一种新型块状异种骨修复材料的制备方法与流程

本发明属于材料的制备方法领域；尤其涉及一种新型块状异种骨修复材料的制备方法。

背景技术：

1、对于人体来说，很多因素均会导致颌骨骨量缺损、不足等问题。例如：创伤、感染、肿瘤切除、先天性疾病等，不仅会对人体面部形态以及功能造成不良的影响，也会增加缺损牙种植与修复的难度。对于需要进行口腔种植修复的患者，充足的骨量是获得良好功能和美学效果的前提，因此，当牙槽嵴出现严重水平向骨缺损或同时伴有垂直向骨缺损，需进行骨增量修复。

2、自体骨因具备良好的成骨性、骨传导性和骨诱导性等特点，被认为是植骨材料的“金标准”。但是，自体骨移植术在临床实践中经常需要开辟第二术区，若选取口内供区，可用骨量非常有限；若选取口外供区，还有造成额外并发症的风险。与自体骨性能最为接近的是同种异体骨，近些年来，块状同种异体移植物通常用于修复牙槽嵴高度的缺陷或严重的牙槽嵴萎缩，以便为植入物提供足够的骨量。但也存在伦理、免疫原性反应等方面的问题。并且同种异体骨骨块受限于材料不一：如年轻与老年，男性与女性，以及材料供应量的问题，造成产能受限，吸收不一，最终导致临床效果不稳定。

3、因此，为了解决骨移植的问题，开发骨替代材料的研究是非常必要的，其中，动物来源的异种骨因其来源广泛不受限制，制造成本较低，易于获得和加工等优点，而被广泛用于研究。但是，动物源性的骨材料对于人体而言，属于异种材料，具有很强的免疫排斥问题。异种骨的抗原主要位于骨的有机质中，因此，去除有机质是消除异种移植骨中抗原性不可或缺的过程。在异种骨的除抗原处理过程中，需除去有机成分，如脂肪和蛋白等，目前常用方法是高温煅烧法和有机试剂法，但均存在以下不足。

4、高温煅烧法，虽然能完全去除有机物质，但是会导致骨矿物结构会发生显著变化，如结晶度升高、孔隙率降低等，进而导致骨质材料性能发生显著变化。另外异种骨材料中碳酸根具有调节材料降解的功能，而高温煅烧会导致碳酸根的分解，进一步导致了材料在体内不能降解。

5、有机试剂法，目前常用的方法为分步法，分别去除脂肪和蛋白，即先脱脂肪，再脱蛋白。最具代表性的工艺是bio-oss产品，是利用分步法脱除有机成分(脂肪和蛋白)，具体为：利用有机溶剂甲苯脱除脂肪，脱脂完成后，再用乙二胺脱除蛋白。其中脱蛋白是利用乙二胺和水形成共沸混合物，由于乙二胺脱蛋白效果与作用温度成正相关，温度越高作用越强，而乙二胺和水混合物沸点低，导致骨粉在乙二胺水溶液中需要沸腾50h，此种方法存在工期时间长、成本高、效率低下等弊端。

6、目前，常用的异种骨产品多为颗粒状，当牙槽骨有严重、明显的水平及垂直向骨缺损时，在进行骨增量修复时，剩余牙槽嵴无法为颗粒状骨移植材料提供足够的固位形，易造成颗粒植骨材料的移位、空间塌陷，无法维持良好的成骨空间。而块状骨移植能够起到良好的空间支持效果，且其稳定性有利于完成血管化和“爬行替代”，具有不可替代的优势。

7、针对以上问题，需要进一步改进工艺，制备一种令人满意的无免疫原性、保留天然骨结构的块状的异种骨修复材料。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种新型块状异种骨修复材料的制备方法。

