一种高精度光固化3D打印丝素蛋白基生物墨水

本发明涉及一种高精度光固化3d打印丝素蛋白基生物墨水，属于生物。

背景技术：

1、生物3d打印技术能够将细胞、生物材料和生物活性分子以精确的方式进行组装，从而为生物医学和临床应用创造复杂的三维(3d)组织结构。生物墨水和生物打印机是生物3d打印结构的关键要素，而强度、分辨率(精度)和形状等重要因素取决于制造方法(墨水打印精度取决于制造方法)。生物3d打印技术可分为喷墨打印、挤出打印(如熔融沉积fdm和墨水直写diw)、光固化打印(如立体光固化成型sla和数字光处理dlp)。喷墨生物打印类似于传统的二维喷墨打印，精度高但难以实现三维立体结构。挤压式生物打印机是通过对喷墨打印机进行改进而开发的，它使用气泵或螺旋柱塞来挤出生物墨水，其明显的缺点是打印精度较低，且对材料的自支撑性能要求较高。相比之下，光固化打印除了具有较高的打印精度外，dlp面成型的方法打印速度快，对细胞损伤较少，从而使细胞生长良好。

2、由于dlp光固化3d打印技术的控制原理简单、使用的材料生物相容性较高、打印条件温和、能够构建复杂的微小组织结构等原因，十分适合生物3d打印。而这一技术的应用与发展对打印材料也提出了更高的要求，不仅要满足光固化性能的要求，固化后还要具有一定的机械强度，以及能够支持细胞生长、增殖和黏附等过程的生理环境，因此光固化生物墨水的研发十分重要。

3、常用的光固化生物材料一般分为天然生物材料、合成生物材料和复合生物材料。其中天然生物材料包括甲基丙烯酸明胶(gel-ma)、硫醇-烯明胶、丝素蛋白等。合成生物材料有聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)、聚碳酸酯丙烯酸酯及其衍生物。一般使用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂(lap)、i2959等作为光引发剂。在众多类型的光交联生物材料中，选择dlp生物打印墨水必须考虑以下标准：(1)生物材料组成和3d打印机设置的光学特性，以确保能够达到最佳打印条件；(2)适当的聚合机制，以实现预期生物应用所需的水凝胶特性；(3)生物降解特性和生物相容性，以确保适当的组织再生速率而不产生有害的副产物；(4)成型材料的机械性能；(5)最终打印结构的稳定性。

4、常用的生物墨水中，胶原蛋白、明胶或纤维蛋白等天然水凝胶具有固有的信号分子，有利于细胞粘附。然而，它们的力学性能普遍较弱。相比之下，合成材料如聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)等材料虽机械性能可调，但缺乏促进细胞粘附和迁移的生物活性分子，以及酶介导的降解和再生。所以可以对天然或合成材料都进行官能团改性，以实现交联并稳定光固化墨水材料。

5、丝素蛋白(sf)是一种从家蚕茧中提取的天然蛋白质，可以通过各种制造技术(旋涂、静电纺丝、冷冻干燥、物理或化学交联)重构成不同的材料形式，包括薄膜、水凝胶和海绵等。同时，sf具有生物降解性、生物相容性和可调的机械强度，以及高抗拉强度，适用于组织工程(3d支架、伤口敷料)、癌症治疗(模拟肿瘤微环境)、控释药物(基于sf的复合物)、骨、眼和皮肤再生等多种应用场景。sf可以通过化学修饰(如偶联反应、氨基酸修饰和接枝反应)与各种材料结合，例如向材料的含胺侧基中添加甲基丙烯酸酯基团可使其轻聚合成水凝胶。还可以通过改变甲基丙烯酰化的程度和接枝位置来控制材料的降解速率。将sf与甲基丙烯酸进行反应可制备具有光敏特性的dlp生物3d打印生物墨水。但sf二级结构的不稳定性，使其在制备过程中容易自凝胶或改性失败，需进一步改善其制备方法，完善制备体系，提高墨水稳定性。

6、专利cn 109999226a一种打印材料、负载干细胞的骨组织工程支架及制备方法，包括油溶性高分子材料、生物陶瓷粉体、油性溶剂、水溶性生物活性材料、水、乳化剂、水凝胶和种子细胞，利用上述组分制成打印墨水ⅰ和打印墨水ⅱ，将打印墨水转移到挤出式打印机中的墨盒ⅰ和墨盒ⅱ，由挤出式打印机的喷头ⅰ和喷头ⅱ将打印墨水ⅰ和打印墨水ⅱ挤出打印成型，得到骨组织工程支架。本发明具有良好的生物相容性、生物活性、溶剂可去除性以及种子细胞同步负载性等方面的优势。但采用常温至低温3d打印，虽可有效保持细胞在打印过程中的活性，但打印出的支架精度低。

