用于提高工程化二聚体蛋白稳定性的水溶液组合物的制作方法

本发明涉及工程化二聚体蛋白的水溶液组合物，其包含在低缓冲剂浓度和低离子强度下的fc结构域并含有中性氨基酸。

背景技术：

1、包含fc结构域的工程化蛋白广泛用于治疗。fc结构域是抗体的c末端区域，其与称为fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白相互作用，并从而激活免疫系统。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc结构域由两个相同的蛋白链片段构成，每个片段来源于抗体重链的第二和第三恒定结构域。在igm和ige抗体同种型中，fc结构域由两个相同的蛋白链片段构成，每个片段来源于抗体重链的第二、第三和第四恒定结构域。fc结构域的分子量通常可以在25-40kda的范围内，并且在存在糖基化的情况下可以更大。由抗体fc结构域结合介导的免疫系统的激活产生了范围广泛的生理效应，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的细胞裂解和脱颗粒。

2、已经开发了范围广泛的工程化抗体蛋白，包括双特异性和三特异性抗体。还开发了许多工程化蛋白，其中从抗体分子的fab部分(赋予抗原结合特异性的部分)分离的fc可用于不同于其生理目的的目的，特别是用于延长工程化蛋白的体内半衰期的目的。

3、wo2013/003641a2和wo2016/069574a1(inhibrx)公开了包括丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽或衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列的工程化二聚体蛋白。

4、当配制成水溶液时，蛋白在储存时可能容易降解，并从而丧失生物活性。降解可以是物理性质的，包括聚集、沉淀或形成凝胶。降解也可以是化学性质的，包括水解裂解、脱酰胺、形成环状酰亚胺、天冬氨酸/谷氨酸异构化或氧化。

5、降解过程的速率随着温度的升高而增加，并且蛋白治疗性分子通常在较低的温度下更稳定。然而，开发在预期保质期(通常为24个月)的持续期间(即使在冷藏条件下)以液体形式稳定的治疗性蛋白产品通常是具有挑战性的。此外，为了确保对患者的便利性，通常需要开发在升高的温度(诸如高达25℃或高达30℃)下在一段特定时间或其整个保质期稳定的产品。

6、控制蛋白治疗剂稳定性的最关键参数之一是ph。因此，ph优化是制剂开发的关键步骤。许多治疗性蛋白是在4.0-8.5之间的选定ph下配制的。确保ph保持在选定值，并使ph波动最小化被认为是重要的。因此，已经了解，在制剂中需要一定程度的缓冲能力。由于多肽主链的氨基酸侧链中存在可离子化基团，因此较大的蛋白分子通常具有一定的自缓冲能力。

7、本发明提供了在水溶液组合物中提高包含fc结构域的工程化蛋白的稳定性的组合物，并且特别是提高其中二聚体蛋白的每个单体包含至少一个与人免疫球蛋白fc多肽或衍生自免疫球蛋白fc多肽的多肽可操作连接的人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的工程化二聚体蛋白(“本发明的工程化二聚体蛋白”)的稳定性。

技术实现思路

1、本公开提供了ph在6.0至8.0范围内的水溶液组合物，其包含：工程化二聚体蛋白，其中二聚体蛋白的每个单体包含至少一个与人免疫球蛋白fc多肽或衍生自免疫球蛋白fc多肽的多肽可操作连接的人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽；任选的一种或多种缓冲剂，其为具有至少一个pka在4.0至10.0范围内的可离子化基团的物质，且所述pka在组合物ph的2个ph单位内；中性氨基酸；以及不带电荷的张力调节剂；其中缓冲剂在组合物中以0-10mm的总浓度存在；并且其中不包括工程化二聚体蛋白的贡献，组合物的总离子强度小于30mm。

2、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自人aat多肽。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，二聚体蛋白的每个单体包含一种人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽具有seq id no:1或2的序列。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，人免疫球蛋白fc多肽或衍生自免疫球蛋白fc多肽的多肽是修饰的人igg4 fc多肽。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，人免疫球蛋白fc多肽或衍生自免疫球蛋白fc多肽的多肽是修饰的人igg4fc多肽，并且具有seq id no:28-43中任一个的序列。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，二聚体蛋白的每个单体具有seq id no:56的序列。

3、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，蛋白以1-400mg/ml，例如10-200mg/ml，例如20-100mg/ml，例如30-60mg/ml，例如约35mg/ml或约50mg/ml的浓度存在。

4、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，缓冲剂以0.1-10mm，诸如0.5-10mm，诸如1-10mm，诸如1-8mm，诸如1-6mm，诸如2-6mm，诸如2-5mm，例如3-5mm的总浓度存在。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物基本上不含缓冲剂。

5、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，缓冲剂包含pka在组合物ph的1个单位内的可离子化基团。

6、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，一种或多种缓冲剂选自柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、亚硫酸盐、阿斯巴甜、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、酒石酸盐、腺嘌呤、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯乙酸盐、没食子酸盐、胞嘧啶、对氨基苯甲酸、山梨酸盐、乙酸盐、丙酸盐、海藻酸盐、尿酸盐、2-(n-吗啉代)乙磺酸、碳酸氢盐、双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷、n-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸、2-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸、哌嗪、n,n’-双(2-乙磺酸)、磷酸盐、n,n-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸、3-[n,n-双(-2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸、三乙醇胺、哌嗪-n,n’-双(2-羟基丙磺酸)、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、n-三(羟基甲基)甘氨酸和n-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，及其盐，及其组合。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，缓冲剂选自柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)，例如选自磷酸盐和tris。