2、本发明提供一个异种块状骨移植材料的高效制备方法。利用以下配比：10％-20％乙二醇单甲醚、10％-30％正丁醇和50％-80％乙二胺共沸混合液，或者10％-30％乙二醇单甲醚、20％-30％异丁醇和40％-70％乙二胺共沸混合液。利用有机溶剂与脂肪相似相溶去除脂肪以及及乙二胺的氨基与蛋白的酰胺键反应去除蛋白的原理，同步去除有机成分(脂肪和蛋白)；另外，其沸点较乙二胺与水混合物沸点明显提高，增强了脱蛋白效果，其中乙二醇单甲醚兼具提高沸点作用。本工艺显著缩短了工艺时间、降低了生产成品，提高了效率。

3、本发明方法再通过250-350℃煅烧，煅烧固化以提高骨修复材料抗压强度，另外使微孔(＜10um)结构显现，又避免高温煅烧的弊端(结晶度、孔隙率)。使其保留了天然的类似人骨的多孔隙三维空间结构和高度类似的相组成，同时具有高比表面积、低免疫原性、安全性高、良好生物相容性等优点，完美克服了颗粒骨移植材料存在空间塌陷、无法维持成骨空间等问题。

4、本发明是通过以下技术方案实现的：

5、本发明涉及一种新型块状异种骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

6、步骤1，用锯骨机切取牛股骨骨骺远端松质骨部位，用锯骨机去除片状松质骨周围的附属组织，再切割成(5～10)×(5～10)×(5～30)mm的骨块。

7、步骤2，所述消毒的具体步骤为：将选好的块状骨放入洁净容器，加2-5倍量(块状骨与乙醇的质量体积比为1:(2-5)，如：骨块是100g，乙醇是200-500ml。)的75％乙醇，浸泡30分钟，沥干；(2)再将骨块放入洁净容器中，称取15倍量(块状骨与纯化水的质量体积比为1:15)的纯化水，加入容器中；(3)超声清洗3次，每次10分钟；该步骤是在乙醇溶液中进行浸渍，当将骨块浸入乙醇溶液中时，乙醇具有较强的挥发性，能够吸收细菌蛋白的水分，使之脱水凝固，从而达到杀死细菌的目的；同时乙醇能够溶解骨组织表面的脂肪组织，起到部分脱脂的作用。

8、步骤3，脱脂脱蛋白：所述脱脂脱蛋白的具体步骤如下：取消毒后的块状骨，放入抽提设备的烧瓶内再加入乙二胺与乙二醇单甲醚、正丁醇、异丁醇的共沸混合物；索氏抽提5-7h；脱脂脱蛋白完成后，将骨块放入洁净容器中称重，再加入20倍量(块状骨与75％乙醇的质量体积比为1:20)的75％乙醇，超声清洗3次，每次10分钟。再流水状态下清洗2h，至偏中性；将骨块在烘箱中90℃干燥4h。该步骤所涉及的脱脂脱蛋白是从骨骼中去除有机相的重要过程。有机成分的保留，增大了免疫原性的风险。高温煅烧法虽然能完全去除有机物质，但是会导致骨矿物晶体结构会发生显著变化，如结晶度、孔隙率等，进而导致骨质材料性能发生显著变化。另外异种骨材料中碳酸根具有调节材料降解的功能，而高温煅烧会导致碳酸根的分解，进一步导致了材料在体内不能降解。

9、有机试剂法，目前常用的方法为分步法，分别去除脂肪和蛋白，即先脱脂肪，再脱蛋白。最具代表性的工艺是bio-oss产品，是利用分步法脱除有机成分(脂肪和蛋白)，具体为：利用有机溶剂甲苯脱除脂肪，脱脂完成后，再用乙二胺脱除蛋白。其中脱蛋白是利用乙二胺和水形成共沸混合物，由于乙二胺脱蛋白效果与作用温度成正相关，温度越高作用越强，而乙二胺和水混合物沸点低，导致骨粉在乙二胺水溶液中需要沸腾50h，此种方法存在工期时间长、成本高、效率低下等弊端。

