病毒减毒

本公开涉及副粘病毒，特别是减毒的禽腮腺炎病毒属(副、正和间)、突变和遗传修饰形式，以及包含减毒的禽腮腺炎病毒的疫苗制剂及其用途/使用方法。

背景技术：

1、禽正腮腺炎病毒属(avian orthoavulaviruses，aoav；以前被称为禽副粘病毒属(paramyxoviruses))感染世界上几乎所有的鸟类，并导致家禽业中的大量死亡和经济损失。疾病的严重程度从无临床症状(无症状)感染到高致病性疾病不等，这取决于宿主和病毒来源的多种因素。这些在各种各样的野生鸟类中被发现，尤其是那些与水有关的鸟类。

2、根据鸡的疾病严重程度，aoav分为以下病原类型(致病型)：(1)弱毒型(低致病性或无致病性)：引起轻微疾病或无症状呼吸道感染的aoav毒株。(2)中等毒型(mesogenic)：aoav毒株显示出低死亡率，但是在一些家禽中出现急性呼吸和神经症状。(3)强毒型(高致病性)aoav毒株，在家禽中引起高死亡率(高达100％)和多器官损伤。强毒型aoav毒株进一步分为：(a)亲内脏的强毒型aoav：这些aoav毒株靶向消化系统器官，引起损伤和高死亡率，(b)亲神经的强毒型aoav：主要引起呼吸和神经症状以及高死亡率的aoav毒株。

3、根据最新的命名法，禽间、副和正腮腺炎病毒属属于副粘病毒科(paramyxoviridae)的禽腮腺炎病毒亚科(avulavirinae)，是有包膜的单链病毒，携带大约15186个核苷酸的反义rna(ss-ve)(krishnamurthy&samal,1998:phillips等人1998；de leeuw&peeters,1999)。国际病毒分类委员会(ictv)描述了超过20种的禽正、间和副腮腺炎病毒。在所有这些物种中，aoav血清型1(aoav-1是最重要的病毒，因为它们在世界各地的市售家禽中具有致病能力)。aoav-1毒株进一步分为i类和ii类，每一类都含有确定的基因型和亚基因型。导致疾病的无毒基因型和有毒基因型被分类为ii类，而i类只包含无毒病毒，通常在水禽和滨鸟中发现。

4、先前已经报道了用于从克隆的cdna产生感染性病毒颗粒的反向遗传技术(conzelmann，1996)，并且已经提出了几种用于aoav的反向遗传技术(等人,1999；peeters等人,1999)，其内容通过引用的方式并入本文。然而，所有可用的基于aoav的活减毒疫苗和重组疫苗都是基于无毒的aoav，即lasota毒株。由于强毒型毒株的病原性增强，它们不能用作活减毒疫苗，这种疫苗的使用需要减毒。通常，病毒的减毒是通过以下方式实现的：(i)病原性病毒在细胞培养物、卵或体内的连续传代。随机获得的突变可以使病原性病毒变成非病原性的，然后用作候选疫苗或疫苗载体；(ii)病毒的有毒因子的修饰允许减毒；(iii)切割位点或病毒基因的修饰以限制宿主嗜性。因此，目前用作疫苗载体的aoav毒株是基于弱毒型毒株或减毒毒株(通过改变f蛋白的f0切割位点，将强毒型毒株变为弱毒型毒株)。在后一种情况下，小的修饰可能回复成强毒型，并可能造成毒性增强的风险；或(iv)修饰多个基因(hn、f和p)的遗传编码，以将本质上低病原性的中等毒型毒株转化为减毒的毒株(wang等人，2019)。然而，中等毒型毒株对多个器官的嗜性有限，因此可能不足以诱导全身性免疫反应。因此，需要产生新的疫苗载体，其是安全、有效、免疫原性的并且可以是多用途的。

