用NK细胞和HER2靶向抗体治疗癌症的制作方法

背景技术：

1、靶向治疗，包括抗体治疗，已经彻底改变了癌症治疗。抗体治疗诱导细胞毒性的一种作用机制是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity,adcc)。许多癌症患者无法产生强大的adcc反应。adcc反应的降低可能会使任何指示的单克隆抗体疗法对这些患者的疗效显著降低，这可能会阻碍这些患者的反应或导致复发。因此，adcc反应降低可能会对其临床结果产生负面影响。

2、尽管最近发现并开发了几种抗癌药物，但由于包括her2+癌症在内的许多类型癌症的预后不良，仍需改进的方法和治疗药物。

3、本发明解决了这些和现有技术中的其他不足。

技术实现思路

0、概述

1、nk细胞是一种免疫细胞，可以通过细胞表面的复杂受体阵列以及抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,adcc)与肿瘤细胞结合。为了启动adcc，nk细胞通过其表面的cd16受体与抗体结合。nk细胞可能比其他免疫细胞具有优势，例如在car-t细胞治疗和其他细胞治疗中使用的t细胞。在一个示例性优点中，nk细胞可以用作同种异体疗法，这意味着来自同一供体的nk细胞可以安全地用于一个或多个患者，而不需要hla匹配、基因编辑或其他遗传操作。具有抗肿瘤活性的同种异体nk细胞可以安全地给予患者，而没有许多与t细胞治疗相关的风险，如严重细胞因子释放综合征(crs)、神经毒性或移植物抗宿主病(gvhd)。

2、同种异体nk细胞可以为癌症患者提供重要的治疗选择。在一个示例性优点中，nk细胞被良好耐受，没有其他基于细胞治疗相关的移植物抗宿主病、神经毒性或细胞因子释放综合征的证据。在另一个示例性优点中，nk细胞不需要先前的抗原暴露或用于鉴定和裂解肿瘤细胞的特异性抗原的表达。在另一个示例性优点中，nk细胞具有固有能力，在先天免疫和产生多克隆适应性免疫反应之间架起桥梁，从而产生长期抗癌免疫记忆。所有这些特征都有助于nk细胞作为癌症治疗选择的潜力。

3、例如，nk细胞可以募集和激活免疫系统的其他成分。活化的nk细胞分泌细胞因子和趋化因子，如干扰素γ；肿瘤坏死因子α；以及巨噬细胞炎症蛋白1(mip1)，其向肿瘤发出信号并募集t细胞。通过直接杀伤肿瘤细胞，nk细胞也暴露出肿瘤抗原，用于适应性免疫系统识别。

4、此外，通过利用不同的脐带血库作为nk细胞的来源，可以选择具有增强临床活性的优选特征的脐带(例如，高亲和力cd16和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)b单倍型)。

5、如本发明所述，施用同种异体nk细胞可以增强患者的adcc反应，例如，在接受单克隆抗体治疗时。在一个示例性优点中，本发明所述的同种异体nk细胞甚至可以用于对抗体产生完全或部分耐药性的患者。例如，her2通路通常促进细胞生长和分裂。在一些癌症中，her2表达上调，从而促进持续增殖和肿瘤形成。her2通路启动map激酶和pi3激酶/akt通路。曲妥珠单抗可以阻断her2的二聚化，从而抑制her2的激活和下游信号传导。然而，即使在没有her2信号传导的情况下，这些途径中的突变也可以引起组成性激活，从而提供了曲妥珠单抗耐药性的机制。在一个示例性优点中，本文所述的nk细胞仍然可以与一些曲妥珠单抗耐药性癌症组合使用，因为它们介导adcc，所述adcc可以独立于her2信号传导杀死肿瘤细胞。在这种情况下，nk细胞仍然可以与细胞表面结合her2的曲妥珠单抗抗体结合，并介导细胞杀伤。

6、本文特别提供了治疗患有her2+癌症的患者的方法。

7、本文提供了治疗患有her2+癌症的患者的方法，包括给予自然杀伤细胞(nk细胞)群和靶向人her2的抗体，其中所述nk细胞对患者是同种异体的，是kir-b单倍型的，并且对于cd16 158v多态性是纯合的。

8、在一些实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌和卵巢癌。

9、在一些实施方式中，所述癌症为乳腺癌。

10、在一些实施方式中，所述癌症为胃癌。

11、在一些实施方式中，所述癌症为卵巢癌。

12、在一些实施方式中，所述患者在用抗her2抗体治疗后复发。

13、在一些实施方式中，所述患者在用同源干细胞移植或嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)治疗后经历了疾病进展。

