用于治疗肌萎缩侧索硬化症的VCP抑制剂的制作方法

背景技术：

1、肌萎缩侧索硬化症(als)是一种致命的神经系统疾病，其中运动神经元存在选择性和进行性变性。rna代谢失调，并且特别是rna结合蛋白(rbp)亚细胞定位和功能，在als发病机制中发挥着关键作用。rbp协调rna生命周期，从而调节转录、剪接、rna定位、功能和衰变。

2、一些引起als的基因突变编码rbp，包括反式反应dna结合蛋白43(tardbp，其编码tdp-43)、肉瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白(fus/tls或fus)和异质核核糖核蛋白a1(hnrnpa1)。rbp的亚细胞错误定位也是als的病理标志，在97％的als病例中，tdp-43从细胞核错误定位到细胞质。[1]

3、最近，还报道了不同als模型和偶发als死后组织中广泛的sfpq和fus错误定位[2,3]。rbp在细胞质中的积累可能有助于als中观察到的rbp寡聚物和纤维状病理性细胞质内含物的形成[4,5]。由于单独一个rbp就可以与数千个rna靶标结合，因此即使是单个rbp的干扰也可能对rna代谢产生广泛而多样的影响[6]。

4、含缬酪肽蛋白(vcp或p97)是一种丰富的aaa+atp酶(与多种细胞活动相关联的atp酶)，其具有多种细胞内功能，几乎涵盖细胞生理学的所有方面。vcp功能包括蛋白质稳态、线粒体质量控制和细胞凋亡[7]。vcp的结构对其许多功能都很重要；它是一个六聚体蛋白，并且每个亚基具有一个n-末端结构域、两个atp酶结构域(d1和d2)和一个无序的c-末端结构域。常染色体显性vcp突变约占家族性als病例的2％[8]。

5、尽管有限，但在该疾病的偶发病例中也鉴别出vcp的致病性变异[9]。由于vcp在许多细胞通路中的作用，对其功能的破坏可能导致多种形式的疾病。例如，在其他神经退行性疾病中也鉴别出vcp突变，这些疾病包括包涵体肌病、佩吉特病和额颞叶痴呆(ibmpfd)。

6、vcp的致病性突变最常见于n-末端结构域，该结构域负责辅因子和泛素化底物结合，但也存在于d1和d2结构域中[10]。大多数vcp突变已在生物化学上被证明与细胞模型中正常或增加的atp酶活性相关，其中r155c突变的活性是其野生型对应物的两倍以上[11]。然而，atp酶活性增加的疾病突变体是否通过显性活性机制或显性负性机制引起疾病仍存在争议。此外，这一问题尚未在患者来源的运动神经元中得到系统解决，该运动神经元具有在病理生理学水平上传递突变的优势。

7、vcp的错义突变占家族性als的1％-2％，但可额外引起常染色体显性遗传疾病，该疾病被称为包涵体肌病、佩吉特病和额颞叶痴呆(ibmpfd)。引起als的vcp突变重现了偶发als的关键标志，包括关键rbp的核到细胞质错误定位，包括tdp-43、fus和sfpq。[2,3,8,29]。然而，vcp突变导致在als中rbp错误定位的机制仍不清楚。

8、此前有报道称，人诱导多能干细胞(ipsc)可以稳健地分化为高度富集且功能验证的脊髓运动神经元，其中已鉴别出vcp相关型als的时间分辨分子表型[2,3,12,13]。在这里，我们使用这种已建立的vcp突变相关型als的人类干细胞模型，以首先检查与对照运动神经元相比，关键rbp的核质分布。

9、我们发现，tdp-43、fus和sfpq在vcp突变体运动神经元中表现出异常的核质比降低，这延伸到神经突内的异常存在。我们发现，用靶向vcp d2 atp酶抑制剂治疗对照运动神经元并不能重现als rbp错误定位表型，这证明其功能在疾病中并没有丧失。重要的是，我们发现，在vcp突变体运动神经元中，tdp-43和fus的核到细胞质错误定位以及tdp-43、fus和sfpq的核到神经突错误定位可通过用vcp d2 atp酶结构域的药理学抑制剂进行治疗来逆转。

