核酸载体组合物的制作方法

本发明涉及核酸载体组合物以及相关方法和产品。核酸载体组合物尤其可用于药物领域，尽管不限于该领域。本发明的组合物尤其可用于保护核酸免受酶促降解。

背景技术：

1、需要改善用于生物活性剂的赋形剂。生物医学研究的进步需要提供合适的赋形剂才能完全转化为有效、安全和具有成本效益的治疗。

2、作为说明性实例，已经提出核酸比如rna作为治疗剂。用于疗法或其它目的的核酸递送是众所周知的，特别是用于治疗疾病比如囊性纤维化和某些癌症，并且mrna最近已用于针对sars-cov-2的有效疫苗。术语“基因疗法”可用于指将基因或基因的一部分递送至细胞中以产生治疗效果，比如通过修复、重建或补偿有缺陷的遗传材料来产生治疗效果。更广泛地，术语“核酸递送”可用于指将核酸材料任意引入靶细胞中。作为非限制性实例，核酸递送包括mrna疫苗接种和在所谓的细胞工厂中产生商业上有用的蛋白质。

3、用于将核酸递送至细胞的递送系统分为三大类，即：

4、(i)涉及直接注射裸核酸的递送系统，

5、(ii)使用病毒或遗传修饰病毒的递送系统，以及

6、(iii)使用非病毒递送剂的递送系统。

7、每个都有其优点和缺点。尽管病毒作为递送剂具有高效和高细胞选择性的优点，但其具有毒性、引发炎症应答以及不太适合递送大dna片段的缺点。因此，mrna疫苗可以有利地包含可注射的裸mrna或非病毒递送系统，比如多聚复合物(polyplex)载体或脂质纳米颗粒载体。

8、可惜的是，已经注意到，非病毒核酸递送系统的转染效率较低。非病毒核酸递送系统基于通过核酸的带负电荷的磷酸酯主链与带电聚合物(通常是阳离子脂质和/或肽)之间的静电相互作用将核酸压缩入纳米颗粒(erbacher,p.等人,gene therapy,1999,6,138-145)。认为将这些物种引入细胞的机制涉及完整复合物的内吞作用，其中核酸和脂质之间形成的复合物变为附着在细胞表面，然后通过内吞作用进入细胞。然后复合物在泡状体(vesicle)或内体(endosome)中保持定位一段时间，并且核酸成分释放到细胞质中。

9、非病毒递送系统的聚合物组分通过静电结合形成载体复合物。脂质成分保护核酸以及在一定程度上保护任何肽成分免受内体或其他方面的降解；例如，脂质组分可以形成脂质双层外壳，其封装递送系统的其它组分，包括核酸分子。用于这种用途的阳离子脂质是由felgner在20世纪80年代末开发的，并在proc.natl.acad.sci.usa 84,7413-7417,1987中以及在us 5,264,618中报道。felgner开发了现商业上可购的阳离子脂质体，以商标为“lipofectin”知名。“lipofectin”脂质体是具有阳离子脂质dotma(2,3-二油酰氧基丙基-1-三甲基铵)和中性磷脂脂质dope(磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)以1:1比率的脂质双层的球形泡状体。此后设计了各种其它阳离子脂质体制剂，其中大多数将合成阳离子脂质和中性脂质组合。除了dotma类似物之外，还可以提及复合烷基胺/烷基酰胺、胆固醇衍生物如dc-chol、以及二棕榈醇、磷脂酰乙醇胺、谷氨酸酯、咪唑和膦酸酯的合成衍生物。然而，在血清存在的情况下，阳离子载体系统的转染效率差异很大，这明显影响了其在体内基因疗法和/或核酸递送的潜在用途。

