M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用

本发明涉及分子生物，具体涉及m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术：

1、心肌缺血再灌注损伤(mi/ri)是一种急性st段抬高型心肌梗死(stemi)，mi/ri后，无论是缺血心肌还是非缺血心肌，心脏电生理都发生了深刻的变化，导致复极异质性，引发室性心律失常(vas)。室性心律失常可通过跨越不同异质复极区的多个折返回路来引发和维持，是世界范围内死亡率和致残率较高的疾病。目前广泛应用的治疗方法包括经皮冠状动脉介入治疗技术、抗血小板药物和抗血栓药物，但至今尚无有效的预防mi/ri后心律失常的策略。

2、大量研究表明，巨噬细胞可通过与心肌细胞形成缝隙连接促进房室结内的电传导。当发生mi/ri时，来自体循环的大量单核细胞将聚集在心脏并分化为巨噬细胞，并比其他炎症细胞更多地渗透到炎症部位。在心脏募集后，巨噬细胞在免疫反应中比常驻巨噬细胞发挥更核心的作用。炎性巨噬细胞在mi/ir后心律失常中发挥关键作用，但其机制尚不清楚。

3、募集的巨噬细胞分为两个亚型，即促炎的m1型巨噬细胞和抗炎的m2型巨噬细胞。m1型巨噬细胞产生促炎因子，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)和il-6，并促进mi/ri进展。众所周知，m2型巨噬细胞作为抗炎细胞发挥作用，分泌包括il-10和il-4在内的强大抗炎因子，抑制促炎因子的产生，阻断炎症反应，同时促进健康的组织重塑和组织修复。此前，几项临床研究提供的证据表明，炎性细胞因子的增加与心律失常密切相关。这些结果表明炎症影响室性心律失常的发生和发展，vas涉及底物触发的心脏电和结构重构，炎症有助于异位触发的活动和折返的发生。据报道，炎性巨噬细胞在mi/ir后vas发挥关键作用。此外，临床研究表明，巨噬细胞或巨噬细胞分泌的炎性细胞因子升高与vas密切相关

4、先前的研究证明，ir后心脏内各种细胞外囊泡(ev)的释放显著增加。众所周知，ev是心脏生理学和病理学中生物信号传导的有效传播者。作为ev的一种，外泌体(直径为30-200nm)可以被所有细胞分泌，它们通过将其内容物转移到不同的细胞，影响基因转录和细胞增殖，从而在细胞间通讯中发挥重要作用。自外泌体被发现以来，其在心血管疾病中的研究引起了广泛关注。外泌体可以在细胞间携带蛋白质、microrna、非编码rna、dna等多种基因药物，因此也被称为基因治疗的“下一代”载体。

5、目前没有发现m2型巨噬细胞外泌体对心肌缺血再灌注损伤诱发的心律失常的作用。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，本发明中的m2型巨噬细胞外泌体可以通过其内包裹的长链非编码rna morrbid通过增强trpv1表达，调控钙离子通路而改善心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏，从而缓解心律失常，本发明为以巨噬细胞来源的外泌体治疗缺血再灌注损伤心律失常提供理论基础和科学依据。

2、本发明提供了m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。

3、进一步地，所述m2型巨噬细胞外泌体用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心律失常的药物。

4、进一步地，所述m2型巨噬细胞外泌体通过长链非编码rna morrbid激活心肌细胞线粒体上的trpv1钙离子通道，释放线粒体内超载的钙离子，调控线粒体内钙稳态，实现对缺血再灌注后心律失常的有效治疗。

5、进一步地，所述m2型巨噬细胞外泌体提取过程为：用白细胞介素-4刺激raw264.7细胞，利用无血清培养基孵育后收集培养基，然后通过梯度离心法分离外泌体。

6、进一步地，所述梯度离心法分离外泌体过程为：将收集的培养基以2000g离心10min，然后以10000g离心30min以去除细胞碎片，然后，将上清液以2000g时浓缩8min至原始体积的30％，最后，将上清液120,000g离心70min，洗涤沉淀后获得m2型巨噬细胞外泌体。