10、总的来说，这些发现支持了一个模型，即vcp突变导致d2 atp酶活性增加，这进而导致tdp-43、fus和sfpq从细胞核到细胞溶质的错误定位。我们的研究为利用fda批准的靶向d2 atp酶结构域的vcp抑制剂治疗vcp相关型als提供了前景。

技术实现思路

1、本
技术实现要素：
介绍了在具体实施方式中进一步描述的概念。其不应被用来鉴别所要求保护的主题的基本特征，也不应该被用来限制所要求保护的主题的范围。

2、如实例3中所讨论的，本发明首次公开了vcp d2 atp酶结构域的药理学抑制不会在健康人运动神经元(例如，在vcp基因中不具有致病突变的运动神经元)中诱导als表型。相反，本发明首次证明了vcp抑制剂可以逆转rna结合蛋白在对照(非vcp突变体)运动神经元中的错误定位。因此，本技术提供了第一公开内容，即vcp抑制剂可用于治疗或预防受试者的als，该受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有致病突变(非vcp相关型als)。

3、一个关键结果是实例3中所示的tdp-43和fus的定位变化。tdp-43的错误定位是als的关键疾病标志。在超过97％的als病例中，它从细胞核错误定位到细胞质。图2(如实例3中所讨论)首次证明了vcp抑制剂可增强健康人运动神经元中tdp-43的核定位，并且是用于非vcp相关型als的治疗通路的证据。

4、本发明提供了一种用于在治疗或预防受试者的肌萎缩侧索硬化症(als)的方法中使用的vcp(含缬酪肽蛋白)抑制剂。在一些实施例中，als是非vcp相关型als。

5、在一些实施例中，受试者尚未被鉴别为在vcp基因中具有致病突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有致病突变。在一些实施例中，als是非vcp相关型als。

6、在一些实施例中，受试者在vcp基因中可能不具有某些致病基因突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有位置r155和r191中的任一者处的致病基因突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有选自由以下项组成的列表的致病基因突变：r155c和r191q。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有位置r95、i114、i151、r155、g156、m158、r159、r191、n387、n401、r487、d592、r662和n750中的任一者处的致病基因突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有选自由以下项组成的列表的任何致病基因突变：r95c、r95g、i114v、i151v、r155h、r155c、g156c、m158v、r159g、r159c、r159h、r191g、r191q、n387t、n401s、r487h、d592n、r662c和n750s。

7、在一些实施例中，受试者在tardbp基因中可能具有一种或多种致病基因突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在tardbp基因中具有一种或多种致病基因突变。

8、在一些实施例中，肌萎缩侧索硬化症与tdp-43、fus和/或sfpq中的一者或多者的核质比的降低相关联。在一些实施例中，vcp抑制剂改善与tdp-43、fus和/或sfpq中的一者或多者的核质比的降低相关联的一种或多种症状。

9、在一些实施例中，肌萎缩侧索硬化症与tdp-43的核质比的降低相关联。在一些实施例中，vcp抑制剂改善与tdp-43的核质比的降低相关联的一种或多种症状。

10、在一些实施例中，肌萎缩侧索硬化症与fus的核质比的降低相关联。在一些实施例中，vcp抑制剂改善与fus的核质比的降低相关联的一种或多种症状。

11、在一些实施例中，肌萎缩侧索硬化症与sfpq的核质比的降低相关联。在一些实施例中，vcp抑制剂改善与sfpq的核质比的降低相关联的一种或多种症状。

12、在一些实施例中，治疗或预防als包括部分或完全地减轻、改善、缓解、抑制患有或易患als的患者的神经性损害、延迟该神经性损害的发作、降低该神经性损害的严重程度和/或发生率。在一些实施例中，神经性损害包括与中枢神经系统的损害相关联的症状，诸如发育迟缓、进行性认知障碍、听力损失、言语发育受损、运动技能缺陷、多动、攻击性和/或睡眠障碍中的一者或多者。

13、在一些实施例中，用vcp抑制剂治疗或预防als使得一种或多种神经性损害症状与不存在vcp抑制剂时的神经性损害症状相比，好转或改善(improvement或amelioration)超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施里中，用vcp抑制剂治疗或预防als使得一种或多种神经性损害症状改善超过约50％、约80％、约90％或约95％。