10、用于这种复合物中的肽组分通常具有两种功能性：含有细胞表面受体(例如整联蛋白)识别序列的“头基”，以及可以非共价结合核酸的“尾”。肽组分可设计为细胞类型特异性或细胞表面受体特异性的。例如，一定程度的整联蛋白特异性可以赋予一定程度的细胞对复合物的特异性。靶向至细胞表面受体(例如整联蛋白受体)产生特异性，并且可以实现与一些腺病毒载体相当的转染效率(jenkins等人.gene therapy 7,393-400,2000)。

11、迄今为止，将信使rna(mrna)通过非病毒递送至细胞尤其存在问题，并且由于缺乏有效的载体而受到限制。使用已成功用于dna或sirna的已知非病毒运载体(vehicle)递送mrna的尝试导致蛋白质表达水平不理想。此外，已知的非病毒运载体在与mrna包装时储存稳定性较差。克服脂质双层将rna递送至细胞中仍然是rna疗法广泛发展的主要障碍。

12、因此，需要针对mrna递送而特异性定制的载体，将高水平的mrna递送至细胞并导致良好水平的蛋白质表达。还需要针对mrna递送而定制的组合物，其在储存时具有良好的稳定性，特别是在中等温度储存时保留其结构和功能性的mrna递送复合物。类似的考虑适用于其它核酸治疗剂(例如质粒衍生的dna)的递送，因为在维持良好的储存稳定性方面存在挑战，尤其是在中等温度下，比如约-5℃至约25℃的温度。

13、许多针对sars-cov-2的mrna疫苗，包括pfizer和biontech疫苗bnt162b2(“comirnaty”)和moderna cx-024414疫苗，需要冷链储存和运输。这限制了低收入国家获得疫苗的机会，并增加了所有市场的成本和物流复杂性。如果疫苗能够在标准冰箱温度(约-5℃)或室温(约20℃)下储存和运输，将是有利的。如果疫苗能够耐受更高的储存温度(例如30℃、40℃或50℃)，或者至少在短期内用于运输和配送，也是有利的。

14、通过低温维持可注射组合物例如疫苗组合物中核酸(例如mrna或dna)的稳定性以及带来物流挑战，也还具有技术限制，即核酸必须在注射前解冻，并且在注射后，它必须在体内保持稳定足够长的时间，以显示足够的生物活性。这可能需要在围绕身体易位和/或从内体区室逃逸期间保持稳定性。体内稳定性还必须维持足够长的时间，以便充分翻译成蛋白质得以发生。

15、核酸(尤其是mrna)很容易被降解，尤其是酶促降解。低温和/或核酸(例如mrna)冻干可以减缓降解，但这些选择都有缺点。短长度的核酸可以在完全合成的生产环境中制备，该环境可以不含降解酶。这种短长度的核酸可用于某些治疗应用，例如sirna。较长的核酸不能在完全合成的生产环境中以成本有效的方式制备，因此通常在包含生物来源材料的生产环境中制备。例如，mrna可以通过体外转录来制备，其中转录酶衍生自生物来源的材料(生物来源的材料是指在基于细胞培养的系统中产生或者在体外使用合成酶(例如在基于细胞培养的系统中产生的酶)产生的材料，特别是核酸)。dna(例如质粒dna或pdna)可以从细胞培养物中提取。生物来源材料的使用增加了生物来源降解酶无意中出现在核酸制剂中的机会。这可能需要大量的纯化过程(成本高昂并导致产量损失)，并且从生物来源的核酸制剂(例如体外转录的(ivt)mrna制剂或dna(例如pdna)制剂)中完全去除所有降解酶可能是不可能的或不是成本有效的。此外，在围绕身体易位和/或从内体区室逃逸期间，核酸暴露于生理和细胞内条件，通常包括与降解酶接触。

16、现有技术中已使用脂质封装或与肽或阳离子聚合物(例如鱼精蛋白)缩合来保护核酸(例如，用于基因疗法或疫苗接种的mrna)免受降解。与肽或其它聚合物的缩合依赖于肽或聚合物保持完整并保留其电荷。需要改善的赋形剂以增加核酸(例如mrna)的稳定性并改善其对酶促降解的抗性，特别是如果无需冷冻核酸制剂即可实现对酶促降解的抗性。还需要改善的赋形剂以增加包含生物来源的核酸和脂质和/或肽或其它聚合物的组合物的多种组分的稳定性。

