一种杂化纤维增强水凝胶支架的制备方法及其促成骨应用

：本发明属于骨缺损填充材料，特别涉及一种杂化纤维增强水凝胶支架的制备方法及其促成骨应用，所述水凝胶支架以水凝胶为基础支架，杂化纤维作为其内部增强结构；该杂化纤维增强的水凝胶支架具备良好的细胞相容性、细胞负载能力以及促成骨能力。

背景技术：

0、技术背景：

1、骨骼是人体内的重要器官，承担运动、支撑及保护身体的作用，其形状多种多样，具有复杂的外形以及内在结构；按照其外形不同可分为长骨、短骨、扁平骨、不规则骨等，按照其所处部位还可分为中轴骨与四肢骨；其内在结构为蜂窝状立体形态。骨主要包括骨膜、骨质及骨髓三部分；长骨的两端为骨松质，靠近中部为致密的骨密质，骨的中央为骨髓腔，内有骨髓填充；骨外一般有骨膜包被，是一种覆盖于骨表面并与之紧密连接的结缔组织膜，具有营养骨质、促进愈合的作用。骨缺损是指由于创伤、骨病或手术原因导致的骨质的缺损，其常造成骨不连、骨骼延迟愈合乃至不愈合、以及局部的功能障碍。目前，对于骨缺损我们的主要治疗手段为植骨，即通过手术手段将自体骨或处理后的同种异体骨或人工骨填充至骨缺损处。自体骨是最经典的骨缺损填充材料，多从髂骨、腓骨上段等对自身影响较小处取材，自体骨不会出现排异反应，对于小体积骨缺损，临床上目前还是多应用自体骨进行填充，但该方法修复能力有限、存在取骨处血肿以及感染等风险。同种异体骨无取骨区并发症风险、且缩短了手术时间、减少了手术切口，但也存在排异反应、费用较高、填充物坏死等缺点。人工骨对于大块骨缺损及多发骨缺损患者具有明显有优势，但其生物活性差，费用高昂，且术后康复周期也较长。

2、为了弥补现有骨缺损填充材料的各种缺点，促进骨缺损处的愈合与再生，对骨缺损填充材料的研究非常重要。骨缺损填充材料主要从骨组织的组成、结构以及功能三方面进行设计。从组成来角度来看，天然的骨组织包括有机物及无机物，有机物主要为蛋白质，无机物包括钙、磷等；从结构角度来看，骨组织为蜂巢状的立体结构，具有较多的孔隙结构；从功能上来说，骨的自我修复功能较强，需要一定强度来起支撑及保护作用。对于骨组织工程来说，我们还要注意材料携带细胞及促进干细胞成骨分化的能力。

3、水凝胶由于其制备简单，理化性质稳定且原料来源广泛，且可进行光固化处理，目前在组织工程领域得到了广泛应用。例如中国专利申请cn202110051089.4公开了一种高性能可加工水凝胶及其制备方法和应用，所述水凝胶包括可加工高分子水凝胶基体和基于海藻酸盐与生物陶瓷材料的分散体系在所述基体中形成的互穿网络结构和/或半互穿网络结构，从而使得水凝胶可以包载具有诱导骨修复能力的生物陶瓷材料颗粒，以及其他类型的生物活性物质如药物、生物活性分子或细胞等，以实现水凝胶对上述生物活性物质的装载和输送；并通过合理优化凝胶网络中各组分的配比，以调节其力学性能、诱导、支撑不规则承力成骨细胞分化的能力，并促进矿化；中国专利申请cn202111364747.1公开了一种双载药纳米纤维水凝胶复合软骨修复系统，载有kartogenin的同轴纳米纤维为骨架，载有七叶皂苷钠的复合水凝胶填充于骨架的空隙并使其最终形成具有弹性的圆柱体，其中：所述同轴纳米纤维由芯层和壳层构成，芯层为聚乳酸，kartogenin均匀分散在聚乳酸中，壳层为丝素蛋白；所述复合水凝胶由七叶皂苷钠、壳聚糖、氧化羟乙基纤维素组成，七叶皂苷钠均匀分散在壳聚糖中。