7、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，不带电荷的张力调节剂选自多元醇、糖(例如单糖和二糖)以及糖醇。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，不带电荷的张力调节剂选自甘油、1,2-丙二醇、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、peg300和peg400，且特别地选自甘油、甘露醇、蔗糖和海藻糖。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含二糖作为不带电荷的张力调节剂。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含蔗糖和/或海藻糖作为不带电荷的张力调节剂，特别是海藻糖。

8、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，不带电荷的张力调节剂或超过一种张力调节剂的组合的总浓度为50-1000mm，诸如200-600mm、200-500mm，或者其中不带电荷的张力调节剂或超过一种张力调节剂的组合的总浓度为50-500mm，诸如100-400mm、150-350mm、200-300mm或约250mm。

9、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，组合物的渗透压为200-500mosm/l，例如约300mosm/l或者其中组合物的渗透压是300-500mosm/l，例如约400-460mosm/l。

10、在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含选自以下的中性氨基酸：甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。在一些实施方案中，中性氨基酸选自甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含脯氨酸作为中性氨基酸。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含甘氨酸作为中性氨基酸。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含脯氨酸和甲硫氨酸作为中性氨基酸。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含甘氨酸和甲硫氨酸作为中性氨基酸。

11、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，组合物中的一种或多种中性氨基酸的总浓度为20-600mm，诸如20至500mm，诸如20至400mm，诸如20至300mm，例如50至300mm。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，组合物中的一种或多种中性氨基酸的总浓度为50至200mm、100至200mm或100至150mm。

12、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，不包括工程化二聚体蛋白的贡献，组合物的总离子强度小于20mm。在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，不包括工程化二聚体蛋白的贡献，组合物的总离子强度小于10mm。

13、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，ph为6.8至7.8，例如7.0至7.8、7.1至7.6、7.1至7.5、7.2至7.5、7.1至7.4、7.2至7.3；或者为约7.2或约7.3。

14、在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含非离子表面活性剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂选自烷基糖苷、聚山梨醇酯、聚乙二醇的烷基醚、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(泊洛沙姆)以及聚乙二醇的烷基苯基醚。在一些实施方案中，非离子表面活性剂为聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，非离子表面活性剂为聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(泊洛沙姆)，诸如泊洛沙姆188。

15、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，非离子表面活性剂以10-2000μg/ml，诸如50-1000μg/ml，例如100-500μg/ml，例如约200μg/ml的浓度存在，或者其中非离子表面活性剂以250-1500μg/ml，例如750-1250μg/ml，例如约1000μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物包含防腐剂，诸如酚类防腐剂或苄基防腐剂。在一些实施方案中，酚类防腐剂或苄基防腐剂选自苯酚、间甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯。

16、在本文中公开的水溶液组合物的一些实施方案中，防腐剂以10-100mm，诸如20-80mm，例如25-50mm的浓度存在。

17、在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物为用于治疗的组合物。

18、在一些实施方案中，本文中公开的水溶液组合物为药物组合物。

19、本公开还提供了一种在有需要的受试者中治疗或减轻与异常丝氨酸蛋白酶表达或活性相关的疾病或病症的症状的方法，该方法包括施用本文中公开的水溶液组合物。

20、本公开还提供了一种在有需要的受试者中治疗或减轻炎症或炎性疾病或病症的症状，同时降低感染风险的方法，该方法包括向所述受试者施用本文中公开的水溶液组合物。

21、本公开还提供了一种在有需要的受试者中降低感染风险的方法，该方法包括向所述受试者施用本文中公开的水溶液组合物。

22、本公开还提供了一种在有需要的受试者中治疗或减轻aat缺乏症状的方法，该方法包括向所述受试者施用本公开的水溶液组合物，其中人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自人aat多肽。

23、本文中还提供了本公开的水溶液组合物，其用于在有需要的受试者中治疗或减轻与异常丝氨酸蛋白酶表达或活性相关的疾病或病症的症状的方法。

24、本文中还提供了本公开的水溶液组合物，其用于在有需要的受试者中治疗或减轻炎症或炎性疾病或病症的症状，同时降低感染风险的方法。

25、本文中还提供了本公开的水溶液组合物，其用于在有需要的受试者中降低感染风险的方法。

26、本文中还提供了本公开的水溶液组合物，其用于在有需要的受试者中治疗或减轻aat缺乏症状的方法，其中人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自人aat多肽。

27、本公开还提供了本公开的水溶液组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗或减轻与异常丝氨酸蛋白酶表达或活性相关的疾病或病症的症状。

28、本公开还提供了本公开的水溶液组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗或减轻炎症或炎性疾病或病症的症状，同时降低感染风险。

29、本公开还提供了本公开的水溶液组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在有需要的受试者中降低感染风险。

30、本公开还提供了本公开的水溶液组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗或减轻aat缺乏症状，其中所述人丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽是人α-1抗胰蛋白酶(aat)多肽或衍生自人aat多肽。

31、在根据任一个本公开的方法的用于使用的本公开的水溶液组合物或用途的一些实施方案中，炎性疾病或病症选自以下：α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏、α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏、肺气肿、慢性阻塞性肺病(copd)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、过敏性哮喘、囊性纤维化、肺癌、缺血再灌注损伤、心脏移植后的缺血/再灌注损伤、心肌梗死、类风湿性关节炎、化脓性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、银屑病、i型和/或ii型糖尿病、肺炎、败血症、移植物抗宿主病(gvhd)、伤口愈合、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。

32、在根据任一个本公开的方法的用于使用的本公开的水溶液组合物或用途的一些实施方案中，感染选自细菌感染、真菌感染和病毒感染。

33、在根据任一个本公开的方法的用于使用的本公开的水溶液组合物或用途的一些实施方案中，受试者是人。

34、除非另行定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式全部明确并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，本文中描述的材料、方法和实例仅为说明性的，而非旨在限制。

35、本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和权利要求中显而易见并由其涵盖。