技术实现思路

1、本发明基于以下认识：在脂质存在下可水解硅(hydrolysable silicon)可用于通过保护核酸免受酶促降解来稳定核酸比如mrna或dna(例如体外转录的mrna或质粒dna)。

2、这可以包括在储存期间稳定药物组合物(例如疫苗)中的核酸，例如在将药物组合物施用于有需要的受试者之前。它可以包括核酸在围绕身体易位和/或从内体区室逃逸(当核酸暴露于生理条件，通常包括与降解酶接触)期间的稳定性。

3、因此，根据本发明的第一方面，提供一种核酸载体组合物，其包含：

4、-一种或多种酶和/或其一种或多种片段；

5、-核酸；

6、-一种或多种包含可水解硅的颗粒；和

7、-一种或多种脂质。

8、基于酶需要水性环境以便它们催化核酸的降解，一种或多种包含可水解硅的颗粒可以去除或隔离水分子，从而防止一种或多种酶降解核酸。任选地，一种或多种颗粒通过一种或多种颗粒表面上的硅或含硅部分与水分子的反应来去除水分子。任选地，一种或多种颗粒通过在一种或多种颗粒表面上存在的孔中捕获水分子来隔离水分子。任选地，一种或多种颗粒以这两种方式隔离水分子。因此，可减少或消除在酶催化反应中可与核酸反应的水分子。因此，总体上，与不含一种或多种颗粒的组合物相比，一种或多种包含可水解硅的颗粒增加了核酸的稳定性。

9、一种或多种酶可包含一种或多种用于与核酸形成酶-底物复合物的酶。在本发明的第一方面的组合物中，酶-底物复合物可能能够形成，但酶催化反应所需的步骤不能发生，或者只能以降低的速率发生，因为水分子的可用性降低。

10、一种或多种酶任选地包含一种或多种核酸酶。一种或多种酶任选地包含一种或多种聚合酶；因此，在某些实施方式中，一种或多种酶任选地包含一种或多种rna聚合酶，其可以选自t7、sp6和t3 rna聚合酶中的一种或多种。一种或多种酶任选地包含一种或多种核酸酶和一种或多种聚合酶。

11、如本文所用，术语核酸酶是指能够裂解核酸分子中的核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。核酸酶可能能够引起靶分子中的单链断裂。核酸酶可能能够引起靶分子中的双链断裂。如本文所用，术语核酸外切酶是指能够通过从多核苷酸链的末端(exo)一次切割一个核苷酸来消化核酸分子的酶。如本文所用，术语核酸内切酶是指能够通过从多核苷酸链的中部(endo)开始一次切割一个核苷酸来消化核酸分子的酶。核酸酶可以是脱氧核糖核酸酶，也称为dnase，其作用于dna。核酸酶可以是核糖核酸酶，也称为rnase，其作用于rna。

12、一般地，聚合酶是催化聚合物形成的酶。因此，本文所用的术语dna聚合酶是指催化dna聚合物形成的酶。本文所用的rna聚合酶是催化rna聚合物形成的酶。核酸分子具有糖-磷酸主链，其通常暴露在分子的亲水表面上，因此是特别容易被水解的分子的一部分。主链中磷酸二酯键的亲核裂解可以例如经由分子间反应(与溶液中存在的亲核试剂，例如h2o)和/或分子内攻击(例如通过rna中的2’-oh基团或其它亲核基团)发生。其它降解模式，例如经由一种或多种核碱基和/或一种或多种糖部分的氧化，也是可以想到的。

13、在根据本发明的第一方面的核酸载体组合物中，酶和/或其片段与核酸的重量比任选地在1:1×1012至1:1的范围内，例如在1:1×1011至1:1、1:1×1010至1:1、1:1×109至1:1、1:1×107至1:1、1:1×106至1:1、1:1×105至1:1、1:1×104至1:1、1:1000至1:1、或1:100至1:1的范围内。

