包含NKG2D、CXCR2和DAP10/DAP12融合多肽的组合物及其使用方法

背景技术：

1、使用嵌合抗原受体(car)工程t细胞的免疫疗法已被证明在b细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗中具有变革性。然而，由于缺乏肿瘤选择性靶点，这项技术在实体瘤免疫疗法中的应用受到阻碍。大多数肿瘤抗原是细胞内的，因而不容易被car t细胞识别。因此，目前正在开发的大多数实体瘤导向的car都涉及在肿瘤细胞中上调的靶点，但在正常组织中发现这些靶点的水平较低。

2、nkg2d配体是少数具有高度肿瘤选择性的靶群之一。在人体中，它们包括一组几乎在所有肿瘤细胞类型中都异常表达的8种应激诱导蛋白(mica、micb、ulbp1-6)。此外，nkg2d配体还在肿瘤相关的基质元件如内皮、调节性t细胞和髓源性抑制细胞上被发现(parihar,r.,et al.,2019,cancer immunol.res.7(3):363-375；schmiedel&mandelboim,2018,front.immunol.(9)2040)。nkg2d基因缺陷的小鼠表现出对上皮和淋巴恶性肿瘤的免疫监视作用受损。nkg2d配体是安全的治疗靶点的证据得到了它们没有在健康组织中被发现的事实的支持。使用自体nkg2d靶向car的临床试验尚未发现任何重大的安全性问题(见https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30396908/)。

3、nkg2d受体由自然杀伤细胞(nk)和一些t细胞群天然表达。每个nkg2d同源二聚体通过质膜内的互补带电氨基酸与两个同源二聚体dap10接头分子结合。这种相互作用是nkg2d细胞表面表达和功能所必需的。dap10在通过磷脂酰肌醇3-激酶提供共刺激的能力方面类似于cd28，但重要的是，它缺乏促进调节性t细胞的非必要招募的p56lck结合基序(kofler,et al.,2011,mol.ther.19:760-767)。dap10共刺激的效力因其在内化后持续发出信号的能力而凸显。然而，由于dap10缺乏基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)，nkg2d的参与不会导致t细胞的完全激活。

4、目前已开发了多种car，它们使用不同的方法提供itam依赖性信号1外以及协同刺激(也称为信号2)，因为这两种信号类型都是引起t细胞完全激活所必需的。第一个靶向nkg2d的car由sentman等人开发，并由nkg2d与cd3ζ融合组成(zhang et al,2005,blood106:1544-1551)。虽然名义上是第一代car，但它与t细胞中的内源性dap10相关，这意味着信号1和信号2都被提供。这种car目前正由celyad oncology公司作为cyad-01进行临床开发。最近，chang et al.(2013,cancer res.73:1777-1786)改造了nk细胞，使其除了外源性dap10外，还共表达一种相同的car。此外，还描述了另外两种nkg2d car，它们结合了4-1bb(song et al.,2013,hum.gene ther.24:295-305)或cd28(lehner et al.,2012,plos one7:e31210)，以提供替代dap10的共刺激形式。所有这些car都能杀死t细胞介导的肿瘤细胞，同时产生细胞因子，而chang et al.描述的car也显示出短暂的体内抗肿瘤活性。

5、cxcr2受体的配体包括含有(glu-leu-arg)elr基序的半胱氨酸-x-半胱氨酸(cxc)家族的趋化因子，即cxcl1-3和cxcl5-8。肿瘤内的这些趋化因子不仅由恶性细胞产生，也由成纤维细胞和巨噬细胞等基质元件产生(thuwajit et al.,2018,med res rev.38:1235-54；thongchot et al,2021,int j oncol.58:14)。此外，肿瘤细胞可以培养基质细胞产生这些因子，从而促进疾病进展和对细胞毒性化疗的抗性(le naour,2020,j mol cellbiol.12:202-15)。

6、cxc家族中研究得最多的成员为cxcl8，也称为白细胞介素(il)-8。循环cxcl8的水平在某些癌症患者中升高，包括卵巢肿瘤(zhang,et al.,2019,oncol lett.17:2365-9)、恶性间皮瘤(judge,et al.2016,ann surg oncol.23:1496-500)、胰腺癌(hou,etal.2018，j clin med.7:502)、乳腺癌(milovanovic,et al.2019,cytokine 118:93-98；autenshlyus,et al.2021,35:20587384211034089)、食管癌(huang,et al.cancerbiomark.29:139-149)和头颈部癌(rezaei,et al.2019,39:727-739)。除了cxcl8，cxcr2配体cxcl1、cxcl3和cxcl5的高水平产生也在几种癌症中有所描述。