5、例如新城疫病毒(ndv)是一种典型的aoav，并且ndv的减毒毒株已经用于癌症治疗。

技术实现思路

1、在第一个教导中，提供了一种减毒的强毒型禽正腮腺炎病毒(aoav)，其中与衍生该减毒aoav的野生型或亲本强毒型aoav相比，该减毒aoav的aoav基因组的每个hn和f基因都包含多个沉默突变、基本上由多个沉默突变组成或由多个沉默突变组成。

2、技术熟练的读者理解沉默突变是基因组中当翻译时不改变hn和f基因的氨基酸序列的突变。通常，通过使用密码子去优化来实现。每个hn和f基因都包括多个沉默突变。通常，每个hn和f基因包括至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或更多突变的密码子。通常引入大量的沉默突变，以最小化突变的减毒毒株回复到强毒型毒株的可能性。通常，与衍生减毒aoav的野生型或亲本毒株相比，hn和/或f基因中相同密码子的比例可能小于95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％或50％。例如，只有1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％的野生型或亲本毒株密码子在减毒毒株中保持未突变。理想地，突变发生在整个基因序列上，包括每个hn和f基因的n-末端、中间区域和c-末端。

3、目前的教导通常归因于使用“密码子去优化”将强毒型aoav病毒减毒为无毒病毒，密码子去优化是指病毒蛋白同义突变，以使用aoav遗传骨架中的稀有密码子，这可能(a)导致病毒基因表达的减少(b)在不改变病毒蛋白质序列的情况下减毒强毒型aoav病毒，(c)导致差异识别和转录的病毒基因组结构的变化(d)由于引入的rna结构而增强先天免疫，和/或(d)由于高比例的基因突变而产生非回复突变型病毒。“稀有密码子”是指野生型或亲本密码子中发现的密码子被替换为不太有利的同义密码子，如特定的aoav所使用的。技术熟练的读者很清楚编码各种氨基酸的密码子，并且通过观察特定的aoav基因组，能够容易地确定哪些密码子比其他密码子更有利。

4、传统的密码子去优化策略仅依赖于使用最少使用的密码子。为了在开发活减毒疫苗中建立和验证新的次优密码子使用策略，在一个实施方案中，在aoav基因组的密码子去优化中应用了一套全包含的方法，统称为“智能密码子使用算法”。

5、具体而言，从grch38.p13的智人(人类)基因组组装构建，概述了密码子使用数据库，并整合了以下原则：

6、1.利用一个氨基酸由一个以上的核苷酸三联体(此处指同义密码子)编码以及密码子使用频率可变的事实，在不改变氨基酸序列的情况下，考虑使用频率低于正常人类基因的密码子。这种改变降低了病毒密码子使用对宿主trna丰度的适应性，从而降低了病毒基因翻译和适应度。

7、2.基于密码子使用数据库，很明显不同的密码子对具有不同的频率。由于翻译核糖体rna中密码子对偏好性的预测相容性，aoav基因组中密码子对偏好性的整合影响了病毒基因的翻译。

8、3.密码子去优化和密码子对偏好性的整合允许考虑aoav基因组中的cpg和upa含量以刺激免疫系统。这刺激了宿主先天免疫，这对宿主内病毒复制和适应度有负面影响。

9、4.在氨基酸中引入高水平的同义密码子，其代表高密码子冗余度(亮氨酸和丝氨酸)，允许aoav基因组中较小程度的进化潜力，产生较少合适的病毒。

10、5.密码子去优化不利地影响rna二级结构，并且可以影响rna的折叠，这限制了aoav的复制适应度。在密码子去优化过程中，折叠自由能被认为可以保证病毒的拯救潜力(rescuing potential)，同时保持病毒通常的氨基酸序列并改变密码子对偏好性。

