双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶及其在抗菌方面的应用

本发明属于水凝胶，具体涉及一种双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶及其在抗菌方面的应用。

背景技术：

1、由细菌和真菌引起的创面细菌感染以及炎症反应正在严重威胁人类的生命安全。为了解决细菌感染所造成的一系列疾病，大量的抗生素被研制出来，但由于近年来抗生素的过度使用或使用不当导致了多种耐药微生物的出现。因此，当务之急是开发抗菌生物材料，将其在某些情况下作为抗生素的替代品以缓解或解决当前细菌耐药性的问题。在各种抗菌材料中，抗菌水凝胶由于其具有制备工艺简单、结构多样以及优异的生物相容性和抗氧化性等多种特定功能，可以替代抗生素治疗细菌感染性疾病，因而吸引了越来越多的关注。

2、水凝胶是由亲水聚合物链通过物理作用或共价键交联而形成的具有三维网状结构的新型高分子材料。无论是由天然的还是合成的聚合物形成的水凝胶，它们的三维网络结构都能够吸收大量的水分且溶胀至平衡后还能保持一定量的水分，并保持原有的结构和性能而不溶解于水。由于其具有良好的生物相容性、生物降解性、可调节的机械性能、高含水量、控制组织黏附、维持伤口部位的潮湿环境以及作为细菌渗透的物理屏障等优点，水凝胶在伤口愈合方面具有很大的优势。因此，水凝胶敷料近年来逐渐成为一种新型医用敷料。其中抗菌水凝胶所表现出的抗菌功能则是我们目前在医药领域最需要的。抗菌水凝胶由于表现出良好的抗菌活性并可以为伤口提供潮湿、大量水合的环境，能够有效的抑制病人创伤面细菌等微生物的生长，进而可以有效地降低伤口发生感染的几率，因此广泛适用于医用植入器械涂层和皮肤感染治疗，以代替传统的抗生素进行细菌感染治疗，从而可以很大程度缓解和消除细菌耐药性等问题。

3、缩氨基硫脲是由氨基硫脲(nh2-nh-cs-nh2)与醛或酮缩合而成的一类具有广泛生物活性的化合物。由于缩氨基硫脲化合物的结构中含有n、s等杂原子，因此其具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、寄生虫等多种生物活性。近年来，各种缩氨基硫脲类化合物被研究出来，其中杂环类缩氨基硫脲类化合物由于其具有很好的生物活性而受到了广泛的关注。经大量的研究表明，缩氨基硫脲化合物的生物活性对取代基具有很高的依赖性，通过改变醛酮的结构或在通过对n4位取代基的优化可获得具有不同生物活性的化合物，使它的抗菌、抗癌活性得到改善。

4、本发明围绕细菌感染影响伤口愈合的问题，开发出具有良好生物相容性、高效抗菌性能的抗菌水凝胶。本发明利用两种双氨基硫脲配体负载在叶酸水凝胶上合成两种新型水凝胶，叶酸(fa)分子中的两个羧基和聚多巴胺(pda)中的邻苯二酚很容易与zn2+形成金属配合物，其中聚多巴胺修饰的叶酸材料与双氨基硫脲配体之间发生静电相互作用和氢键作用。经实验验证可知，相比未负载配体的空白水凝胶和单独的配体，负载配体的水凝胶抗菌效果显著提升。且负载hl2的水凝胶比负载hl1的水凝胶具有更高的抗菌活性。本发明随后又进行mtt细胞毒性测试，试验结果表明该水凝胶细胞毒性较小，并通过细胞膜完整性、蛋白质渗漏、活性氧(ros)的产生等实验探究了其可能的抗菌机理。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶，该水凝胶具有良好的生物相容性、优异的抗菌性能，且制备方法简便。

2、本发明还提供了上述双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶的制备方法及其在抗菌方面的应用。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：

5、1）将叶酸（fa）与水、碱混合，获得溶液a；

6、2）将配体hl1和/或hl2与盐酸多巴胺（da）混合后，加入到碱液中，然后加入二甲亚砜，搅拌反应20-40min进行自聚pda，获得溶液b；

7、3）将溶液a和溶液b混合，获得溶液c；

8、4）将可溶性锌盐溶液与溶液c混合，即得。

9、本发明所述双氨基硫脲修饰的可注射的叶酸偶联聚多巴胺水凝胶，fa分子中的两个羧基和聚多巴胺（pda）中的邻苯二酚很容易与zn2+形成金属配合物，其中聚多巴胺修饰的叶酸材料与双氨基硫脲配体之间发生静电相互作用和氢键作用。

10、步骤1）具体可以为：将0.1-0.4 g叶酸与4 -8 ml蒸馏水以及0.05-0.10 g氢氧化钠混合搅拌，获得溶液a。

11、具体的，步骤2）中，所述配体hl1为2,6-二乙酰吡啶双缩氨基硫脲，所述配体hl2为2,6-二乙酰吡啶-n4-甲基缩氨基硫脲。

12、进一步的，所述配体hl1与盐酸多巴胺的质量比为1:1；所述配体hl2与盐酸多巴胺的质量比为1:1-2。

13、具体的，盐酸多巴胺用量为0.02-0.04 g，二甲基亚砜用量为15-30 μl。

14、进一步的，步骤4）中，所述可溶性锌盐为醋酸锌，可溶性锌盐溶液浓度为0.17-0.30mol/l。

15、具体的，可溶性锌盐溶液与溶液c按体积比1：0.8-1.5混合。

16、进一步的，步骤1）和步骤2）中，所述碱为氢氧化钠，所述碱液为浓度1-2mol/l的氢氧化钠水溶液。

17、本发明提供了采用上述制备方法制备得到的双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶。

18、本发明还提供了上述双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶在抗菌方面的应用。

19、本发明提供了一种优选的双氨基硫脲修饰的可注射叶酸偶联聚多巴胺水凝胶的制备方法，具体如下：

20、1）将0.1-0.4 g叶酸与4 -8 ml蒸馏水以及0.05-0.10 g氢氧化钠混合搅拌10min，获得透明砖红色溶液a；

21、2）将配体hl1、hl2与0.02-0.04 g盐酸多巴胺混合（可用超声辅助溶解）后，加入到1-2 ml的1 mol/l氢氧化钠水溶液中，然后加入15-30 μl二甲基亚砜（dmso）作为催化剂，搅拌反应20-40min进行自聚pda，获得黑色溶液b；

