非洲猪瘟病毒D129L基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及非洲猪瘟病毒d129l基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染引起的家猪和欧亚野猪的一种热性出血性传染病，发病率和病死率可高达100％，是全球养猪业的头号疫病或首要威胁，可造成重大经济损失。目前全球尚无安全有效的非洲猪瘟疫苗，尽管一些企业或研究机构力推基因缺失活疫苗，但经过临床试用和大面积安全性评价，证明非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗存在重大生物安全问题。因此，安全有效的非洲猪瘟疫苗仍是非洲猪瘟防控面临的重要课题。

2、非洲猪瘟病毒是一种大的复杂的虫媒dna病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属中的唯一成员。根据其主要衣壳蛋白p72基因3’端核苷酸序列的差异，迄今可将其分为24个基因型。非洲猪瘟病毒的结构由外向内可分为外部囊膜、衣壳、内部囊膜、核心壳和核这5层，病毒基因组长170～193kb，编码蛋白150种以上，其中结构蛋白68种以上。目前尚不清楚非洲猪瘟病毒的保护性抗原为哪种或哪几种，病毒基因组中大部分基因的功能尚不清楚，这种结构和功能上的复杂性和未知性给非洲猪瘟疫苗的研制带来了很大困难。除了上面提到的基因缺失活疫苗存在的生物安全问题以外，目前正在研究的非洲猪瘟疫苗还包括灭活疫苗、亚单位疫苗和重组载体疫苗等，这些疫苗候选株的安全性应该没有太大的问题，但是其效力均尚不如意，迄今没有一种安全有效的疫苗上市。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何预防非洲猪瘟。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：

3、a1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；

4、a2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；

5、a3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；

6、a4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；

7、所述蛋白质可为下述任一种：

8、b1)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

9、b2)将seq id no.2的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性(同源性)且具有相同功能的蛋白质；

10、b3)在b1)或b2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

11、所述蛋白质可为病毒蛋白，名称为pd129l。

12、所述蛋白pd129l可来源于非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)。

13、进一步地，所述蛋白pd129l可来源于非洲猪瘟病毒sy18株，也可来源于其他非洲猪瘟病毒自然分离株和人工致弱株。

14、所述蛋白pd129l是非洲猪瘟病毒复制必需的蛋白，缺失该蛋白后病毒不能复制组装成完整的病毒颗粒。所述蛋白pd129l在细胞内具有复制的开关功能。

15、为了使b1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

16、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

17、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质pd129l的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质pd129l的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质pd129l且具有蛋白质pd129l功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

18、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

19、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

21、本发明还提供了与所述蛋白质pd129l相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

22、c1)在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用；

23、c2)在制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用；

24、c3)在制备抑制非洲猪瘟病毒复制的产品中的应用；

25、c4)在制备用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖或培养的产品中的应用；

26、所述生物材料可为下述d1)至d6)中的任一种：

27、d1)编码所述蛋白质pd129l的核酸分子；

28、d2)抑制或降低所述蛋白质pd129l的编码基因功能的核酸分子；

29、d3)含有d1)和/或d2)所述核酸分子的表达盒；

30、d4)含有d1)和/或d2)所述核酸分子的重组载体、或含有d3)所述表达盒的重组载体；

31、d5)含有d1)和/或d2)所述核酸分子的重组微生物、或含有d3)所述表达盒的重组微生物、或含有d4)所述重组载体的重组微生物；

32、d6)含有d1)和/或d2)所述核酸分子的重组细胞、或含有d3)所述表达盒的重组细胞、或含有d4)所述重组载体的重组细胞。

33、进一步地，所述d2)可为抑制或降低所述蛋白质pd129l的编码基因表达的核酸分子。

34、上述应用中，d1)所述核酸分子可为下述任一种：

35、e1)核苷酸序列是seq id no.1的dna分子；

36、e2)编码序列是seq id no.1的dna分子；

37、e3)编码序列是seq id no.1的任何遗传密码子简并序列的dna分子。

38、seq id no.1所示的dna分子(d129l基因)编码氨基酸序列是seq id no.2的蛋白pd129l。

39、seq id no.1所示的核苷酸序列为蛋白pd129l编码基因(cds)的核苷酸序列。

40、缺失d129l基因全部及部分序列或破坏d129l基因开放阅读框(orf)即d129l基因功能缺失的非洲猪瘟病毒不能复制，该病毒可在提供d129l基因表达蛋白的细胞中复制，d129l基因在非洲猪瘟病毒的复制中具有关键作用。