7、进一步地，用冷pbs洗涤沉淀。

8、进一步地，无血清培养基孵育后收集培养基的过程为：无血清培养基中孵育24h，收集培养基，用新鲜的无血清培养基代替，将培养物再孵育24h，然后再次收集培养基，将收集的两体积的培养基混合在一起。

9、进一步地，所述白细胞介素-4质量浓度为100ng/ml，所述raw264.7细胞接种量为2.0×106个/孔。

10、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

11、1、本发明成功提取的m2型巨噬细胞外泌体，利用透射电镜观察到其直径大致均在40-100nm之间，且我们利用western blot技术也成功检测到其表面存在外泌体特征蛋白的表达，利用bca技术可以测得平均12个10cm皿的巨噬细胞可以提取2mg/ml的m2型巨噬细胞外泌体；

12、本发明提取的m2型巨噬细胞外泌体内的长链非编码rna morrbid能调控心肌细胞线粒体trpv1钙离子通道蛋白的表达从而达到治疗缺血再灌注后心律失常的目的，具有用于制备治疗缺血再灌注后心律失常药物的潜力。

13、2、本发明能简易高效的制备一种高效低毒的治疗缺血再灌注后心律失常的具有生物活性的细胞囊泡，具有潜在的医用前景。

14、3、本发明提取的m2型巨噬细胞外泌体在心血管疾病金针过程中具有重要的作用，它是一种直径为30-150nm的微小囊泡，其中富含大量的mirna、mrna、蛋白质、胆固醇等多种物质，它是细胞间通讯交流和物质交流的重要载体，可以将富含生物信息的物质运送到靶细胞，从而调控细胞功能及代谢，进一步影响疾病进程。

15、4、本发明中的m2型巨噬细胞外泌体能够抑制炎症的发生，外泌体比较稳定，且安全性高，易保存，可以调节多个靶基因表达，相较于其他的外源性药物载体，外泌体具有更低的免疫原性，并能够靶向作用于病变细胞，本发明中的m2型巨噬细胞外泌体不仅可以持续改善细胞环境，而且可以直接进入到细胞，直接修复损伤心肌组织。

技术特征：

1.m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述m2型巨噬细胞外泌体用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心律失常的药物。

3.根据权利要求1所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述m2型巨噬细胞外泌体通过长链非编码rna morrbid激活心肌细胞线粒体上的trpv1钙离子通道，释放线粒体内超载的钙离子，调控线粒体内钙稳态，实现对缺血再灌注后心律失常的有效治疗。

4.根据权利要求1所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述m2型巨噬细胞外泌体提取过程为：用白细胞介素-4刺激raw264.7细胞，利用无血清培养基孵育后收集培养基，然后通过梯度离心法分离外泌体。

5.根据权利要求4所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述梯度离心法分离外泌体过程为：将收集的培养基以2000g离心10min，然后以10000g离心30min以去除细胞碎片，然后，将上清液以2000g时浓缩8min至原始体积的30％，最后，将上清液120,000g离心70min，洗涤沉淀后获得m2型巨噬细胞外泌体。

6.根据权利要求5所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，用冷pbs洗涤沉淀。

7.根据权利要求4所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，无血清培养基孵育后收集培养基的过程为：无血清培养基中孵育24h，收集培养基，用新鲜的无血清培养基代替，将培养物再孵育24h，然后再次收集培养基，将收集的两体积的培养基混合在一起。

8.根据权利要求4所述的m2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述白细胞介素-4质量浓度为100ng/ml，所述raw264.7细胞接种量为2.0×106个/孔。

技术总结
本发明涉及分子生物技术领域，具体公开了M2型巨噬细胞外泌体在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明中的M2型巨噬细胞外泌体能够用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤造成的心律失常的药物，所述M2型巨噬细胞外泌体是利用白细胞介素‑4刺激RAW264.7细胞并孵育而得。本发明中的M2型巨噬细胞外泌体可以通过其内包裹的长链非编码RNA Morrbid通过增强TRPV1表达，调控钙离子通路而改善心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏，从而缓解心律失常，本发明为以巨噬细胞来源的外泌体治疗缺血再灌注损伤心律失常提供理论基础和科学依据。

技术研发人员：张春祥,李春红,王敏睿,余烊
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11