11、6.在密码子去优化过程中，整合了对病毒复制动力学不太有利的特征，包括rna发夹、大的二级结构和aoav基因组的茎环。

12、在一个实施方案中，采用至少3个上述原理的组合。例如，1和2可以与3-6或4-6中的至少一个、两个或三个组合使用。

13、使用智能密码子使用算法(scua)设计了一种算法来整合3721个可能密码子对中每个密码子优化策略：

14、

15、此处，

16、cfot：测试序列中密码子出现的频率

17、cfor：参考序列中密码子出现的频率

18、not：测试序列中密码子出现的次数

19、nor：参考序列中密码子出现的次数

20、vgf：病毒基因组特征。

21、本文所用的术语“减毒aoav”应理解为是指一种aoav，与衍生它的强毒型野生型或亲本病毒相比，它具有降低的毒性，但它仍然是存活的(或“活的”)。减毒作用发生在强毒型aoav中，从而变得无害或毒性降低。毒性可以通过本领域已知的技术来确定，例如感染宿主的能力；杀死一个宿主所需的时间；和/或脑内病原性指数。强毒型毒株不同于弱毒型毒株和中等毒型毒株。强毒型毒株最常在鸟类(如鸡)中引起严重疾病，导致死亡；体征主要是呼吸的和/或神经的。最初的临床症状各不相同，但包括：嗜睡、食欲不振、羽毛竖起、水肿和结膜注射。随着疾病的发展，鸟类可能会出现：绿色或白色水样腹泻、呼吸困难以及头部和颈部炎症，通常伴有紫绀变色。根据公认的who动物健康教学标准(oie陆地手册2000，附录3)，在蛋中平均死亡时间(mdt)检测中，可认为一种强毒型禽正腮腺炎病毒的平均死亡时间少于60小时。或者，在一日龄小鸡的脑内致病指数(icpi)检测中，强毒型病毒的icpi高于1.4。

22、除了本文所述的减毒aoav，本教导还提供了修饰的aoav基因组，其能够产生所述减毒aoav。本文所述的修饰的aoav基因组也可以被认为是一种载体，用于递送一种或多种对特定aoav来说是外源性的物质。因此，例如，可以进一步修饰修饰的aoav基因组，以表达来自另一病毒的一种或多种蛋白质或其抗原片段。以这种方式，在经修饰的aoav基因组表达后，如此产生的减毒aoav也表达来自不同病毒的所述一种或多种蛋白质或抗原片段，使得宿主可以诱导针对aoav以及来自不同病毒的所述一种或多种蛋白质或抗原片段的免疫反应。

23、根据本文的教导，已经观察到用同义的非优选(去优化)密码子替换aoav中的一个或多个天然(或原生)密码子以及病毒rna中的结构变化可以降低aoav的毒性，从而使aoav减毒。非优选的同义密码子编码与天然密码子相同的氨基酸，但是已经发现其降低了病原体的毒性。在aoav的hn和f基因中引入多个去优化的密码子可以限制aoav突变或利用重组变得有毒性的能力。公开的组合物和方法可用于减毒疫苗，所述疫苗具有降低的毒性，或基本上没有致病能力，并任选地增强了遗传稳定性。

24、aoav的基因组由六个线性基因组成，这些基因由病毒聚合酶通过基因组3’端的启动子区域使用连续的停止-开始机制转录。除p基因外，所有转录的基因编码一种蛋白质，顺序为核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶(hn)和大聚合酶蛋白(l)。p基因通过称为rna编辑的机制翻译成另外两种非结构蛋白(v和w)(steward等人,1993)。图1a显示了aoav的基因组结构示意图。aoav的每个基因两侧是在基因的3’端的称为基因起始(gs)信号的短转录信号，随后是在基因5’端的开放阅读框(orf)和称为基因终止(ge)的转录终止信号。ge也参与转录mrna中多聚腺苷酸尾的合成。然后所有的基因被一段称为基因间序列(igs)的序列分开。