41、稳定表达d129l基因的asfv敏感细胞系(辅助细胞系)或能在胞内提供pd129l蛋白的asfv敏感细胞能够支持任一种d129l基因缺失复制缺陷型asfv在该细胞上复制。

42、携带d129l基因且表达pd129l蛋白的asfv敏感细胞系或能在胞内提供pd129l蛋白的asfv敏感细胞能够支持缺失d129l基因功能的非洲猪瘟病毒的复制。

43、在所述辅助细胞系中增殖的d129l基因功能缺失复制缺陷型的非洲猪瘟病毒可作为预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，为免疫猪提供有效的攻毒保护。

44、d1)所述核酸分子还可包括在seq id no.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

45、本发明所述的蛋白pd129l的编码基因(d129l基因)可以为任意能够编码蛋白pd129l的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

46、d2)所述核酸分子可为敲除所述蛋白pd129l的编码基因的分子。所述敲除可通过同源重组实现。

47、进一步地，d2)所述核酸分子可为核苷酸序列是seq id no.7和/或seq id no.8的dna分子(用于通过同源重组的方法敲除所述d129l基因)。

48、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

49、d6)所述重组细胞可为下述任一种：

50、f1)稳定表达所述蛋白pd129l的重组细胞；

51、f2)稳定表达所述蛋白pd129l的重组野猪肺细胞(wsl)；

52、f3)稳定表达所述蛋白pd129l的重组猪肺泡巨噬细胞(pam)。

53、本文所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pmd18-t载体、pmd18-t-egfp、pacad5 cmvk-npa(人5型腺病毒表达载体)、pacad5 9.2-100和/或pcdna3.1载体。

54、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻、真菌或病毒。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)，黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽胞杆菌属(bacillus)等。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌dh5α。

55、本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞。在本发明的一个或多个实施方案中，所述细胞为pam细胞、hek293ad细胞、野猪肺细胞(wsl)和/或永生化猪肺泡巨噬细胞(ipam)。

56、本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组载体为pδd129l-egfp、padcmv-d129l和/或pcdna3.1-d129l。

57、所述重组载体pδd129l-egfp含有d129l基因左侧同源臂d129l-larm(seq idno.7)和右侧同源臂d129l-rarm(seq id no.8)，其构建方法为：以pmd18-t-egfp(简写为t-egfp)为基础载体，采用无缝连接技术，将d129l基因左侧同源臂d129l-larm(seq id no.7)和右侧同源臂d129l-rarm(seq id no.8)克隆至t-egfp载体中得到的重组表达载体。

58、所述基础载体pmd18-t-egfp可为将p72启动子(seq id no.24)和egfp-sv40polya(seq id no.23)克隆到pmd18-t载体得到的重组载体。

59、所述重组载体padcmv-d129l是使用同源重组的方法，将带有同源臂的d129l基因连接在pacad5 cmvk-npa载体上得到的重组载体，具体为将asfv d129l目标基因通过基因的同源重组基因片段插入pacad5 cmvk-npa质粒的ecori酶切位点中得到的载体，重组质粒padcmv-d129l含有seq id no.1所示的dna分子(d129l基因)，表达d129l目标基因。

60、所述重组载体pcdna3.1-d129l是通过无缝连接技术，将带有同源臂的d129l基因连接在pcdna3.1载体上得到的重组载体，重组载体pcdna3.1-d129l含有seq id no.1所示的dna分子(d129l基因)，表达氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质pd129l。

61、本文所述重组微生物是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物后得到的重组微生物。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组微生物为δradv5-d129l。