14、如本文所用，术语酶活性是指由所讨论的酶催化的反应速率。本发明的第一方面的组合物中存在的一种或多种酶任选地在ph为7.4和温度为25℃下对核酸(例如mrna)底物具有至少1nmol min-1的活性，例如在这些条件下至少10nmol min-1、至少100nmol min-1、至少1μmol min-1、至少2μmol min-1、至少5μmol min-1、至少10μmol min-1，或至少50μmol min-1的活性。

15、一种或多种酶片段可在ph为7.4和25℃的温度下对核酸(例如，mrna)底物具有相应完整酶分子在相同的ph和温度条件下的活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、以及特别是至少80％的活性。因此，一种或多种酶片段可以保留相应完整酶分子的一个或多个完整活性位点。一种或多种酶片段可以保留相应完整酶分子的一个或多个完整二级结构，例如一个或多个完整β片层和/或α螺旋。

16、任选地，核酸载体组合物是脂质纳米颗粒的形式，任选地具有被外壳封装的内核，其中外壳包含一种或多种脂质，例如在脂双层中，并且内核包含核酸和一种或多种包含可水解硅的颗粒。

17、不希望受理论的束缚，据认为，用一种或多种脂质和用核酸(但不含可水解硅)配制的常规脂质纳米颗粒通常具有被外壳封装的内核。外壳通常是脂质双层(例如，包含dspc、peg2000等)。内核通常是无定形的，被外壳封装，并且包含核酸、水和其它组分比如阳离子脂质和/或胆固醇，这取决于所采用的配方。尽管这可以保护核酸(例如mrna)免受外部介质的影响，但内核中的核酸分子仍然可以与水分子接触。例如，已经提出，内核中存在被反向阳离子脂质包围的水孔(viger-gravel等人,j.phys.chem.b 122(7),2073–2081(2018))。已经提出，内核可具有10-40体积％的水含量，比如20-30体积％，例如23-25体积％。正如areta等人,proc.natl.acad.sci.,115(15),e3351–e3360(2018)报道的，mrna可能以无序的反六角相而位于水柱内部。

18、因此，本发明的组合物可以与常规脂质纳米颗粒具有一些相似性，因为它可以是脂质纳米颗粒的形式，任选地具有被外壳封装的内核，其中外壳包含一种或多种脂质，例如在脂质双层中，并且任选地为无定形的内核包含核酸和一种或多种包含可水解硅的颗粒。然而，与常规的脂质纳米颗粒相比，在根据本发明的第一方面的组合物中，包含可水解硅的颗粒可以将水分子与核酸隔离，从而延迟或防止核酸与水在酶催化反应(例如糖-磷酸主链与水的反应)下的反应；从而稳定脂质纳米颗粒中的核酸。

19、任选地，递送系统的组分，例如脂质和/或肽分子，可以与一种或多种硅颗粒结合，产生稳定的复合物，其中可水解硅和递送系统的其它组分，例如脂质和/或肽，二者均是稳定的。带正电荷的种类例如阳离子脂质(以及带有正电荷的其它脂质组分，包括但不限于磷脂)可以结合至一种或多种包含可水解硅的颗粒，从而稳定这些带正电荷的组分。

20、因此，优选地，在室温(20℃)下，与不含硅颗粒的等同组合物相比，核酸(例如mrna或pdna)的降解减少至少一半，更优选减少至少5、10、35、50、100、500或1000倍。

21、核酸可以是或包含rna，例如mrna。核酸可以是或包含dna。当核酸是或包含mrna时，mrna可以是体外转录的mrna。当核酸是或包含dna时，dna可以是质粒dna。当核酸是或包含mrna时，mrna可包含编码蛋白质的开放阅读框和任选地以下一种或多种：