25、np、p和l蛋白是复制机制的主要成分，其中np蛋白围绕基因组，p和l形成用于病毒转录和复制的功能性核衣壳。aoav的表面由两种糖蛋白修饰，称为hn和f蛋白。hn允许病毒与宿主结合，f蛋白允许病毒与宿主细胞融合。在生物化学上，f蛋白是一种i型膜糖蛋白，形成三聚体结构(三聚体(trimer))。f蛋白被制成非活性前体形式(f0)，并在前体f0分子穿过高尔基膜时被分成二硫化物连接的亚基f1和f2。为了使aoav感染细胞，必须将前体糖蛋白f0切割成f1和f2。这种翻译后切割被宿主细胞的蛋白酶干预。如果不发生切割，则产生非感染性病毒体，并且不能进行病毒复制。强毒型aoav病毒的f0蛋白可以被各种蛋白酶切割，因此这些蛋白酶会导致致命的全身性感染，但是弱毒型病毒的f0蛋白例如被限制在呼吸器官或肠道中。hn蛋白属于ii型膜糖蛋白，并在病毒包膜表面形成四聚体，以穿透细胞膜。hn蛋白通过与糖复合物的唾液酸结合，使病毒体位于宿主细胞表面。hn蛋白分为三个区域：跨膜结构域、柄结构域和球状结构域。抗原受体的结合位点和神经氨酸酶的活性位点都位于球状结构域上。hn和f蛋白都是免疫反应的主要靶标，大多数中和表位都位于这两种表面糖蛋白内。

26、除了本文所述的与hn和f基因相关的密码子改变，任选地由aoav基因组编码的一种或多种其他蛋白质，可以包括一个或多个沉默突变。在一个实施方案中，特别地引入的密码子改变(以区别于天然存在的密码子改变)仅被引入aoav基因组的hn和f基因中，例如一个强毒型的aoav基因组。

27、除了使用沉默突变，例如通过本文所述的密码子去优化方法，所述aoav还可以将突变整合到氨基酸序列中，所述氨基酸序列或者来自亲本基因序列，已知存在于基因或基因编码的蛋白质中，或者在具有去优化基因的病毒的生命周期中在去优化基因中重新出现。在一些实施方案中，突变可以是编码突变，在给定蛋白质中产生不同的氨基酸残基。在其他实施方案中，突变可以发生在具有未修饰的或亲本序列的基因中。

28、本文报道的活减毒aoav是通过在病毒基因组中引入偏离天然密码子的核苷酸变化而产生的，所述天然密码子在野生型或亲本毒株中发现，并且不能被宿主细胞机制翻译。引入的沉默突变不会改变最初由野生型或亲本病毒编码的蛋白质序列。这允许产生与野生型/亲本病毒株相同的病毒遗传背景和抗原特征，但改变了减毒病毒的毒性。

29、本文所述的突变，包括沉默突变，可以使用技术熟练的读者熟知的重组技术引入到aoav的基因组中，如sambrook&russell中所述(molecular cloning:a laboratorymanual,volume 2,(2001)cshl laboratory press)，或者，突变的hn和f基因序列可以通过体外基因合成方法重新整合。许多公司提供这种服务，例如包括thermo fisherscientific、integrated dna科技公司、eurofins和genescript。

30、根据本公开内容的重组aoav可以通过技术熟练的读者已知的反向遗传技术获得，其中重组aoav通过使用编码aoav的6种蛋白质中每种的6种单独的基因构建体获得。例如，在ayllon等人(2013)中描述了这种反向遗传技术，并在下文中进一步描述。

31、本发明进一步提供了重组减毒aoav，其适于用作人或动物(如鸟类)的疫苗，以及用作溶瘤和基因递送平台。因此，在进一步的教导中，提供了包含减毒aoav或aoav基因组的疫苗制剂，如本文所述。疫苗可以任选地包括一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或本领域已知的合适佐剂。疫苗制剂可以包含一种或多种减毒aoav毒株。此外，疫苗制剂可包括设计用于保护宿主免受其他病毒侵害的减毒病毒。在疫苗开发领域，提供这种多价或多抗原疫苗是典型的。

32、本文所用术语“野生型”是指病毒的表型，其在易感动物和人类宿主中具有复制能力，并可导致临床疾病。具有突变但复制适应度没有实质性降低的衍生重组病毒具有野生型表型。另一方面，在任何评估标准中表现出降低的病毒复制的病毒衍生物可以被认为是受限的。通常，病毒在许可性宿主中的有限复制与减毒和较低的疾病严重程度相关。因此，与野生型病毒相比，易感宿主中的减毒病毒感染将降低疾病的严重程度。