62、所述重组微生物δradv5-d129l为表达d129l基因的重组腺病毒。所述重组腺病毒δradv5-d129l是将所述重组载体padcmv-d129l和骨架质粒pacad5 9.2-100分别采用paci酶进行线性化后共转染hek293ad细胞，进行重组腺病毒的拯救而得。所述重组腺病毒δradv5-d129l可用于复制缺陷型非洲猪瘟病毒的制备和扩大培养。

63、本文所述重组细胞是指对宿主细胞的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的细胞。如将外源目的基因或重组载体导入宿主细胞后得到的重组细胞。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组细胞为wsl-d129l和/或ipam-d129l。

64、所述重组细胞wsl-d129l是将所述重组载体pcdna3.1-d129l导入野猪肺细胞(wsl)，经筛选得到的稳定表达所述蛋白pd129l的重组细胞。

65、所述重组细胞ipam-d129l是将所述重组载体pcdna3.1-d129l导入永生化猪肺泡巨噬细胞(ipam)，经筛选得到的稳定表达所述蛋白pd129l的重组细胞。

66、所述重组细胞wsl-d129l和ipam-d129l可作为辅助细胞用于制备(增殖或培养)d129l基因缺失的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

67、本发明还提供了复制缺陷型非洲猪瘟病毒，所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组缺失了所述蛋白质pd129l的编码基因，或所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pd129l的编码基因功能失活。

68、所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒不能复制，丧失了在原代单核-巨噬细胞和在猪体内的复制功能。

69、所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒可为复制缺陷型非洲猪瘟病毒δsy18δd129l株。

70、本发明还提供了制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒(如δsy18δd129l株)的方法，所述方法可包括使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pd129l的编码基因缺失或功能失活，得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

71、所述使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pd129l的编码基因缺失或功能失活可通过基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术实现。

72、进一步地，所述使非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pd129l的编码基因缺失或功能失活可利用同源重组技术进行d129l基因的敲除。

73、上述方法中，所述方法可包括如下步骤：

74、g1)构建含有所述蛋白质pd129l编码基因左右同源臂的重组载体；

75、g2)将g1)中所述重组载体与非洲猪瘟病毒共转染/感染(转染和/或感染)宿主细胞；

76、g3)培养所述宿主细胞，筛选得到复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

77、进一步地，所述蛋白质pd129l编码基因左同源臂名称为d129l-larm，所述d129l-larm的核苷酸序列可为seq id no.7。所述蛋白质pd129l编码基因右同源臂名称为d129l-rarm，所述d129l-rarm的核苷酸序列可为seq id no.8。

78、g1)中所述重组载体可为所述重组载体pδd129l-egfp。

79、g2)中所述非洲猪瘟病毒可为非洲猪瘟病毒sy18株(asfv sy18株)。

80、g2)中所述宿主细胞可为pam细胞。

81、g3)中所述培养条件可为37℃5％ co2条件下培养72～96小时。

82、虽然本发明提供的实施例利用同源重组技术进行d129l基因的敲除，但本发明不限于该特定方法。本领域技术人员可采用本领域已知的其它基因敲除、基因编辑、基因突变或基因敲减方法使非洲猪瘟病毒基因组中d129l基因缺失或失活。这些方法也可用于本发明。这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。

83、本发明还提供了由所述制备复制缺陷型非洲猪瘟病毒的方法制备得到的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

84、本发明还提供了本文任一所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖方法，所述方法可包括将本文任一所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒在辅助细胞中培养，所述辅助细胞可为稳定表达所述蛋白质pd129l的重组细胞和/或含有所述蛋白质pd129l的细胞。

85、所述辅助细胞(稳定表达所述蛋白质pd129l的重组细胞和/或含有所述蛋白质pd129l的细胞)或所述辅助细胞在制备所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒中的应用也在本发明的保护范围内。

86、所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组缺失了所述蛋白质pd129l的编码基因，或所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒基因组中所述蛋白质pd129l的编码基因功能失活。