7、专利cn 114075339a提出了一种光固化3d打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，结合了丝素蛋白和透明质酸的优异特性，通过控制透明质酸-甲基丙烯酸酯和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯预聚物溶液的混合比例以及乙醇处理，使墨水具有良好的生物相容性以及可调节的降解性。结合3d打印技术提高打印精度。但两种主体材料改性的制备步骤复杂繁琐，且醇溶液进行的后处理可能会改变生物墨水的结构。

8、soon等人常用的制备丝素蛋白光固化墨水sil-ma材料的方法是：用na2co3溶液将蚕茧除去丝胶，然后洗涤干燥得到脱胶茧。将脱胶茧在溴化锂(libr)溶液中加热搅拌至完全溶解，然后水解，再将gma(2,4,6,10ml)在丝素蛋白溶液中加热搅拌均匀，经4℃透析3-4天后(或室温25℃连续透析24-48h)，将丝素蛋白溶液离心除去不溶的聚集体，之后过滤、离心，冻干得到sil-ma，-80℃冷冻保存备用。在实际制备中，受温度环境及人为操作的影响较大，并不能每次都能制备出可打印的sil-ma墨水，需提高sil-ma墨水制备的稳定性。

9、综上，仍需寻找一种新的高精度光固化3d打印生物墨水的制备方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种兼具高精度和高稳定性的光固化3d打印丝素蛋白基生物墨水的制备方法，所述墨水以丝素蛋白为主要原料，采用新方法制备改性后的甲基丙烯酸酯化丝素蛋白即sil-ma，以一定比例混合sil-ma、光引发剂和光吸收剂得到稳定的光固化打印生物墨水，同时优化dlp光固化3d打印技术的打印参数和后处理方发制备高精度生物支架。

2、本发明的第一个目的是提供一种高精度光固化3d打印丝素蛋白基生物墨水，生物墨水中包括甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、将经过脱胶处理的蚕丝溶解，透析；

4、s2、对透析后的丝素蛋白溶液进行浓缩，浓缩时间保持在6-8h，使丝素蛋白的终浓度达到9-15％；

5、s3、向浓缩后的丝素蛋白溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行反应，反应结束后再次透析，分离得到甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白。

6、进一步地，在步骤s1中，所述的透析分为两步：(1)在1-5℃下透析2-4天，静止透析时，透析袋内盛置溶解得到的丝素蛋白盐溶液，膜外透析液为去离子水，期间按需要进行换水；(2)在室温下进行连续透析10-14h，连续透析时，以经过第一步透析后的溶液为待透析液，以去离子水为透析水，用量90-110l左右即可，全程无需换水，透析过程中袋外水分子透进袋内，最终使丝素蛋白盐溶液转变为丝素蛋白水溶液，为后续改性提供水溶液环境。

7、进一步地，在步骤s1中，采用溴化锂、氯化钙-水-乙醇制备的三元溶剂、氯化钙-甲酸混合溶液中的至少一种溶解蚕丝。

8、进一步地，静止透析和连续透析时，透析袋的截留分子量为12-14kd。

9、进一步地，在步骤s3中，甲基丙烯酸缩水甘油酯与丝素蛋白溶液的体积比为1-10：90-110。

10、进一步地，生物墨水中还包括光引发剂和光吸收剂。

11、进一步地，生物墨水中，按质量百分比计，各组分的含量为：甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白10-30％、光引发剂0.1-0.5％、光吸收剂0.05-0.15％。

12、进一步地，所述光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)、irgacure2959、eosiny、核黄素中的一种或几种。

13、进一步地，3d打印时，固化时间为30-60s。

14、进一步地，3d打印时，光照强度为10-30mw/cm2。

15、本发明的第二个目的是提供上述高精度光固化3d打印丝素蛋白基生物墨水在组织工程中的应用。

16、本发明的有益效果：

17、(1)常用的sil-ma制备方法在丝素溶液溶解后直接加入了gma进行改性，而本发明的制备方法在丝素溶液溶解并透析后再加入了gma进行改性。经验证，本发明的制备方法得到的产品更稳定，每次均可得到性能稳定的sil-ma材料用于打印，利于提高3d打印墨水的制备的稳定性；二是本发明的方法制备的sil-ma材料强度更高，利于提高3d打印墨水的精度。

18、(2)在sil-ma制备方法改进的基础上，本发明又通过改善sil-ma生物墨水的混合比例，加以适当的后处理，结合dlp光固化打印快速精确成形，提高了打印精度和制备的稳定性。