用于选择冷冻保存的脐带血单位以制备具有增强的抗癌效力的工程化自然杀伤细胞的方法

本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学的。

背景技术：

1、经修饰以表达car的脐带血来源的自然杀伤(nk)细胞是对抗癌症的有效疗法。事实上，脐带来源的nk细胞可以被修饰(通过遗传或非遗传方法)来治疗多种恶性肿瘤和感染。冷冻保存的脐带血单位可容易地在生物样本库中获得(因为它们被用作干细胞移植的细胞源)，并且可以提供足够数量的nk细胞来制备用于临床用途的多种细胞治疗产品。使用脐带血单位作为nk细胞来源的替代方案是通过白细胞单采术(leukoapheresis)从健康供体获得细胞。这一程序较复杂，而且对供体来说也存在风险。nk细胞产品的临床疗效在很大程度上受到冷冻保存的脐带单位的特征的影响。本公开满足了现有技术中获取合适细胞以用于细胞治疗的长期存在的需求。

技术实现思路

1、本公开涉及与个体的细胞疗法相关的方法和组合物。细胞疗法可以是任何类型的，但在特定的实施方案中，细胞疗法包含使用免疫细胞的过继性细胞疗法，这些免疫细胞至少包括在向需要细胞的个体施用之前终归可以受到修饰的免疫细胞。在特定的实施方案中，本公开涉及鉴定特别适合于产生用于个体的过继性细胞疗法的有效免疫细胞的脐带血单位，包括比在未鉴定的情况下选择脐带血更有效的情况。

2、本公开涉及鉴定最有可能产生用于治疗患者的高效免疫细胞治疗产品的脐带血单位的多部分策略，这些治疗包括治疗任何类型的医学病况，至少诸如任何类型的癌症或感染。本公开提供了一组选择标准，包括以下标准：(i)在冷冻保存脐带血单位之前，(ii)冻融后和免疫细胞制备开始时，诸如在gmp设施中，以及(iii)在制备过程中和制备结束时的免疫细胞特征。

3、具体实施方案包括选择脐带血组合物的方法，包括在冷冻保存或使用脐带血组合物之前进行测量的以下步骤：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率；(c)有核红细胞(nrbc)含量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；(f)任选的脐带血所来源的婴儿的胎龄；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(一个示例是35ml柠檬酸磷酸盐右旋糖(cpd))的体积)≤120ml；(j)任选地抽取的脐带血的细胞为>0.4％ cd34+；并且任选地在冷冻保存之后测量(k)源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性；以及(l)在冻融后的培养期间，源自脐带血的免疫细胞(包括nk细胞)的倍数扩增。在特定的实施方案中，该标准满足其中至少一种特征的定量阈值。

4、在特定情况下，满足以下一项或多项标准：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率大于或等于76.3％；以及(c)有核红细胞(nrbc)含量小于或等于7.5x107或8.0x107或者其间的任何量。

5、本公开的实施方案涵盖选择脐带血组合物的方法，包括以下步骤：在冷冻保存脐带血组合物之前测量：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率；(c)有核红细胞(nrbc)含量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族；(f)任选地脐带血所来源的婴儿的胎龄；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(35ml cpd)的体积)≤120ml；(j)任选地，抽取的脐带血的细胞为>0.4％ cd34+；并且在冷冻保存之后，任选地测量(k)源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在特定的实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞。所述方法可以进一步包括扩增nk细胞和/或修饰nk细胞的步骤。在一些情况下，对nk细胞进行修饰以表达一种或多种非内源性基因产物，诸如一种或多种非内源性受体(诸如一种或多种嵌合受体，包括一种或多种嵌合抗原受体和/或一种或多种非天然t细胞受体)。在一些情况下，非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。可以对nk细胞进行修饰以破坏nk细胞中一种或多种内源性基因的表达。