10、为解决免疫原性的风险，又不改变骨的成分结构，本发明提供一个异种块状骨移植材料的高效制备方法。利用乙二胺与乙二醇单甲醚、正丁醇或异丁醇形成的共沸混合液，利用有机溶剂与脂肪相似相溶去除脂肪以及乙二胺的氨基与蛋白的酰胺键反应去除蛋白的原理，同步去除有机成分(脂肪和蛋白)；另外，其沸点较乙二胺与水混合物沸点明显提高，增强了脱蛋白效果。本工艺显著缩短了工艺时间、降低了生产成品，提高了效率。

11、步骤5，煅烧：骨是由有机物和无机物构成，有机物决定其韧性，无机物决定其硬度。当有机成分被脱除后，无机盐成分之间结合较为松散、力学强度降低。需进行增强力学强度，仅以低温煅烧加以固化，增加骨材料机械强度。随后的降温过程中应避免将骨块从马弗炉中突然取出并冷却，以免形成“冷桥”，导致煅烧骨结构失去坚固性。通过闭炉方式降低马弗炉内的温度来慢慢冷却骨材料，将会更为有利。其中，所述缓慢冷却的步骤包括冷却大约24小时以防止应力、裂纹或脆性；煅烧温度为250-350℃，煅烧时间为10-20h。

12、本发明所涉及的煅烧步骤为必不可缺少的工序，本发明煅烧温度为250-350℃，才能达到本发明目的；如煅烧温度低于250℃，固化效果不佳，力学降低，导致骨材料抗压性较差。另外会导致残留的微量蛋白无法分解，使得微孔(＜10um)无法显现，而微孔结构功能是利于生长因子黏附和富集、体液渗透、吸收降解，微孔结构无法显现将影响材料毛细虹吸性能、亲水性能、影响降解速率。另外微孔结构还决定了材料的比表面积，较大的比表面积，增大了材料与细胞、体液的接触面积，有利于骨细胞黏附生长，微孔量降低，将导致比表面积降低。

13、如煅烧温度高于350℃，将导致晶体生长，使得天然骨的孔隙率下降，结晶度升高。结晶度升高，将直接影响降解速率，结晶度越高越难以降解，导致降解速率与新骨生长速率无法匹配。低孔隙率将影响细胞生长和迁移、营养输送、和血管化。

14、综上所述，本发明方法煅烧温度为250-350℃，高于或低于该温度范围均不能达到本发明最终的技术效果。

15、步骤6，干燥：骨材料清洗后，必须进行干燥，便于进行保存。将清洗后的骨材料，置于90℃烘箱中干燥4-5h。

16、步骤7，将上述干燥后的骨块，包装、封装、灭菌即可。

17、本发明具有以下优点：

18、(1)本发明提供一个异种块状骨移植材料的高效制备方法，利用乙二胺与乙二醇单甲醚、正丁醇或异丁醇形成的共沸混合物，利用有机溶剂与脂肪相似相溶去除脂肪以及乙二胺的氨基与蛋白的酰胺键反应去除蛋白的原理，同步去除有机成分(脂肪和蛋白)；另外，其沸点较乙二胺与水混合物沸点明显提高，增强了脱蛋白效果，其中乙二醇单甲醚兼具提高沸点作用。本工艺不仅显著缩短了工艺时间、降低了生产成品，提高了效率，更能有效地去除有机质，去除了免疫原，解决免疫原性的风险；而且又保留骨质的天然结构，保障了骨体中的磷灰石晶体结晶度无显著影响；还避免因高温煅烧而导致的结构和功能的变化。另外，块状骨移植与颗粒骨移植材料相比，能够起到良好的空间支持效果。

19、(2)本发明所涉及的方法为一种高效脱脂脱蛋白方法；该方法制备得到的产品，不仅结构具有天然的类似人骨的多孔隙三维空间结构和高度类似的相组成；而且具有高比表面积、低免疫原性、安全性高、良好生物相容性等优点。

20、(3)本发明所涉及的方法为一种异种块状骨移植材料的制备方法，使其克服颗粒骨移植材料存在空间塌陷、无法维持成骨空间等问题。