一种细胞膜包被载药囊泡、制备方法及应用

本发明涉及抗肿瘤，具体是一种细胞膜包被载药囊泡、制备方法及应用。

背景技术：

1、骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤。然而，骨肉瘤的肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)常处于免疫抑制状态，导致骨肉瘤进展和治疗效果欠佳。目前尚无有效调控tme和杀伤肿瘤的抗骨肉瘤治疗方案。肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages，tams)是肿瘤免疫抑制微环境的重要参与者。tams可分为两种亚型：m1型tams主要发挥抗肿瘤作用，而m2型则促进肿瘤进展。基于tams的功能特点，诱导m2型向m1型极化是重塑肿瘤免疫抑制tme、治疗肿瘤的重要策略。

2、toll样受体(toll-likereceptor，tlr)是天然免疫系统中研究最广泛的模式识别受体之一。tlr4存在于多种细胞表面，如巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，在tme中浸润免疫细胞或肿瘤细胞中发挥重要作用。tlr4的胞内结构域负责招募下游适配蛋白，参与炎症反应。研究表明tlr激动剂可诱导tams的m1型极化，发挥抗肿瘤作用。紫杉醇可激活tlr4信号通路将tams重编程为m1型，抑制肿瘤生长。因此，tlr4信号通路参与调控巨噬细胞m1型极化。

3、如果基于以上理论开发肿瘤靶向治疗方案，那么如何有效的对目标递送有效药物成分，是实现靶向治疗的难题。如果递送的tlr激动剂发生“脱靶”效应，则会导致较大的全身毒性作用，且无法准确靶向作用于肿瘤局部组织，无法充分发挥抗肿瘤作用。

4、肿瘤靶向治疗策略有赖于构建高效的靶向递药体系。现有的传统纳米载体，多为人工合成纳米材料或外泌体，存在以下问题：(1)人工合成纳米材料容易被免疫系统识别和清除、毒副作用大，且功能设计复杂；外泌体制备方法繁琐且产量低费用高，不利于临床推广应用。(2)对药物的装载方式通常是物理吸附或化学修饰，物理吸附方法存在载药率不高的问题，化学修饰方法存在修饰方式复杂、药物不易释放的问题。(3)靶向作用单一，只能对肿瘤细胞进行靶向，无法对肿瘤微环境中其他细胞如巨噬细胞进行靶向，发挥双重调控作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞膜包被载药囊泡、制备方法及应用，它用于靶向递送tlr4激动剂至骨肉瘤肿瘤组织，诱导tams极化，重塑免疫抑制tme，高效杀伤骨肉瘤。本研究实现了调控tme和杀伤肿瘤的双重目的，为骨肉瘤治疗提供一种新策略。

2、本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

3、一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，将巨噬细胞膜溶液与tlr4激动剂rs09共孵育后，使用200nm聚碳酸酯膜来回挤出10至20次，获得载tlr4激动剂的细胞膜包被纳米囊泡。

4、优选的，所述巨噬细胞膜液的制备方法为：通过lps刺激raw264.7巨噬细胞分化为m1型，收集1×108个m1型巨噬细胞并用pbs洗涤3次，在4℃下用低渗细胞裂解缓冲液重悬，冰浴15分钟；将重悬液用超声破碎机破碎10分钟后，获得的溶液经差速离心纯化，得到巨噬细胞膜溶液。

5、优选的，所述差速离心纯化，包括以700g离心10min取上清；以15000g离心30min取沉淀，以纯化膜。

6、优选的，所述巨噬细胞raw264.7为采用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基，且培养环境为37℃、5％co2培养箱中培养。

7、优选的，以所述tlr4激动剂的用量为0.05mg，所述巨噬细胞膜溶液的用量为0.1mg进行共孵育。

8、一种细胞膜包被载药囊泡，通过以上方法制得。

9、一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法制得的细胞膜包被纳米囊泡在治疗骨肉瘤肿瘤药物中的应用。

10、对比现有技术，本发明的有益效果在于：

11、(1)研发一种仿生巨噬细胞膜包被纳米囊泡，无全身毒副作用，且制备方法(挤出器挤出)简单高效，产量大。

12、(2)通过药物与细胞膜共挤出的方式，在细胞膜囊泡内可高效装载tlr4激动剂，当囊泡被细胞内吞后药物立即释放。

13、(3)本载药细胞膜包被囊泡保留了细胞膜表面相关蛋白和抗原，本发明中的囊泡具有与巨噬细胞相同的抗原特性，表明其具有同源靶向巨噬细胞和靶向肿瘤细胞的功能。该载药囊泡可靶向递送tlr4激动剂至骨肉瘤肿瘤组织，在肿瘤微环境中同时靶向肿瘤细胞和巨噬细胞。

14、(4)该仿生巨噬细胞膜包被纳米载药囊泡可诱导tams极化，重塑免疫抑制tme，高效杀伤骨肉瘤，实现调控tme和杀伤肿瘤的双重目的，为骨肉瘤治疗提供一种新策略。

技术特征：

1.一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，其特征在于，

2.根据权利要求1所述一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述巨噬细胞膜液的制备方法为：通过lps刺激raw264.7巨噬细胞分化为m1型，收集1×108个m1型巨噬细胞并用pbs洗涤3次，在4℃下用低渗细胞裂解缓冲液重悬，冰浴15分钟；将重悬液用超声破碎机破碎10分钟后，获得的溶液经差速离心纯化，得到巨噬细胞膜溶液。

3.根据权利要求2所述一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述差速离心纯化，包括以700g离心10min取上清；以15000g离心30min取沉淀，以纯化膜。

4.根据权利要求1所述一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，其特征在于，所述巨噬细胞raw264.7为采用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基，且培养环境为37℃、5％co2培养箱中培养。

5.根据权利要求1所述一种细胞膜包被载药囊泡的制备方法，其特征在于，以所述tlr4激动剂的用量为0.05mg，所述巨噬细胞膜溶液的用量为0.1mg进行共孵育。

6.一种根据权利要求1～5任一所述的制备方法制备的细胞膜载药囊泡。

7.一种根据权利要求1～5任一所述的制备方法制备的细胞膜载药囊泡在治疗骨肉瘤肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种细胞膜包被载药囊泡、制备方法及应用，主要涉及抗肿瘤技术领域。包括将巨噬细胞膜溶液与TLR4激动剂RS09共孵育后，使用200nm聚碳酸酯膜来回挤出10至20次，获得载TLR4激动剂的细胞膜包被纳米囊泡。本发明的有益效果在于：它用于靶向递送TLR4激动剂至骨肉瘤肿瘤组织，诱导TAMs极化，重塑免疫抑制TME，高效杀伤骨肉瘤。本研究实现了调控TME和杀伤肿瘤的双重目的，为骨肉瘤治疗提供一种新策略。

技术研发人员：黄欣,张惟悦,吴蔚,郭昊宇,汪露通,张志才,邵增务
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13