14、在一些实施例中，vcp抑制剂抑制vcp的d2 atp酶结构域。

15、在一些实施例中，vcp抑制剂选自由以下项组成的组：ml240(2-(2-氨基-1h-苯并咪唑-1-基)-8-甲氧基-n-(苯基甲基)-4-喹唑啉胺)、ml241、2-苯胺基-4-芳基-1,3-噻唑、3,4-亚甲二氧基-6-硝基苯乙烯、dbeq(n2,n4-二苄基喹唑啉-2,4-二胺)、cb-5083(1-[7,8-二氢-4-[(苯基甲基)氨基]-5h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-2-基]-2-甲基-1h-吲哚-4-甲酰胺)、cb-5339(1-[4-(苄基氨基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]-2-甲基吲哚-4-甲酰胺)、upcdc-30245(1-(3-(5-氟-1h-吲哚-2-基)苯基)-n-(2-(4-异丙基哌嗪-1-基)乙基)哌啶-4-胺)、nms-873、nms-859、伊亚瑞司他汀i(eeyarestatin i)和黄腐酚(xanthohumol)。

16、在一些实施例中，vcp抑制剂是ml240(2-(2-氨基-1h-苯并咪唑-1-基)-8-甲氧基-n-(苯基甲基)-4-喹唑啉胺)。

17、在一些实施例中，vcp抑制剂是cb-5083(1-[7,8-二氢-4-[(苯基甲基)氨基]-5h-吡喃并[4,3-d]嘧啶-2-基]-2-甲基-1h-吲哚-4-甲酰胺)或cb-5339(1-[4-(苄基氨基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]-2-甲基吲哚-4-甲酰胺)。

18、本发明还提供了一种将受试者诊断为患有或疑似患有非vcp相关型als的方法，该方法包括确定该受试者是否在vcp基因中具有致病突变，并基于在vcp基因中不存在致病突变而提供对非vcp相关型als的诊断。

19、在一些实施例中，该方法包括鉴别在vcp基因中不存在位置r95、i114、i151、r155、g156、m158、r159、r191、n387、n401、r487、d592、r662和n750中的任一者处的致病基因突变。在一些实施例中，该方法包括鉴别在vcp基因中不存在选自由以下项组成的列表的任何致病基因突变：r95c、r95g、i114v、i151v、r155h、r155c、g156c、m158v、r159g、r159c、r159h、r191g、r191q、n387t、n401s、r487h、d592n、r662c和n750s。

20、本发明还提供了一种用于在治疗或预防受试者的非vcp相关型als的方法中使用的vcp抑制剂，该方法包括使用根据本发明方法的方法将患者诊断为患有或疑似患有非vcp相关型als，并向该患者施用vcp抑制剂。

21、本发明还提供了一种用于在治疗或预防受试者的非vcp相关型als的方法中使用的vcp抑制剂，其中已使用根据本发明方法的方法将该患者诊断为患有或疑似患有非vcp相关型als，并向该患者施用vcp抑制剂。

22、本发明还提供了一种用于在治疗或预防肌萎缩侧索硬化症(als)的方法中使用的包含vcp抑制剂的药物组合物，任选地其中该药物组合物包含一种或多种赋形剂。

23、本发明还提供了一种治疗或预防肌萎缩侧索硬化症(als)的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用vcp抑制剂。在一些实施例中，受试者尚未被鉴别为在vcp基因中具有致病突变。在一些实施例中，受试者已被鉴别为在vcp基因中不具有致病突变。在一些实施例中，als是非vcp相关型als。vcp抑制剂可以以治疗有效量施用。

24、本发明还提供了一种用于将受试者诊断为患有或疑似患有非vcp相关型als的试剂盒，该试剂盒包括确定该受试者是否在vcp基因中具有致病突变的工具。在一些实施例中，试剂盒进一步包括含有一种或多种vcp抑制剂的一个或多个容器，以及任选的信息材料。在一些实施例中，信息材料包括在诊断和/或治疗非vcp相关型als中使用该试剂盒的说明。