4、静电纺丝技术用于构建增强水凝胶的杂化纤维，静电纺丝技术同样为一种成熟技术，原料来源多样，可重复性强且可大量生产。静电喷涂技术也是一种稳定、高效的技术用于杂化纤维构建。但目前为止，还未发现有关于将成骨活性材料和杂化纤维同时用于水凝胶骨材料中的报道。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明目的是为了解决现有技术存在的缺陷，提供一种杂化纤维增强水凝胶支架材料的制备方法及其应用，该方法制备的杂化纤维增强的水凝胶材料能够模拟天然骨组织的组分与结构，且具有可注射性、良好的细胞相容性以及迅速固化的性质。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种杂化纤维增强的水凝胶支架材料，该材料以水凝胶基质为基础支架，杂化纤维和成骨活性生物材料填充在水凝胶内部或载有成骨活性生物材料的杂化纤维填充在水凝胶内部；所述杂化纤维为纤维微球或纤维微丝。

3、所述水凝胶基质为具有流动性及光固化性的gelma水凝胶。

4、所述杂化纤维的主要成分为医用纤维材料。

5、所述成骨活性生物材料为骨脱细胞外基质、生物活性玻璃(bg)、蒙脱土(montmorillonite)、羟基磷灰石(hap)、β-磷酸三钙(β-tcp)、石墨烯或黑磷中的至少一种。

6、本发明还提供了所述杂化纤维增强水凝胶支架材料的制备方法，包括制备gelma水凝胶、静电纺丝及静电喷涂法制作杂化纳米纤维；具体步骤如下：

7、(1)制备gelma水凝胶：将明胶溶于45℃pbs溶液中，加热至60℃，逐滴加入甲基丙烯酸酐，并搅拌促进反应3小时，最后加入4倍体积的等温pbs溶液，于去离子水中透析一周，冻干后即可获得冻干gelma，溶于光引发剂溶液中即可获得最终gelma水凝胶；

8、(2)制备杂化纤维或载有成骨活性生物材料的杂化纤维：杂化纤维为纤维微丝或纤维微球；纤维微丝的制备方法为：以医用纤维材料为原料或以医用纤维材料和成骨活性生物材料为原料制备纺丝液，通过静电纺丝设备制备取向纳米纤维膜或同轴纳米纤维膜；将所制得纳米纤维膜裁剪为1cm×2cm方块，使用oct包埋剂将其均匀取向包埋，使用冰冻切片机将裁剪后的纳米纤维膜进一步切碎，后经超声均质机均质冻干后制得纳米纤维微丝，即为杂化纤维微丝或载有成骨活性生物材料的杂化纤维微丝；

9、纤维微球的制备方法为：将上述制得纳米纤维微丝混匀于明胶水溶液中，得到用于静电喷涂的均质液体，然后通过单喷头静电喷涂设备进行静电喷涂，使用装有液氮的容器作为接收装置，将接收到的纳米纤维/明胶微球经冻干后制得纳米纤维微球，即为杂化纤维微球或载有成骨活性生物材料的杂化纤维微球；

10、(3)将成骨活性生物材料和步骤(2)制得的杂化纤维均匀混于步骤(1)所制得的水凝胶中，或将步骤(2)制得的载有成骨活性生物材料的杂化纤维或者杂化纤维微球混于步骤(1)制得的水凝胶中，得到杂化纤维增强的水凝胶支架材料。所述医用纤维材料为聚氨酯(pu)、聚乳酸(pla)、聚己内酯(pcl)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乙烯醇(pva)中的至少一种。