22、3）将溶液a和溶液b混合，获得红褐色溶液c；

23、4）将浓度0.17-0.30mol/l的无色透明的醋酸锌溶液按体积比1：0.8-1.5与溶液c混合，即得。

24、叶酸水凝胶是通过交联过渡金属离子(即zn2+)、多巴胺(da)和叶酸(fa)，合成一种可注射的fa/pda水凝胶。这种可注射的水凝胶可以匹配伤口形状，且对金黄色葡萄球菌(典型革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(典型革兰氏阴性菌)均有较好的抗菌效果。此外，这种水凝胶可以在12天内释放锌离子，从而产生持续的抗菌效果。因此，这种抗菌水凝胶在重建细菌感染的组织，特别是暴露的伤口方面具有很大的潜力。缩氨基硫脲具有良好的抗菌活性，本发明将配体hl1=2,6-二乙酰吡啶双缩氨基硫脲；hl2=2,6-二乙酰吡啶-n4-甲基缩氨基硫脲修饰叶酸水凝胶可以得到两种，其抗菌效果优于单独物质抗菌水凝胶。

25、本发明所述复合水凝胶制备过程中，第一个步骤包括将聚多巴胺溶液与叶酸溶液混合。第二个步骤是可以在超声的协助下，将配体氨基硫脲化合物加入到聚多巴胺溶液中，通过超声溶解形成聚多巴胺/氨基硫脲混合溶液。第三个步骤是zn2+与叶酸和聚多巴胺配位凝胶化。由于水凝胶破坏细菌细胞膜的完整性细胞膜，使发生细胞胞内组织外流，很有可能会导致细菌的死亡。其次，细菌细胞中过量活性氧(ros)会引起一系列的氧化应激反应而引起细菌死亡。本发明所制备的水凝胶负载不同双缩氨基硫脲后，形成的复合水凝胶材料具有杀菌效果以及较小的细胞毒性，提高了水凝胶的实际抗菌效能。。本发明又进行噻唑蓝比色法(mtt)细胞毒性测试，表明该水凝胶细胞毒性较小；并通过细胞膜完整性、蛋白质渗漏、活性氧(ros)的产生等实验探究了可能的抗菌机理。

26、本发明公开报道了将两种双氨基硫脲配体负载在叶酸水凝胶上合成两种新型水凝胶。考虑到氨基硫脲的优良生物学活性以及聚多巴胺修饰叶酸水凝胶可注射特性，合理地假设所得的复合水凝胶具有双重优势，既有高效的抑菌性又有优良的可注射性能，同时具有较好的细胞活性，将氨基硫脲负载到聚多巴胺修饰的叶酸并添加zn2+进行配位凝胶化的复合水凝胶，然后将复合水凝胶进行抗菌测试以及细胞相容性探究。

27、本发明通过将da与hl进行混合自聚，产生了hl/pda溶液；随后将上述溶液与fa溶液混合得到fa/hl/pda溶液，再采用一步合成法，将zn2+溶液与fa/hl/pda溶液混合配位得到fa/hl/pad水凝胶，分别对大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、根瘤农杆菌、枯草芽孢杆菌等的抑菌效力进行了评价，并对其作用机理进行了探究，又进行了细胞活性测试。和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

28、1）本发明首次开发了一种引入过渡金属离子zn2+作为配位离子进行凝胶化，并在水凝胶中添加高效的抗菌配体，从而构建一类新颖绿色的双氨基硫脲修饰的可注射的叶酸偶联聚多巴胺水凝胶合成策略；

29、2）本发明所选用的叶酸fa是一种人体必需的天然物质，具有抗肿瘤作用和g-四重形成特性。此外，另一种天然物质多巴胺（da）及其聚合物形式的聚多巴胺（pda）在组织工程学和其他生物医学领域有着广泛的应用。由于pda具有高度反应活性的邻苯二酚基团，常被用于制备具有自愈功能的水凝胶，锌离子（zn2+）表现出优异的抗菌性能以及协同和组织修复能力，双氨基硫脲具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疟等，因此合成的复合水凝胶具有抑菌性、可注射性、促进伤口愈合等优良的性质，为制备由过渡金属离子(zn2+)，交联双氨基硫脲配体(hl)、多巴胺(pda)和叶酸(fa)合成了一种可注射的复合水凝胶提供了现实基础；

30、3）本发明制备的复合水凝胶具有较高杀菌效率和良好的生物相容性，能够在一定时间内保持高效的治疗效果；

31、4）本发明制备的双氨基硫脲修饰的可注射的叶酸偶联聚多巴胺水凝胶对革兰氏阳性和菌革兰氏阴性菌具有一定的抗菌效力，并探究比较了一系列不同配体与聚多巴胺比例的水凝胶的抗菌活性。本发明对其可能的抑菌作用机制进行了系统阐明。本发明的复合水凝胶在生物医学领域将有着很大的应用前景；

32、5）本发明制备的双氨基硫脲修饰的可注射的叶酸偶联聚多巴胺水凝胶的具有可注射性，能完美贴合伤口，在伤口快速修复领域也有应用前景。