33、“亲本”病毒是指用于衍生本公开的重组aoav的病毒。即实施本文所述突变之前的病毒。

34、术语基因序列、基因和基因组指编码蛋白质、多蛋白或这些多蛋白的开放阅读框的病毒序列。

35、本文描述了aoav，其由携带沉默核苷酸的多个密码子构成，并被引入hn和f基因的多个位点。由于hn和f基因中的无数突变，减毒重组病毒表现出稳定性，适合作为抗aoav感染的活疫苗候选物。

36、所述的去优化的aoav核苷酸序列可以与一种或多种去优化的病毒蛋白联合使用。在一些实施方案中，所呈现的突变病毒包括一个密码子去优化的基因或一个以上的基因。因此，可以通过单独或组合使用本文提供的多个基因来产生这种重组病毒。

37、本文所述的密码子去优化的突变病毒可以通过整合来自亲本基因序列的突变或通过已知由于病毒在体外、卵内或体内的连续复制而存在的突变来产生。

38、从克隆的cdna工程化感染性aoav的能力允许整合所需的改变，包括但不限于已知的突变以减弱病毒，包括基因缺失或修饰。这些整合的变化可能代表也可能不代表其他病毒毒株的生物学特征。本文举例说明了通过合成方法产生的感染性aoav。感染性aoav是由编码aoav病毒基因组的cdna与启动病毒转录、复制和包装所必需的病毒蛋白的细胞内共表达产生的。本文公开了生产重组aoav的方法以及在动物、哺乳动物或人中诱导免疫反应的方法。本公开允许在重组aoav疫苗候选毒株中整合生物学驱动的突变以及其他突变。在本aoav中去优化的突变可以可逆地用于疫苗毒株以恢复病原性。

39、本文公开的减毒aoav及其相关基因组可根据复制效力、卵内减毒、免疫原性、保护性和/或表型稳定性选择作为疫苗候选物。候选病毒的稳定性对于在免疫功能正常的宿主中展示减毒表型和复制非常重要。与野生型或亲本毒株相比，本文所述的减毒病毒通常表现出改善的稳定性、安全性和/或免疫诱导。

40、为了繁殖aoav病毒用于疫苗生产和其他用途，可以使用细胞系和鸡胚。aoav在一系列细胞系和动物模型中生长。通过在vero细胞和/或鸡胚中复制aoav突变病毒，可以获得高水平的复制和病毒产量。具有多重感染负载的病毒可以在几种温度下接种，以产生生产病毒的最佳接种物和时间。

41、可以在几种体外、卵内和体内模型中检测和评估本文中减毒的aoav，以证明减毒、表型逆转和疫苗使用的免疫原性。同样可以在动物模型中检测热不稳定性。

42、本公开进一步教导了用于动物、哺乳动物或人类宿主中的疫苗、溶瘤、基因递送和免疫诱导的分离的、纯化的和感染性aoav。

43、本文教导提供了重组aoav，其可直接用于动物、哺乳动物或人类宿主中的疫苗、溶瘤、基因递送和免疫诱导。

44、当通过例如注射、气溶胶或鼻内途径将aoav接种到动物体内时，预计会产生针对aoav的hn和f蛋白(这是最具免疫原性的抗原)的诱导免疫。这种疫苗接种过程旨在提供对感染性试验毒株的保护和抵抗。

45、施用减毒aoav、aoav基因组和/或疫苗的宿主可以是任何易感动物、哺乳动物或人类。合适的宿主包括鸟类、人类、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、啮齿类动物(小鼠或棉鼠等)、马、猪和兔类动物。在一个实施方案中，宿主是鸟，例如养殖的鸟，包括例如鸡、火鸡、鸭和鹅。适当地，本文的教导提供了产生用于各种兽医学和人类应用的疫苗的方法。

