模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型及其建立方法与应用

本发明属于生物实验模型构建，特别涉及一种模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型及其建立方法与应用。

背景技术：

1、牙周炎是一种以牙周组织破坏为特征由菌斑生物膜异常导致的慢性多因素炎症性疾病。特定的微生物群通过诱发宿主的炎症反应导致牙周组织进行性破坏，最终破坏结缔组织和骨组织。重度牙周炎是人类第六大常见疾病。重度牙周炎不仅可以导致失牙并严重影响生活质量，同时也会给全身健康带来不良的影响。相关研究表明糖尿病、高血压、肥胖、高血脂等是牙周炎的重大风险因素之一，它们与牙周炎的关系目前已得到不同程度的证明，随着生活水平的提高，作为代谢综合征组分之一的高尿酸血症(一种由于尿酸盐生产过剩和/或肠道排泄不足和/或肾脏尿酸盐排泄不足所致的代谢性疾病，其特征是血尿酸浓度过度升高)近年来的发病率也越来越高，是继“三高”后的“第四高”，据报道，高尿酸血症累及全球约15％～20％的人群。最近的研究表明高尿酸血症可能也是牙周炎的一大风险因素，近期的一项回顾性队列研究显示，痛风(一种血尿酸水平异常升高导致尿酸钠晶体沉积在关节及关节周围组织所致的炎症性疾病)患者罹患牙周炎的风险大大提高(ahr＝1.13，95％ci＝1.10～1.16)，秋水仙碱降尿酸治疗则可以有效降低罹患牙周炎的风险(ahr＝0.85，95％ ci＝0.79～0.91)，此外动物研究表明非布索坦降尿酸治疗可以减轻大鼠牙周炎的进展，横断面和干预性研究也发现，血液尿酸水平升高与牙周炎之间可能存在正相关。例如，与健康对照相比，发现牙周炎患者的血浆尿酸水平升高。在iga肾病患者中，与轻/中度牙周炎相比，重度牙周炎与较高的血清尿酸水平相关。牙周炎非手术治疗也显示出降低牙周炎患者血清尿酸的效果。这些发现表明，全身性尿酸水平升高与牙周炎的严重程度存在正相关关系，即高尿酸血症是牙周炎的风险因素。必须指出的是目前关于高尿酸血症加重牙周炎的机制仍然不清楚，而流行病学研究无法阐明血清尿酸升高加重牙周炎的具体机制，因此一种可模拟高尿酸血症加重牙周炎的动物模型，对于探究两者联系背后的可能分子生物学机制显得尤为必要。

2、目前国内外尚无关于高尿酸血症加重牙周炎的动物模型的报道，相关技术尝试通过添加氧嗪酸钾和尿酸的饲料喂养及丝线结扎小鼠上颌骨第二磨牙建立高尿酸血症复合牙周炎的小鼠模型(罗咏熙，黄雪莹，冼若婷，余皖鑫，梁莉欣，梁兆佳，陈紫韵，侯丹，余挺.高尿酸血症对小鼠短期牙周感染牙槽骨破坏的micro-ct分析[j].口腔疾病防治，2021，29(02):88-93.)，实验终点检测小鼠血清尿酸水平及行上颌骨micro-ct分析，结果表明氧嗪酸钾和尿酸饲料喂养组小鼠血尿酸水平升高，而基于micro-ct的颌骨大体形态分析并未发现高尿酸血症或尿酸水平升高对牙周炎破坏的加重作用。但必须指出的是该相关技术通过饲料喂养法和结扎法建立的高尿酸血症复合牙周炎的小鼠模型未发现尿酸浓度与牙槽骨吸收的相关性，可能存在以下的原因：①牙周炎模型虽然构建成功但观察时间不够长，在短期内hu对牙槽骨吸收的潜在不利影响未显现；②样本量偏小，个体差异造成的误差掩盖了hu可能存在的不利作用；③血清尿酸水平通过试剂盒的方法进行检测，存在人为误差大的影响，其所得的尿酸水平可能不准确。有鉴于此，此后团队通过氧嗪酸钾联合尿酸的饲料喂养尝试再次建立饲料喂养法诱导的高尿酸症状模型，实验终点取血后通过全自动生化分析仪行血清尿酸水平检测，结果表明氧嗪酸钾联合尿酸饲料喂养组小鼠血清尿酸水平未能升高，即饲料喂养法未能成功建立高尿酸血症模型。这也解释了团队前期建立的“高尿酸血症”小鼠模型为何未能成功加重小鼠牙周炎的骨破坏。综上所述，目前国内外尚无一种成功模拟高尿酸血症加重牙周炎的动物模型报道，因而亟待新的建模方法来建立一种可以模拟高尿酸血症加重牙周炎的动物模型以填补该研究领域的空白。