22、-5’帽；

23、-多聚(a)尾；和

24、-一个或多个非翻译区。

25、任选地，mrna的开放阅读框编码病原体的抗原。任选地，mrna的开放阅读框编码sars-cov-2的刺突蛋白抗原。

26、任选地，在本发明所有方面的某些优选实施方式中，mrna的开放阅读框编码肿瘤特异性抗原。如本文所用，术语肿瘤特异性抗原可以指在一种或多种恶性癌细胞中由非同义体细胞突变(导致新抗原)或病毒整合突变(导致癌病毒抗原)产生的抗原。因此，肿瘤特异性抗原可以指非癌性(健康、正常)细胞完全不存在(不表达)的抗原。

27、任选地，mrna的开放阅读框编码肿瘤相关抗原。如本文所用，术语肿瘤相关抗原可以指与非癌性(健康、正常)细胞相比，例如由于基因扩增或翻译后修饰而在恶性癌细胞中过表达的抗原。术语“肿瘤相关抗原”可涵盖过表达的抗原(该术语可指在非癌性(健康、正常)细胞中适度表达，但在恶性癌细胞中大量表达的蛋白质)；分化抗原(该术语可以指由恶性细胞进化而来的细胞谱系选择性表达的蛋白质，例如前列腺特异性抗原)；和癌种系抗原(该术语可以指通常仅限于生殖组织但在恶性癌细胞中异常表达的抗原；例如，黑素瘤抗原家族a3(mage-a3)；纽约食管鳞状细胞癌-1抗原(ny-eso-1)；和黑素瘤中优先表达的抗原(prame))。

28、当mrna的开放阅读框编码癌症相关抗原或癌症特异性抗原时，核酸载体组合物可适用于预防性或治疗性疫苗组合物。

29、任选地，mrna的开放阅读框编码过敏原(包括但不限于一种或多种坚果过敏原；其又包括但不限于：一种或多种种子储存蛋白，比如豌豆球蛋白、豆球蛋白、白蛋白；一种或多种植物防御相关蛋白；以及一种或多种前纤维蛋白(profilin))。

30、任选地，mrna的开放阅读框编码调节免疫性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病(包括但不限于狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、风湿病、葡萄膜炎、特应性皮炎和肺纤维化)的蛋白质。

31、任选地，根据本发明的第一方面的核酸载体组合物还包含氨基酸，比如甘氨酸。另外或替代地，组合物还包含一种或多种二糖，比如海藻糖。

32、根据本发明的替代的方面，提供一种核酸载体组合物，其包含：

33、-一种或多种酶；

34、-核酸；

35、-一种或多种包含可水解硅的颗粒；和

36、-一种或多种脂质。

37、根据本发明的第二方面，提供一种制备根据本发明的第一方面的核酸载体组合物的方法，该方法包括：

38、-通过从dna模板体外转录或从生物来源纯化获得核酸；和

39、-将核酸与一种或多种包含可水解硅的颗粒和一种或多种脂质组合。

40、根据本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含本发明的核酸载体组合物，其中该药物组合物是疫苗组合物。

41、优选地，根据本发明的第三方面的包含本发明的第一方面的核酸载体组合物的药物组合物中的核酸(例如mrna或pdna)在4℃下的半衰期为至少3个月、至少6个月或至少12个月。

42、根据本发明的第四方面，提供一种根据本发明的第三方面的药物组合物，其用作药物。

43、根据本发明的第五方面，提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，其包括：向有需要的受试者施用根据本发明的第三方面的药物组合物。

44、根据本发明的第六方面，提供一种向受试者提供疫苗接种的方法，其包括皮下或肌内施用根据本发明的第三方面的药物组合物(当其为适合肌内注射的形式时)。

45、根据本发明的第七方面，提供根据本发明的第三方面的药物组合物作为脂质多聚复合物(lipopolyplex)转染载体的用途。

46、根据本发明的第八方面，提供根据本发明的第三方面的药物组合物在制备药物中的用途。