11、所述步骤(2)中纺丝液的制备方法为：将医用纤维材料在有机溶剂中均匀溶解制得纺丝液(医用纤维材料与有机溶剂的质量体积比为(5-30)g:100ml)或将医用纤维材料和成骨活性生物材料在有机溶剂中均匀溶解制得纺丝液；医用纤维材料与成骨活性生物材料的质量比为100:(1-25)；医用纤维材料与成骨活性生物材料的总质量与有机溶剂的体积比为(5-30)g:100ml；所述有机溶剂为六氟异丙醇(hfip)。

12、所述步骤(2)中静电纺丝设备包括推进装置、高压静电发生器及高速滚筒收集装置。

13、所述步骤(2)中冰冻切片机的工作参数如下：工作温度-15℃，切片层厚20-50μm。

14、所述步骤(2)中纺丝参数如下：纺丝溶液流速为0.013ml/min，喷头电压为+10kv，高速取向收集装置电压为-6kv，高速取向收集装置转速为2700rpm/min，喷头与高速取向收集装置之间的距离为10-25cm。

15、所述步骤(2)中纳米纤维微丝与明胶的质量比为100:(10-50)；明胶水溶液是将明胶溶于去离子水中制得，纳米纤维微丝与明胶的总质量与去离子水的体积比为(1.1-7.5)g:100ml。

16、所述步骤(2)中静电喷涂设备包括推进装置、高压静电发生器及装有液氮的杯状接收容器。

17、所述步骤(2)中静电喷涂参数如下：喷涂溶液流速为0.013ml/min-0.065ml/min，喷头电压为+6kv至+10kv，装有液氮的杯状接收容器接地线，喷头垂直向下与杯状接收装置对齐，喷头与液氮液面距离为15-40cm。

18、本发明还提供所述杂化纤维增强水凝胶支架材料的促成骨应用，具体为所述杂化纤维增强水凝胶支架材料在修复骨缺损中的应用，所述水凝胶支架材料具备可注射性及光固化性，能根据具体缺损部位及形状进行匹配塑形；其含有的成骨活性生物材料具备成骨诱导活性，有利于干细胞的成骨分化。

19、本发明所述的复合材料基质为gelma水凝胶，使该水凝胶支架材料具有一定可注射性及光固化性，同时固化后的水凝胶支架材料具有一定力学强度；杂化纤维均匀分散于水凝胶中，包括负载有生物玻璃的纳米纤维微丝及纳米纤维微球；杂化纤维所用的聚己内酯材料具备良好的力学性能，可增强水凝胶力学强度，生物玻璃材料具有成骨活性，纤维微丝以及纤维微球的三维结构进一步加强水凝胶支架材料力学强度的同时还具有较高比表面积，有利于细胞的黏附生长。因此，本发明制备的杂化纤维增强的水凝胶支架在骨缺损修复中具有极好的应用前景。

20、整体来看，所述杂化纤维增强的水凝胶支架使可注射的光固化水凝胶内均匀分散有纳米纤维微丝或纳米纤维微球组成的杂化纤维，具有良好的力学性能及生物相容性；着眼于细节，生物玻璃可以诱导干细胞成骨方向分化，同时高比表面积的杂化纤维为干细胞黏附提供了位置，这都有利于骨缺损的修复。

21、本技术与现有技术相比，有益效果如下：

22、(1)发明人首次利用成骨活性生物材料、纳米纤维微丝及微球组成的杂化纤维均匀分散于水凝胶支架中，增强了水凝胶的力学性能，优化了其内部结构，满足骨骼所需的力学性能及结构特点。

23、(2)本发明制备的杂化纤维增强的水凝胶支架中的纳米纤维微球结构优异，具有高表面积，有利于细胞黏附及增殖，其含有的生物活性玻璃具备成骨诱导活性，有利于干细胞的成骨分化，同时其立体结构也增强了水凝胶支架的力学强度。

24、(3)本发明制备的杂化纳米纤维及水凝胶支架材料均为可降解材料，无毒且生物相容性好，可随着骨组织再生逐渐降解；同时具备可注射性及光固化性，可根据具体缺损部位及形状进行匹配塑形，在骨组织缺损修复中具有很好的应用前景。