3、虽然现在关于牙周炎和高尿酸血症各自构建模型的方法都有所探究，但是在高尿酸血症复合牙周炎的小鼠模型构建的这一领域上，目前国内外的报道仍然非常少，且尚无成功的高尿酸血症加重牙周炎的小鼠模型报道。其原因主要有以下方面：1、结扎法诱导的牙周炎模型可导致局部的菌斑堆积进而诱导牙周炎的形成，因其与人类由菌斑作为始动因子的牙周炎的病理进程相似，故而结扎法是目前国际上最为常用的构建动物牙周炎模型的方法，然而对文献的仔细回顾表明，与较大的动物(如大鼠、狗或非人类灵长类动物)相比，结扎诱导的牙周炎模型在小鼠中却很少使用，尽管小鼠代表了最方便、最便宜和最通用的模型。一方面目前结扎诱导牙周炎最常用的方法是利用尖头探针将第二磨牙的牙龈分离，用缝线在龈沟内结扎，其对动物牙龈的损伤较大，且尖锐的操作器械及其容易导致小鼠颊侧牙龈前庭沟的出血，出血严重者会导致血液流入呼吸道而导致小鼠死亡，另一方面由于小鼠相对较小口腔环境也给结扎带来了严峻的技术挑战，因而可能正是这些原因导致了小鼠在结扎诱导的牙周炎中的使用相对较少(小鼠广泛用于牙周炎的口腔感染模型中)。2、由于大鼠、小鼠等实验动物体内存在尿酸酶，因而在中长期的试验中，通过补充外源性尿酸、补充尿酸前体物质以及抑制肾脏尿酸排泄等方法构建的高尿酸血症模型，其尿酸水平不能维持在一个较高的水平，且模型往往不够稳定。近年来，氧嗪酸钾是国际上最常用用来构建高尿酸血症模型的药物，可竞争性地与尿酸酶结合，抑制尿酸酶的活性，使体内血尿酸水平在短时间内增高，并可维持较长的时间，该方法可以短期内成模(两周)，但由于其竞争性抑制的机制，成模后高尿酸血症模型的维持仍需长期给药，给药浓度、频率过低不能较好地维持尿酸水平，给药浓度、频率过高则容易对实验动物肾脏造成较强炎症反应等不良效果，因而在中长期的实验中，摸索合适的给药浓度、频率以维持较高水平的尿酸浓度且又不至于造成动物肾脏较强炎症反应等不良效果就显得尤为重要，而这在国际上仍然没有统一的共识。3、此外更为重要的是高尿酸血症复合牙周炎模型的建立绝不仅仅是高尿酸血症模型和牙周炎模型的简单叠加，根据暴露因素及待研究的科学问题不同(如研究高尿酸血症对牙周炎的影响时，高尿酸时暴露因素；研究牙周炎对高尿酸血症的影响时，牙周炎是暴露因素；而研究两者相互关系时则两者互为危险因素)，结扎时间点及高尿酸血症给药诱导的时间点也相应的会有所不同，结扎时间点和高尿酸血症给药诱导时间点的选择对于高尿酸血症复合牙周炎模型的影响难以预期。

技术实现思路

1、为克服现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型及其建立方法和应用，本发明小鼠模型的建立方法不仅可以在短时间内使尿酸水平升高，且牙周炎模型构建结合温和无伤，有效地建立了模拟高尿酸血症加重牙周炎的小鼠模型，有效填补了高尿酸血症与牙周炎相关研究领域动物模型缺如的空白，在两者关联复杂的病理机制探讨以及高尿酸血症加重牙周炎药物筛选方面有重要意义。

2、为实现本发明的目的，本发明提供了一种模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型的建立方法，包括以下步骤：

3、步骤一：连续向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾7天；

4、步骤二：第7天时通过运用显微持针器将外科丝线结扎在小鼠上颌第二磨牙；

5、步骤三：继续连续向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾7天，建立模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型。

