一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用。

背景技术：

1、肿瘤是影响人类健康的一种重大疾病，随着城市化、工业化的加速，发病率在不断升高，造成沉重的社会和家庭负担。恶性肿瘤治疗难度大、易复发，临床上通常采用手术加化疗或者放射疗法，但是副作用大，耐药性等问题依然困扰着肿瘤患者。特别是脑胶质瘤是最常见的神经系统原发性肿瘤，大多数属于恶性，由于胶质瘤组织大多数呈浸润性生长，与周围正常脑组织边界不清楚，手术很难全切，更容易复发。

2、免疫疗法是近几年出现的一种新的急剧前景的肿瘤治疗手段，pd1/pdl1信号阻断，car-t疗法等在临床上针对部分肿瘤已经取得了很大的成功。但是在实体瘤的治疗中，由于多数肿瘤存在很强的免疫抑制微环境，目前的免疫疗法取得的效果并不理想。

技术实现思路

1、基于目前肿瘤免疫治疗中存在的问题，本发明的目的是：提供了一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用。该抗肿瘤药物为一种高效的肿瘤免疫治疗药物，能够为临床制备治疗脑胶质瘤药物提供了新的有效方法。

2、本发明的技术方案是：

3、一种抗肿瘤药物，将腺相关病毒基因组的两个itr之间的序列去除，在itr之间插入nfil3基因敲低元件和hbv核心蛋白编码基因与肿瘤抗原pep-3编码基因融合形成的hbvc-pep3基因表达元件，同时将6型腺相关病毒衣壳蛋白vp1编码框第663个氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸作为该病毒的衣壳蛋白。

4、进一步，所述的腺相关病毒基因组是2型腺相关病毒基因组。

5、进一步，所述的2型腺相关病毒基因组是2型自互补腺相关病毒基因组。

6、进一步，所述的2型自互补腺相关病毒基因组是将2型腺相关病毒基因组3‘端itr缺失碱基序列形成的，缺失的碱基序列如seq id no.1所示。

7、进一步，所述的nfil3基因敲低元件是靶向nfil3基因的shrna或者microrna表达元件。

8、进一步，所述的shrna表达元件是由poliii启动子、靶向nfil3基因的shrna序列、poliii终止子组成；所述的microrna表达元件是由poliii启动子、靶向nfil3基因的microrna序列、poliii终止子组成。

9、进一步，所述的poliii启动子是u6启动子、h1启动子中的一种，所述的poliii终止子是5-10个t碱基组成的转录终止子。

10、进一步，所述的靶向nfil3基因的shrna序列如seq id no.2所示；所述的靶向nfil3基因的microrna序列如seq id no.3所示。

11、进一步，所述的hbvc-pep3基因表达元件由polii启动子、hbvc-pep3基因、polii终止子组成，polii启动子是cmv、pgk、ef1a、sv40、ubc中的一种，polii终止子是sv40pa、bghpa、tkpa、rgbpa中的一种，hbvc-pep3基因序列如seq id no.4所示。

12、进一步，所述的抗肿瘤药物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

13、本发明的有益效果：

14、本发明将肿瘤抗原直接导入肿瘤微环境中的抗原呈递细胞中，同时给与抗原呈递细胞强免疫刺激，促进其促炎因子的分泌，产生强免疫微环境，从而增强肿瘤特异性抗原呈递，进而更好的激活肿瘤抗原特异性细胞免疫和体液免疫，达到更好的实体瘤免疫治疗效果。

15、由于腺相关病毒（adeno-associated virus）是基因治疗中广泛应用的一种病毒，其安全性的到普遍认可。腺相关病毒分为很多亚型，每种亚型的病毒具有独特的感染细胞偏好性。通过研究发现，在各种亚型的腺相关病毒中6型腺相关病毒对抗原呈递细胞具有最好的感染效率，将6型腺相关病毒衣壳蛋白vp1的第663位氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸后对抗原呈递细胞的感染效率进一步提高。因此在本发明中，采用了第663位氨基酸突变后的6型腺病毒衣壳蛋白用来包装病毒从而实现对抗原呈递细胞的高效导入。腺相关病毒在感染靶细胞后需要经过复制形成双链才能开始表达携带的目标基因，而这一步骤限制了病毒感染细胞后表达目标基因的速度。本发明通过将腺相关病毒3‘端itr缺失一段碱基后可以形成自互补腺相关病毒，加快病毒感染细胞后表达的速度和效率。

