鼠痘病毒用于癌症免疫治疗和疫苗的用途

背景技术：

1、正痘病毒(opv)是一种约200kb的双链dna病毒，其很容易通过同源重组被进行基因修饰。由于其大尺寸和复杂的基因组，opv在不影响其传染性和复制的情况下会接受大的dna插入物。研究最多的opv是痘苗病毒(vacv)，其是天花疫苗。vacv疫苗已经使用了几个世纪，并且其生产规模可以扩大到数亿剂量。vacv可以多产性地感染许多物种，包括小鼠和人类。事实上，在免疫功能不全的人群中，vacv会导致严重的疾病和死亡。因此，野生型(wt)vacv不是作为疫苗载体的理想选择。

2、小鼠特异性opv鼠痘病毒(小鼠脱脚病病毒，ectv)具有针对小鼠的非常窄的宿主特异性。因此，它在所有测试的非小鼠物种，诸如大鼠、兔子、豚鼠和仓鼠中都是无致病性的(burnet et al.,1946,journal of immunology,53:1-13；flynn et al.,1963,anl-6723.anl rep.50-2；flynn et al.,1962,proc anim care panel,12:263-6)。ectv在人类中也是无致病性的。因此，ectv被归类为生物安全1级(bsl1)病原体。尽管在研究中使用了近一个世纪，但从未有在ectv情况下的人类感染报告。在大约17年的历程中，已经开发了许多工具来制造表达各种蛋白质的重组ectv。最初，引入绿色荧光蛋白(gfp)的基因，作为其他针对缺失将被靶向的基因的替代品，诸如由ectv编码的i型干扰素(ifn-i)诱饵受体evm166。所产生的病毒ectv-δ166在小鼠中是>7个数量级的减毒的(4)。gfp也被引入基因组的非编码区中(xu et al.,2008,the journal of experimental medicine,205(4):981-92)。在随后的研究中，产生了ectv-δ036(一种缺乏被称为evm036的蛋白的突变病毒)，其是ectv在组织培养中从细胞传播到细胞所必需的。ectv-δ036在组织培养中不能很好地复制，形成微小的斑块，在体内极为减毒。此外，产生质粒，藉由该质粒可以将evm036与任何感兴趣的蛋白质一起重新引入ectv-δ036中，以产生会产生感兴趣的蛋白并正常复制的新病毒(roscoe et al.,2012,journal of virology,86(24):13501-7)。因此，已经创造了一种容易地产生表达任何感兴趣的蛋白质的ectv的方法。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是冠状病毒(cov)疾病2019的致病因子(zhu et al.,2020,n engl j med,382(8):727-33；zhou et al.,2020,nature,579(7798):270-3)。sars-cov-2感染后，人们可能保持无症状或发展出明显的疾病体征，从相对轻微的上呼吸道不适到经常发展为致命急性呼吸窘迫综合征(ards)的肺炎(zhou et al.,2020,nature,579(7798):270-3；huanget al.,2020,lancet,395(10223):497-506)。ards也是感染高度相关的冠状病毒sars-cov-1(其在2002-2003年引起了流行病)后死亡的主要原因(hui et al.,2010,infect disclin north am,24(3):619-38；rainer et al.,2004,curr opin pulm med,10(3):159-65)。sars-cov-1和sars-cov-2的发病机理和免疫生物学看起来是相似的。很可能，这是它们的遗传相关性(约79％)的结果(zhou et al.,2020,nature,579(7798):270-3；wang etal.,2020,eur j clin microbiol infect dis,39(9):1629-1635；lu et al.,2020,lancet,395(10224):565-74)，他们使用人类血管紧张素转换酶2(hace2)作为受体进入细胞(wrapp et al.,2020,science,367(6483):1260-3；walls et al.,2020,cell,181(2):281-292.e6)。sars-cov-1和sars-cov-2肺炎的初始阶段包括弥漫性肺泡损伤(dad)，其特征是富含蛋白质的水肿、炎症、表面活性剂功能障碍和严重低氧(hui et al.,2010,infectdis clin north am,24(3):619-38；rainer et al.,2004,curr opin pulm med,10(3):159-65)。从那里，dad可以进展为伴有肺纤维化、透明膜形成的ards，最终是微血管病、血管生成和血栓形成，随后发生广泛的器官衰竭(rainer et al.,2004,curr opin pulm med,10(3):159-65；ackermann et al.,2020,n engl j med,383(2):120-128)。sars-cov-1和sars-cov-2引起的致命疾病和死亡在老年人、男性以及患有诸如心脏病和糖尿病的共发病患者中更为常见(chen et al.,2020,lancet,395(10223):507-13；wu et al.,2020,natmed.2020；26(4):506-10)。然而，并非所有老年人或患有共发病的患者都会发展成严重疾病(chen et al.,2020,lancet,395(10223):507-13；wu et al.,2020,nat med.2020；26(4):506-10)。此外，并发症和死亡也可能发生在明显健康的年轻人身上(liu et al.,2020,j infect,80(6):e14-e18)。关键地，目前还没有用于预测、预防或特异性治疗covid19的方法(velavan et al.,2020,int j infect dis,95:304-7；confalonieri etal.,2017,eur respir rev,26(144):160116)，迫切需要疫苗。目前批准的冠状病毒病疫苗使用腺病毒载体(av)(kaur et al.,2020,virus res,288:198114))。如果av诱导的免疫性是短暂的，那么由于对载体本身的免疫性，很可能av对于再次免疫将不是有用的。此外，抗av免疫性将阻止av再次用于针对其他新出现病毒的疫苗。因此，将新的载体引入covid-19、癌症和其他疾病的免疫调节库至关重要。