技术实现思路

1、在第一方面，本公开描述了一种免疫应答细胞，其包含nkg2d多肽、cxcr2多肽和融合多肽，所述融合多肽包含dnax活化10(dap10)多肽或其功能性变体和dnax活化12(dap12)多肽或其功能性变体。在一些实施方案中，所述nkg2d多肽、cxcr2多肽、dap10多肽和dap12多肽中的每一个都为哺乳动物多肽。在一些实施方案中，所述nkg2d多肽、cxcr2多肽、dap10多肽和dap12多肽中的每一个都为人多肽。在一些实施方案中，所述nkg2d多肽的序列与seqid no:14的序列具有至少约85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述nkg2d多肽为人nkg2d多肽的功能性变体，并且具有一个或多个突变，所述突变添加、删除或取代seq idno:14中的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述nkg2d多肽的功能性变体为具有seqid no:14的序列的多肽的截短形式。在一些实施方案中，所述功能性变体为嵌合nkg2d多肽。在一些实施方案中，所述功能性变体为人-鼠嵌合nkg2d多肽。

2、在一些实施方案中，所述dap10多肽为dap10的功能性变体，其包含与seq id no:1的dap10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述dap10多肽为dap10多肽的功能性变体，并且具有一个或多个点突变，所述点突变添加、删除或取代seq id no:1中的任意氨基酸。在一些实施方案中，所述dap10多肽为具有seq id no:1的氨基酸序列的多肽的截短形式的dap10多肽的功能性变体。在一些实施方案中，所述dap10多肽包含seqid no:1-8中的任一氨基酸序列或由它们组成。

3、在一些实施方案中，所述dap12多肽为dap12的功能性变体，其包含与seq id no:9的dap12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述dap12多肽为dap12的功能性变体，其具有一个或多个点突变，所述点突变添加、删除或取代seq id no:9中的任意氨基酸。在一些实施方案中，所述dap12多肽为具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的截短形式的dap12多肽的功能性变体。在一些实施方案中，所述dap12多肽包含seq idno:9-13中任一氨基酸序列或由它们组成。

4、在一些实施方案中，所述dap10多肽和所述dap12多肽通过连接子连接。在一些实施方案中，所述连接子包含seq id no:18-46中的任一氨基酸序列或由它们组成。

5、在一些实施方案中，所述融合多肽包含n末端序列。在一些实施方案中，所述融合多肽包含c末端序列。在一些实施方案中，所述n末端或c末端序列包含his标签、flag标签、arg标签、t7标签、strep标签、s标签、avitagtm、适体标签、myc标签、cd8α前导序列、4-1bb胞内结构域、v5标签或cd27胞内结构域中的一种或多种。在一些实施方案中，所述融合多肽包含seq id no:60-63中任一序列或由它们组成。

6、在一些实施方案中，所述cxcr2多肽具有与seq id no:87具有至少约85％序列同一性的序列。在具体的实施方案中，所述cxcr2多肽具有seq id no:87的序列。

7、在一些实施方案中，本公开的免疫应答细胞为t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞为αβt细胞、γδt细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞或它们的任意组合。

8、在第二方面，本公开描述了一种包含嵌合nkg2d多肽和cxcr2多肽的免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述嵌合nkg2d多肽包含人nkg2d胞外结构域或其变体和鼠nkg2d跨膜结构域或其变体。在具体的实施方案中，所述人nkg2d胞外结构域具有seq id no:95-97中的任一所示的序列。在一些实施方案中，所述嵌合nkg2d多肽包含人nkg2d胞外结构域的变体，所述变体与seq id no:95-97中的任一序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述鼠nkg2d跨膜结构域具有seq id no:98-101中的任一所示的序列。在一些实施方案中，所述嵌合nkg2d多肽包含鼠nkg2d胞外结构域的变体，所述变体与seq id no:98-101中的任一序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞进一步包含至少一种dap12多肽或其变体。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞进一步包含至少一种dap10多肽或其变体。在一个优选的实施方案中，所述细胞包含与seq id no:102具有至少90％序列同一性的多肽。

9、本公开还描述了一种编码nkg2d多肽、cxcr2多肽和任选的dnax活化(dap10)多肽、dnax活化(dap12)多肽和/或融合多肽的核酸分子。

10、本公开还描述了一种制备免疫应答细胞的方法，包括以下步骤：(i)用本公开所述的核酸分子或载体转导t细胞或自然杀伤(nk)细胞，和(ii)培养t细胞或自然杀伤(nk)细胞，使得转导的细胞表达nkg2d多肽、cxcr2多肽和任选的dap10/dap12融合多肽。在优选的实施方案中，所述nkg2d多肽与细胞膜结合。

11、本公开还描述了一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本公开所述的免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞由受试者自体的t细胞或自然杀伤(nk)细胞制备。在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤癌症。在一些实施方案中，所述实体瘤癌症为肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、食道癌、小肠癌或它们的任意组合。