14、在一些实施方式中，所述患者被施用1×108到1×1010nk细胞。

15、在一些实施方式中，所述患者被施用1×109到8×109nk细胞。

16、在一些实施方式中，所述患者被施用4×108、1×109、4×109、或8×109nk细胞。

17、在一些实施方式中，所述抗体是曲妥珠单抗。

18、在一些实施方式中，所述患者在治疗前接受淋巴消耗化疗。

19、在一些实施方式中，所述淋巴消耗化疗是非清髓性化疗。

20、在一些实施方式中，所述淋巴消耗化疗包括用环磷酰胺和氟达拉滨中的至少一种进行治疗。

21、在一些实施方式中，所述淋巴消耗性化疗包括用环磷酰胺和氟达拉滨治疗。

22、在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为100-500mg/m2/天。

23、在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为250mg/m2/天。

24、在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为500mg/m2/天。

25、在一些实施方式中，所述氟达拉滨的施用量为10-50mg/m2/天。

26、在一些实施方式中，所述氟达拉滨的施用量为30mg/m2/天。

27、在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用il-2。

28、在一些实施方式中，所述患者被施用1×106iu/m2的il-2。

29、在一些实施方式中，所述患者被施用6000000iu的il-2。

30、在一些实施方式中，施用il-2在施用nk细胞的1-4小时内。

31、在一些实施方式中，每周施用nk细胞和靶向人her2的抗体。

32、在一些实施方式中，所述每周施用nk细胞和靶向人her2的抗体4-8周。

33、在一些实施方式中，所述nk细胞的使用每周一次和所述靶向人her2的抗体每隔一周一次。

34、在一些实施方式中，所述nk细胞未经基因修饰。

35、在一些实施方式中，至少70％的nk细胞是cd56+和cd163+。

36、在一些实施方式中，至少80％的nk细胞是cd56+和cd3-。

37、在一些实施方式中，1％或更少的nk细胞是cd3+，1％或更少的nk细胞为cd19+，1％或更少的nk细胞则为cd14+。

38、在一些实施方式中，所述每次施用nk细胞为施用1×109到5×109nk细胞.

39、在一些实施方式中，所述患者在接受第一剂nk细胞之前先接受一定剂量的靶向her2抗体。

40、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞是扩增的脐带血自然杀伤细胞。

41、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的cd16+细胞。

42、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的nkg2d+细胞。

43、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的nkp46+细胞。

44、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的nkp30+细胞。

45、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的dnam-1+细胞。

46、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的nkp44+细胞。

47、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的cd3+细胞。

48、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的cd14+细胞。

49、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的cd19+细胞。

50、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的cd38+细胞。

51、在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞不包括cd16转基因。

52、在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞不表达外源性cd16蛋白。

53、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞不是基因工程化的。

54、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞来源于同一脐带血供体。

55、在一些实施方式中，所述nk细胞群包括至少1亿个扩增的自然杀伤细胞，例如2亿、2.5亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、7.5亿、8亿、9亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、100亿、150亿、200亿、250亿，500亿、750亿、800亿、90亿、1000亿、2000亿、2500亿、3000亿、4000亿、5000亿、6000亿、7000亿、8000亿、9000亿、1万亿、2万亿、3万亿、4万亿、5万亿、6万亿、7万亿、8万亿、9万亿或10万亿扩增的自然杀伤细胞。

56、在一些实施方式中，所述nk细胞群通过包括以下步骤的方法：(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；(b)耗竭种子细胞的cd3+细胞；(c)通过将所述耗竭的种子细胞与第一多个的hut78细胞培养来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个的hut78细胞经改造以表达膜结合的il-21、突变的tnfα和4-1bbl基因以产生扩增的自然杀伤细胞，从而产生扩增的自然杀伤细胞群。

57、在一些实施方式中，所述nk细胞群体通过包括以下步骤的方法产生：(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；(b)耗竭种子细胞的cd3+细胞；(c)通过用第一多个hut78细胞培养耗竭的种子细胞来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个hut78细胞被改造以表达膜结合的il-21、突变的tnfα和4-1bbl基因，以产生扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群；和(d)通过与第二多个hut78细胞培养来扩增已扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群，所述第二多个hut78细胞经改造以表达膜结合的il-21、突变的tnfα和4-1bbl基因，以产生扩增的自然杀伤细胞；从而产生扩增的自然杀伤细胞群。

58、在一些实施方式中，所述nk细胞群体通过这样的方法产生，所述方法在步骤(c)之后进一步包括，(i)将扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群冷冻在多个容器中；和(ii)解冻包含扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群的等分试样的容器，其中在步骤(d)中扩增已扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群，所述步骤(d)包括扩增已扩增的天然杀伤细胞的所述主细胞库群的等分试样。

59、在一些实施方式中，所述脐带血来自具有kir-b单倍型和cd16 158v多态性纯合的供体。

60、在一些实施方式中，所述nk细胞群是通过包括以下步骤的方法产生，该方法包括将来自脐带血的自然杀伤细胞扩增至少10000倍，例如15000倍、20000倍、25000倍、30000倍、35000倍、40000倍、45000倍、50000倍、55000倍、60000倍、65000倍或70000倍。

61、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群在扩增后不富集或分选。

62、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达cd16的nk细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

63、在一些实施方式中，所述在扩增的自然杀伤细胞群中表达nkg2d的nk细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

64、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达nkp30的nk细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

65、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达nkp44的nk细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

66、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达nkp46的nk细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

67、在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达dnam-1的nk细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。

68、除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和实例是说明性的，而并非旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以引用的方式全部并入本文。在发生冲突的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。

69、根据以下详细描述和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。

70、参引合并

71、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指示以引用的形式并入本文的程度相同。