3、因此，本领域需要用于癌症免疫疗法和针对病毒感染的疫苗接种的改善的组合物和方法。本发明满足了该未得以满足的需求。

技术实现思路

1、在一个实施方式中，本发明涉及重组鼠痘病毒(ectv)载体，其包含用于表达至少一种异源核酸序列的至少一个表达单元。在一个实施方式中，所述至少一个表达单元在ectv早期/晚期启动子的控制下。在一个实施方式中，ectv载体是减毒的。在一个实施方式中，早期/晚期启动子选自由7.5和h5组成的组。

2、在一个实施方式中，ectv载体包含至少一种免疫逃避基因的缺失或失活。在一个实施方式中，至少一种免疫逃避基因选自由细胞因子受体同源物和细胞因子模拟物组成的组。

3、在一个实施方式中，ectv载体还包含一个或多个另外的异源核苷酸序列。在一个实施方式中，一个或多个另外的异源核苷酸序列是编码治疗剂的序列、编码靶向部分的序列、可检测和/或可选择标记的序列、促凋亡基因或促坏死基因。

4、在一个实施方式中，靶核苷酸序列编码抗原多肽序列、抗体或抗体片段。在一个实施方式中，抗原多肽序列是癌症/肿瘤抗原、自体抗原、过敏原、与超敏反应相关的抗原、朊病毒抗原、病毒抗原、细菌抗原、来自原生动物或真菌的抗原、或寄生虫的抗原。

5、在一个实施方式中，至少一种抗原包括癌症特异性抗原。

6、在一个实施方式中，至少一种抗原包括病毒抗原。在一个实施方式中，病毒抗原选自由sars-cov-2刺突抗原和包含受体结合结构域(rbd)的sars-cov-2刺突抗原的片段组成的组。

7、在一个实施方式中，至少一种抗原是细菌抗原。

8、在一个实施方式中，表达单元包含至少两个编码抗原多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，至少两种抗原多肽来自两种不同的病毒或来自同一病毒的两个不同分支。

9、在一个实施方式中，表达单元包含至少一种来自病毒的抗原多肽和至少一种癌症特异性抗原多肽。

10、在一个实施方式中，至少一种抗原是ctl识别表位、t辅助细胞识别表位或b细胞识别表位。

11、在一个实施方式中，本发明涉及一种疫苗，该疫苗包含重组鼠痘病毒(ectv)载体，该重组鼠痘病毒(ectv)载体包含用于表达至少一种异源核酸序列的至少一个表达单元。在一个实施方式中，至少一个表达单元在ectv早期/晚期启动子的控制下。在一个实施方式中，ectv载体是减毒的。在一个实施方式中，早期/晚期启动子选自由7.5和h5组成的组。

12、在一个实施方式中，组合物还包含药物载体。

13、在一个实施方式中，本发明涉及一种在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用以有效诱导免疫应答的量的包含重组鼠痘病毒(ectv)载体的疫苗，该重组鼠痘病毒(ectv)载体包含用于表达至少一种异源核酸序列的至少一个表达单元。在一个实施方式中，免疫应答包括以下中的一种或多种：产生对至少一种抗原特异性的记忆性cd8+t细胞、产生对至少一个抗原特异性的记忆性cd4+t细胞和产生对至少一项抗原特异性的抗体。

14、在一个实施方式中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含重组鼠痘病毒(ectv)载体的疫苗，该重组鼠痘病毒(ectv)载体包含用于表达至少一种异源核酸序列的至少一个表达单元。

15、在一个实施方式中，重组ectv载体包含编码癌症抗原的靶核苷酸序列。

16、在一个实施方式中，重组ectv载体还包含编码病毒抗原的靶核苷酸序列。在一个实施方式中，病毒抗原选自由流感病毒抗原和人类巨细胞病毒抗原组成的组。

17、在一个实施方式中，重组ectv载体包含编码用于治疗癌症的免疫治疗抗体的靶核苷酸序列。

18、在一个实施方式中，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者的病毒感染或与其相关的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用包含重组鼠痘病毒(ectv)载体的疫苗，该重组鼠痘病毒(ectv)载体包含用于表达至少一种异源核酸序列的至少一个表达单元。在一个实施方式中，重组ectv载体包含编码病毒抗原的靶核苷酸序列。在一个实施方式中，所述病毒感染包括sars-cov-2感染。在一个实施方式中，重组ectv载体包含编码用于治疗病毒感染的免疫治疗抗体的靶核苷酸序列。