6、在一个实施方案中，有一种选择脐带血组合物的方法，包括以下步骤：在冷冻保存之前鉴定脐带血组合物，确定其具有以下一种或多种特征：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率大于或等于76.3％；(c)有核红细胞(nrbc)含量小于或等于7.5x107或8.0x107或者其间的任何量；(d)脐带血所来源的婴儿的体重大于3650克；(e)脐带血所来源的婴儿的生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于约38周；(g)任选地子宫内采集脐带血(尽管在本公开的任何方法中可以使用子宫外或子宫内与子宫外的组合)；(h)任选地脐带血所来源的是生物学男性婴儿；(i)任选地处理前体积(采集的脐带血加上抗凝剂(35ml cpd)的体积)≤120ml；(j)任选地，抽取的脐带血的细胞为>0.4％ cd34+；并且任选地(k)测量源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，在冷冻保存之前确定脐带血组合物至少具有(a)和(b)；确定其具有(b)和(c)；确定其具有(a)和(c)；或者确定其具有(a)、(b)和(c)。

7、在特定情况下，对于(a)而言，脐带血细胞活力大于或等于98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。在特定情况下，对于(b)而言，tnc回收率大于或等于77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在特定情况下，nrbc含量小于或等于8.0x107、7.9x107、7.8x107、7.7x107、7.6x107、7.5x107、7.0x107、6.0x107、5.0x107、4.0x107、3.0x107、2.0x107、1.0x107、9.0x106、8.0x106、7.0x106、6.0x106、5.0x106、4.0x106、3.0x106、2.0x106、1.0x106、9.0x105、8.0x105、7.0x105、6.0x105、5.0x105、4.0x105、3.0x105、2.0x105、1.0x105、9.0x104、8.0x104、7.0x104、6.0x104、5.0x104、4.0x104、3.0x104、2.0x104、1.0x104、9.0x103、8.0x103、7.0x103、6.0x103、5.0x103、4.0x103、3.0x103、2.0x103、1.0x103、9.0x102、8.0x102、7.0x102、6.0x102、5.0x102、4.0x102、3.0x102、2.0x102、1.0x102，如此等等。在特定情况下，脐带血所来源的婴儿的体重大于3650克。在特定情况下，脐带血所来源的生物学母亲的种族是白种人和/或脐带血所来源的婴儿的生物学父亲是白种人。在特定的实施方案中，脐带血所来源的婴儿的胎龄小于或等于约38周。在某些实施方案中，脐带血可以通过任何合适的方法获得，但在特定的实施方案中，脐带血在子宫内、子宫外或二者兼有而获得，尽管在特定的情况下，脐带血仅由子宫内获得。在某些实施方案中，所抽取脐带血的体积加上约35ml的抗凝剂体积≤120ml，如此使得所抽取脐带血的体积不大于约85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30ml，或者更小的体积。

8、本文所包含的任何方法可以进一步包括从冻融的脐带血组合物衍生免疫细胞的步骤。免疫细胞可以是nk细胞、恒定nk细胞、nk t细胞、t细胞、b细胞、单核细胞、粒细胞、髓系细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、干细胞或其混合物。在特定情况下，源自冻融后脐带血组合物的免疫细胞是nk细胞，并且细胞毒性大于或等于66.7％。细胞毒性可以大于或等于67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

9、在一些实施方案中，脐带血来源于胎龄小于或等于39或38周的胎儿或婴儿。脐带血可以来源于胎龄小于或等于下列的胎儿或婴儿：39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25或24周，或者更短时间。在某些情况下，该方法进一步包括确定冻融后脐带血细胞的活力。在特定方面中，冻融后脐带血细胞的活力大于或等于86.5％，诸如大于或等于87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

10、当源自冻融的脐带血组合物的免疫细胞是nk细胞时，可以对它们进行扩增。扩增参数可以根据或不根据具体情况而确定。可以在培养特定天数之后对扩增进行定量，诸如第0天至第15天以及其间的任何范围。细胞的扩增倍数可以是任何合适的量，例如至少或大于约3倍、5倍、7倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍等等。在某些情况下，nk细胞在培养第0天至第6天的扩增大于或等于7倍。在某些情况下，nk细胞在培养第6天至第15天的扩增大于或等于10倍。在特定情况下，扩增在0至15天或6至15天或0至6天(以及其间的任何范围)进行，并且具有大于70倍的扩增。在特定情况下，扩增在0至15天(以及其间的任何范围)进行，并且具有大于450倍的扩增。任何倍数水平的扩增天数范围可以包括0-15、0-14、0-13、0-12、0-11、0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-15、11-14、11-13、11-12、12-15、12-14、12-13、13-15、13-14、14-15等等。