87、所述辅助细胞可通过在如下任一种受体细胞中稳定表达所述蛋白质pd129l得到，或所述辅助细胞可为含有所述蛋白质pd129l的下述任一种细胞：

88、h1)适于非洲猪瘟病毒增殖的原代单核-巨噬细胞；

89、h2)适于非洲猪瘟病毒增殖的传代单核-巨噬细胞系；

90、h3)适于非洲猪瘟病毒增殖的其他传代细胞系如野猪肺细胞、vero细胞、hela细胞或hek293细胞系等。

91、进一步地，所述辅助细胞(基因稳定表达转基因细胞)可为所述重组细胞wsl-d129l和/或ipam-d129l。

92、在本发明的一个实施方案中，所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒的增殖方法包括如下步骤：

93、将所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒按照1％比例接种重组细胞ipam-d129l，在37℃5％co2条件下培养72～96小时，待90％以上细胞呈现荧光后，收获培养细胞，冻融混合后-15℃以下保存。

94、本发明还提供了复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗可包括本文任一所述的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

95、所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的活性成分为本文任一所述的复制缺陷型非洲猪瘟病毒。

96、进一步地，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine delivery system)。

97、进一步地，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。

98、所述佐剂是一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、ifn-γ、cpg基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。

99、所述疫苗递送系统是一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为铝盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。

100、所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

101、本文所述复制缺陷型非洲猪瘟病毒可为d129l基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟病毒，所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗可为d129l基因缺失复制缺陷型非洲猪瘟疫苗。

102、本发明所述复制缺陷型非洲猪瘟疫苗是采用基因工程方法，将非洲猪瘟病毒复制过程中的一些必需基因进行缺失或正常的编码序列破坏，使其只有在提供复制必需基因的辅助细胞系中才能进行有效复制，在感染动物后不能进行有效复制，故该疫苗毒株最大程度保留了病毒的原始状态，保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性且在感染动物中不会产生排毒等免疫副作用。

103、本发明的目的之一是提供一种非洲猪瘟病毒蛋白—pd129l蛋白的功能鉴定及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用。

104、本发明试验证明，非洲猪瘟病毒d129l基因所编码的蛋白是病毒复制必需的蛋白，缺失该蛋白后病毒不能复制组装成完整的病毒颗粒，但在不缺失该蛋白的病毒共存时可以组装成完整的病毒颗粒；缺失该基因的非洲猪瘟病毒在稳定表达该蛋白的asfv敏感细胞(辅助细胞)系或瞬时表达pd129l蛋白的asfv敏感细胞内也可以复制且组装成病毒颗粒，并可在稳定表达该蛋白的细胞系中连续增殖，但不能在不表达d129l基因的细胞内增殖；利用在稳定表达或瞬时表达pd129l蛋白的asfv敏感细胞中增殖的d129l基因缺失复制缺陷型asfv免疫猪以后，后者可以提供针对asfv强毒攻击的坚强的免疫保护效果。以上表明，d129l基因是非洲猪瘟病毒复制组装的关键必需基因之一，揭示了d129l基因表达蛋白对非洲猪瘟病毒在细胞内复制的开关功能。据此，本发明进一步证实，该d129l基因缺失复制缺陷型asfv免疫猪可使免疫动物产生坚强的针对非洲猪瘟病毒感染的免疫功能，是一种有效的非洲猪瘟疫苗。

105、通过本发明试验证明，采用同源重组技术将非洲猪瘟病毒d129l基因缺失以后，重组基因组不能复制成为感染性病毒颗粒，在利用d129l基因建立的表达pd129l蛋白的ipam和/或wsl辅助细胞系上进行筛选和培养，则可获得携带荧光蛋白且只能在辅助细胞中增殖的d129l基因缺失的重组病毒，该d129l基因缺失病毒在原代pam细胞或非转化(不表达d129l基因)的ipam和wsl细胞中不能复制，属于复制缺陷型病毒；将该复制缺陷型d129l基因缺失病毒免疫猪两次后，用asfv sy18株强毒攻击，免疫猪可获得100％攻毒保护。综上，本发明发现了一种控制asfv复制的关键必需基因d129l，该基因缺失病毒可作为一种复制缺陷型非洲猪瘟疫苗，用于非洲猪瘟的预防。