46、可以将本文所述的减毒aoav、aoav基因组或疫苗向易感宿主施用，所述易感宿主处于或可能处于感染风险中。单个有效剂量，或者为了增强免疫反应，可以递送多个剂量。

47、疫苗的精确量和免疫诱导的时间取决于多种因素，包括宿主、健康和环境。

48、本文所述的减毒aoav、aoav基因组或疫苗预期会引发保护作用，该保护作用是通过呼吸系统中的免疫诱导来介导的，并且可以保护宿主免于肺炎和/或其他呼吸疾病。因此，在一个实施方案中，该教导提供了理想的鼻内免疫，例如通过气溶胶、液体或干粉施用。

49、aoav密码子去优化突变体的减毒水平可以通过定量接种部位存在的病毒滴度或通过系统筛选来确定。

50、目前的教导进一步针对表达一种或多种免疫基因的重组aoav的产生及其作为佐剂或免疫刺激剂的用途。

51、目前的教导进一步涉及重组aoav的产生，以表达基因并用作溶瘤剂或抗体、纳米抗体、合成药剂等的载体。

52、本发明还指导了热稳定重组疫苗的产生和用于递送基因的切割位点突变的等同载体的产生。

53、在本教导的范围内，aoav基因组能够作为基因载体，从而能够携带一种或多种外源基因，所述外源基因来自例如一种或多种病毒，例如流感病毒、sars-cov-2、冠状病毒、人呼吸道合胞病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、人副流感3型病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、拉沙热病毒、单纯疱疹病毒和黄热病病毒。

54、外源基因也可以设计成靶向其它禽类疾病和/或感染。因此，在一个教导中，外源基因可以编码从以下获得的异源蛋白：例如禽流感和人流感(a)(血凝素(h5和h7)和神经氨酸酶)、禽白血病病毒(alv)(包膜蛋白(gp85))、鸡贫血病毒(cav)(vp1+vp2)、马立克氏病病毒(mdv)(糖蛋白b(gb)、gh)、传染性喉气管炎病毒(ilt)(gb、gh、gd)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)(vp2和vp3)、火鸡鼻气管炎病毒(trt)(融合(f)蛋白)、禽副粘病毒-2、-3、-6(pmv)(f蛋白、血凝素神经氨酸酶(hn)、或其他)、传染性支气管炎病毒(ibv)(膜粒蛋白、核蛋白)、呼肠孤病毒(sigma蛋白)、腺病毒、肺炎病毒、肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)、大肠杆菌、禽波氏杆菌(bordetella avium，前粪产碱杆菌(alcaligenes faecalis))、副鸡嗜血杆菌(haemphilus paragallinarum)、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)、鼻气管鸟杆菌(ornithobacterium rhinotracheale)、鸭疫里默氏杆菌(riemerella，前巴氏杆菌(pasteurella))、支原体(鸡支原体(m.gallisepticum)、滑膜支原体(m synoviae)、mereagridis支原体、iowae支原体)或曲霉(黄曲霉菌(a.flavus)、烟曲霉菌(a.fumigatus))。

55、根据已知方法，本文所述的减毒aoav、aoav基因组可作为疫苗配制和施用，以在动物(例如哺乳动物)中诱导免疫反应。用于确定这种减毒疫苗是否保持了与野生型或由其衍生的亲本毒株相似的抗原性的方法是本领域公知的。

56、适用于接种或肠胃外、鼻内或口服施用的本发明疫苗组合物包含所述减毒aoav或aoav基因组，任选地进一步包含无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。如本领域已知的，组合物可以进一步包含辅助剂或赋形剂。这种组合物通常可以以单独剂量(单位剂量)的形式存在。

57、肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和/或乳液，其可含有本领域已知的辅助剂或赋形剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。载体或封闭敷料可用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。用于口服施用的液体剂型通常可以包含含有该液体剂型的脂质体溶液。用于悬浮脂质体的合适形式包括乳液、悬浮液、溶液、糖浆和酏剂，其含有本领域常用的惰性稀释剂，例如纯净水。除了惰性稀释剂之外，这种组合物还可以包括佐剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂，或者甜味剂、调味剂或芳香剂。