11、可以对nk细胞进行修饰，例如经过修饰以表达一种或多种非内源性基因产物，诸如非内源性受体，包括嵌合受体例如嵌合抗原受体，或非内源性受体是非天然t细胞受体。在一些情况下，非内源性基因产物包含一种或多种非内源性受体、一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、一种或多种酶或者其组合。在特定情况下，对源自所冻融脐带血组合物的免疫细胞进行修饰以破坏细胞中一种或多种内源性基因的表达。

12、在特定情况下，脐带血细胞活力大于98％或99％，tnc回收率大于76.3％，并且nrbc含量低于7.5x107或8.0x107或者其间的任何范围，包括7.5x107-8.0x107、7.5x107-7.9x107；7.5x107-7.8x107；7.5x107-7.7x107；7.5x107-7.6x107；7.6x107-8.0x107；7.6x107-7.9x107；7.6x107-7.8x107；7.6x107-7.7x107；7.7x107-8.0x107；7.7x107-7.9x107；7.7x107-7.8x107；7.8x107-8.0x107；7.8x107-7.9x107；7.9x107-8.0x107。在特定的实施方案中，脐带血来源于胎龄小于或等于39或38周的胎儿或婴儿，冻融后脐带血细胞的活力大于或等于86.5％(这是任选的)，nk细胞在培养第0天至第6天的扩增大于或等于3倍，并且nk细胞在培养第6天至第15天的扩增大于或等于100倍，并且nk细胞在第0天至第15天的扩增大于或等于900倍。在特定情况下，扩增持续6至15天，并且具有大于70倍的扩增。在特定情况下，扩增持续0至15天，并且具有大于450倍的扩增。

13、本公开的实施方案包括通过本文所涵盖的任何一种方法鉴定的脐带血组合物。该组合物可以包含在药学上可接受的载剂中。该组合物可以与一种或多种冷冻保护剂一起配制。

14、本公开的实施方案包括含有源自本文所涵盖的任何方法的免疫细胞群的组合物。

15、在一些实施方案中，有一种预测免疫细胞治疗功效的方法，包括测量一种或多种未冷冻的脐带血组合物的以下特征：(a)脐带血细胞活力；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率；(c)有核红细胞(nrbc)含量；(d)脐带血所来源的婴儿体重；(e)脐带血所来源的婴儿生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿胎龄；其中当脐带血组合物具有一种或多种以下特征时，免疫细胞对治疗有效：(a)脐带血细胞活力大于或等于98％或99％；(b)任选地总单核细胞(tnc)回收率大于或等于76.3％；(c)有核红细胞(nrbc)含量小于或等于8.0x107；(d)脐带血所来源的婴儿体重大于3650克；(e)脐带血所来源的婴儿生物学母亲和/或生物学父亲的种族是白种人；(f)任选地脐带血所来源的婴儿胎龄小于或等于约38周。该方法可以进一步包括冷冻一种或多种血液组合物的步骤。该方法可以进一步包括在冻融后测量(d)源自脐带血组合物的免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，细胞毒性大于或等于66.7％。

16、上文已经较为广泛地概述了本公开的特征和技术优势，以便可以更好地理解下文的详细描述。附加特征和优势将在下文描述，它们构成本文权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的构思和具体实施方案可以很容易地用作修改或设计其他结构的基础，以实现与本设计相同的目的。本领域技术人员还应当认识到，这种等同构造并不脱离如所附权利要求中阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，根据以下描述将更好地理解被认为是本文所公开设计的特征的新的特征，无论是在组织结构和操作方法方面，还是在其他目的和优势方面。然而，应当明确地理解，每个附图仅是出于说明和描述的目的而提供，而并非意在作为对本公开进行限制的解释。