至少一种。

21、在本发明的一些实施方式中，所述氨水的浓度为20-30nm。

22、在本发明的一些实施方式中，所述脱氧胆酸钠的浓度为3-5％。

23、在本发明的一些实施方式中，所述dnase-i的浓度为0.5～2mg/ml。

24、在本发明的一些实施方式中，所述透析采用透析袋进行。

25、在本发明的一些实施方式中，所述透析袋的材质为再生纤维素膜或超滤膜。

26、在本发明的一些实施方式中，所述透析袋的分子量为800-1300d。

27、在本发明的一些实施方式中，所述透析袋的分子量为1000d。

28、在本发明的一些实施方式中，还包括将所述脱细胞外基质进行干燥的步骤。

29、在本发明的一些实施方式中，所述干燥采用低温冷冻干燥。

30、在本发明的一些实施方式中，所述低温为-80℃。

31、根据本发明的第二方面，提出了一种上述方法制备得到的脱细胞外基质。

32、在本发明的一些实施方式中，所述脱细胞外基质中含有层粘连蛋白和胶原iv。

33、根据本发明的第三方面，提出了上述脱细胞外基质的应用，所述应用为细胞培养中的应用。

34、在本发明的一些实施方式中，所述应用为在组织修复中的应用。

35、在本发明的一些实施方式中，所述组织修复包括血管、骨骼肌及神经等组织的修复再生。

36、根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明脱细胞外基质的制备方法，操作简单、周期短、成本低廉，可以实现量化、无病毒携带及稳定成分脱细胞外基质的的批量生产，通过本发明方法制备得到的脱细胞外基质含有丰富的层粘连蛋白及胶原iv成分，可作为一种理想的生物材料应用于组织的修复，包括血管、骨骼肌及神经等组织的修复再生。