6、作为本发明的一些实施例，在所述步骤三之后还包括步骤四：继续连续向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾14天，以维持高尿酸血症模型的稳定。

7、作为本发明的一些实施例，在所述步骤一和/或所述步骤三和/或所述步骤四中，向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾的频率为每天一次，注射剂量为600mg/kg小鼠/天。

8、作为本发明的一些实施例，在所述步骤一和/或所述步骤三和/或所述步骤四中，向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾包括；轻柔地抓取小鼠并固定于掌心，向小鼠腹腔注射氧嗪酸钾母液；氧嗪酸钾母液的浓度为30mg/ml。

9、作为本发明的一些实施例，在所述步骤二包括：

10、步骤a：将小鼠麻醉固定，暴露上颌磨牙区，清洁上颌磨牙与颊舌侧牙龈，充分干燥；

11、步骤b：将外科丝线固定于鼠板上，使用持针器末端夹持外科丝线，将外科丝线穿过第二磨牙和第三磨牙之间的牙间隙；

12、步骤c：将外科丝线从第二磨牙的颊面远中绕到第二磨牙的颊面近中，夹持外科丝线，将外科丝线穿过第一磨牙和第二磨牙之间的牙间隙；

13、步骤d：使用持针器在第二磨牙的腭侧将外科丝线打结；

14、步骤e：丝线用三个外科结打牢，多余的丝线用弹簧剪刀剪断。

15、作为本发明的一些实施例，在所述步骤a中，所述将小鼠麻醉固定，暴露上颌磨牙包括：将小鼠腹腔麻醉，小鼠腹腔朝上固定于鼠板上；将鼠板倾斜一定的角度然后固定鼠板，采用开口器使小鼠稳定张口，暴露上颌磨牙区，采用头戴式照明灯提供磨牙区视野。

16、作为本发明的一些实施例，所述清洁上颌磨牙与颊舌侧牙龈，充分干燥包括：采用生理盐水清洁上颌磨牙与颊舌侧牙龈，然后采用干棉球充分干燥。

17、作为本发明的一些实施例，所述外科丝线为5-0外科丝线，所述持针器为显微持针器，所述显微持针器型号为w40350。

18、作为本发明的一些实施例，所述小鼠为6-8周龄的雄性c57bl/6小鼠。

19、为实现本发明的目的，本发明还提供了模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型，其由上述任一项方案所述的建立方法得到。

20、为实现本发明的目的，本发明还提供了上述模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型在筛选高尿酸血症加重牙周炎治疗药物中的应用。

21、相对于现有技术，本发明能够取得以下有益效果为：

22、1.本发明有效填补了高尿酸血症加重牙周炎研究中动物模型缺如的空白，首次创新性地模拟了一种高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型，在探讨两者关联复杂的病理机制、筛选高尿酸血症加重牙周炎药物中展现出极大的应用价值，一定程度上拓宽该领域研究的思路及方法；

23、2.本发明中模拟高尿酸血症加重牙周炎的复合小鼠模型的建立只需要14天，构建稳定的高尿酸血症复合牙周炎小鼠模型方法全程只需28天，具有建模效果稳定可靠，建模时间短等优点；

24、3.本发明在成功建立高尿酸血症模型的基础上再通过丝线结扎小鼠上颌第二磨牙诱导牙周炎，在时间序列上是先有高尿酸血症再有牙周炎，从而更能说明高尿酸血症对于牙周炎的加重作用，在建模顺序上更具科学性；

25、4.本发明中以剂量为600mg/kg/d的氧嗪酸钾腹腔注射诱导以及维持高尿酸血症模型，不仅可以使尿酸浓度稳定的保持在较高水平，同时又避免了氧嗪酸钾长期给药所带来的的肾脏炎症反应的弊端；

26、5.本发明中合理的选择氧嗪酸钾给药及结扎的时间点，本发明中的模型在从第14天开始就处于高尿酸血症、牙周炎共存的复合状态，此后通过持续腹腔注射氧嗪酸钾维持高尿酸血症模型的稳定，根据自我研究的需要，可以研究高尿酸血症对不同阶段牙周炎的影响(相关研究表明结扎0-14天为急性期，14-21天为慢性期)。