16、nfil3是与昼夜节律相关的一个生物钟分子，通过研究发现nfil3以人体很多免疫细胞的功能密切相关，nfil3敲除的巨噬细胞il-12表达水平显著升高，nfil3敲除可以显著增强树突细胞il-12、tnf-α等促炎因子的表达水平。il-12对增强肿瘤免疫微环境具有重要的作用，同时il-12因子还是促进cd4 t细胞向促炎型th1细胞分化的关键因子。这些结果表明通过降低抗原呈递细胞（如巨噬细胞、树突细胞）中的nfil3基因表达水平增强肿瘤微环境中的炎症水平。在很多肿瘤中（比如脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌）egfr受体存在突变，即egfrviii突变，这是一种肿瘤特异性的突变，可以作为肿瘤特异性的免疫原。研究表明人工合成的egfrviii突变区域的一段小肽，即pep-3小肽，可以诱导小鼠可以产生肿瘤特异性免疫反应。但是pep-3小肽自身的免疫原性很低，通过和乙型肝炎病毒hbv核心蛋白（hbvc）融合后用于免疫小鼠可以产生更好的免疫效果。

17、因此在本发明中，同时在腺相关病毒中携带nfil3敲低元件和hbvc-pep3基因表达元件，通过第663位氨基酸突变的6型腺相关病毒衣壳蛋白（aav6 caps663v）包裹该病毒基因组，通过瘤内直接注射从而将这些元件高效的导入到肿瘤微环境中的抗原呈递细胞中。从而实现抗原呈递细胞对肿瘤特异性抗原的高效呈递，并产生强免疫微环境，刺激免疫系统产生更强的肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫，达到更强、副作用更小的肿瘤清楚效果。

18、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。

技术特征：

1.一种抗肿瘤药物，其特征在于，将腺相关病毒基因组的两个itr之间的序列去除，在itr之间插入nfil3基因敲低元件和hbv核心蛋白编码基因与肿瘤抗原pep-3编码基因融合形成的hbvc-pep3基因表达元件，同时将6型腺相关病毒衣壳蛋白vp1编码框第663个氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸作为该病毒的衣壳蛋白。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的腺相关病毒基因组是2型腺相关病毒基因组。

3.如权利要求2所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的2型腺相关病毒基因组是2型自互补腺相关病毒基因组。

4.如权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的2型自互补腺相关病毒基因组是将2型腺相关病毒基因组3‘端itr缺失碱基序列形成的，缺失的碱基序列如seq id no.1所示。

5.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的nfil3基因敲低元件是靶向nfil3基因的shrna或者microrna表达元件。

6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的shrna表达元件是由poliii启动子、靶向nfil3基因的shrna序列、poliii终止子组成；所述的microrna表达元件是由poliii启动子、靶向nfil3基因的microrna序列、poliii终止子组成。

7.如权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的poliii启动子是u6启动子、h1启动子中的一种，所述的poliii终止子是5-10个t碱基组成的转录终止子。

8.如权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的靶向nfil3基因的shrna序列如seq id no.2所示；所述的靶向nfil3基因的microrna序列如seq id no.3所示。

9.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的hbvc-pep3基因表达元件由polii启动子、hbvc-pep3基因、polii终止子组成，polii启动子是cmv、pgk、ef1a、sv40、ubc中的一种，polii终止子是sv40pa、bghpa、tkpa、rgbpa中的一种，hbvc-pep3基因序列如seqid no.4所示。

10.权利要求1-9任意一项所述的抗肿瘤药物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用，该抗肿瘤药物是将AAV病毒基因组ITR之间序列去除后，插入Nfil3基因敲低元件和HBVc‑PEP3基因表达元件，并将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1编码框的第663位氨基酸突变成缬氨酸后作为该病毒的衣壳蛋白。从而增强肿瘤特异性抗原呈递，进而更好的激活肿瘤抗原特异性细胞免疫和体液免疫，达到更好的实体瘤免疫治疗效果。

技术研发人员：张伟锋,赵婧伊,柳玲玲,李星
受保护的技术使用者：陕西师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15