58、当本发明的组合物用于向个体施用时，它可以进一步包含盐、缓冲剂、佐剂或其他物质，这些物质对于提高组合物的功效是理想的。对于疫苗来说，可以使用能够增强特定免疫反应的佐剂。通常，佐剂和组合物在呈递至免疫系统之前混合，或分别呈递，但进入被免疫生物体的相同部位。适用于疫苗组合物的材料的实例描述于例如美国的cdc(参见https://www.cdc.gov/vaccinesafety/concerns/adjuvants.html)。

59、根据本发明的疫苗组合物可以进一步或另外包含至少一种化疗化合物，例如用于基因治疗的免疫抑制剂、抗炎剂或免疫增强剂，和用于疫苗的化疗药物包括但不限于丙种球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类化合物、甲吲噻腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸盐、膦酰乙酸、阿昔洛韦、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。

60、该组合物还可以含有可变但少量的无内毒素甲醛和防腐剂，已经发现它们是安全的，并且不会对施用该组合物的生物体产生不良作用。

61、施用减毒的aoav、aoav基因组或本文所述的疫苗组合物(或其得到的抗血清)可用于“预防性”或“治疗性”目的。当预防性提供时，在病原体感染的任何症状变得明显之前提供组合物。组合物的预防性施用用于预防或减轻任何随后的感染。当预防性提供时，在疾病的任何症状变得明显之前提供所述基因治疗组合物。组合物的预防性施用用于预防或减轻一种或多种与疾病相关的症状。

62、当治疗性提供时，在检测到实际感染的症状时提供组合物。组合物的治疗性施用用于减轻任何实际感染。当治疗性提供时，在检测到疾病的症状或适应症时提供基因治疗组合物。组合物的治疗性施用用于减轻该疾病的症状或适应症。

63、如果本发明的组合物的存在导致接受者患者的生理学发生可检测的变化，例如，增强针对至少一种aoav毒株的至少一种初级或次级体液或细胞免疫反应，则该组合物具有生理学意义。只有通过呼吸道途径施用的活疫苗才能刺激所有粘膜表面和血清中的抗体。因此，在一个教导中，本公开提供了一种活疫苗，其能够将病毒抗原呈递至上呼吸道以诱导局部和全身免疫。小液滴渗入下呼吸道，从而主要地激发体液免疫反应，而粗液滴刺激上呼吸道的局部免疫。因此，具有大范围液滴尺寸的气溶胶产生最佳的整体局部和体液免疫。

64、所提供的“保护”不必是绝对的，即，如果与对照群体或一组患者相比有统计学上的显著改善，则不需要完全预防或根除aoav感染。保护可能仅限于减轻流感病毒感染症状的严重程度或发作速度。

65、根据本公开的减毒aoav、aoav基因组或疫苗组合物可以通过实现预期目的的任何方式施用。例如，这种组合物的施用可以通过各种肠胃外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服或透皮途径。肠胃外施用可以通过推注或随时间的逐渐灌注来进行。

66、用于预防、抑制或治疗aoav相关病理的典型方案包括施用有效量的本文所述的减毒aoav、aoav基因组或疫苗组合物，作为单一治疗施用，或作为增强或加强剂量重复施用，施用时段长达一周至约24个月，或其中的任何范围或值。

67、根据本公开，组合物的“有效量”是足以达到所需生物学效果的量。可以理解的是，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。下面提供的有效封闭范围不是为了限制本发明，而是代表示例性的剂量范围。然而，如本领域技术人员所理解和确定的，剂量将根据个体受试者而定。

68、用于哺乳动物(例如人类)或禽类成年生物的减毒病毒疫苗的剂量可以为约103-107噬菌斑形成单位(pfu)/kg，或其中的任何范围或值。然而，使用现有疫苗作为起点，剂量应该是通过常规方法确定安全有效的量。