一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、颌面部软组织具有特殊的解剖生理结构，在人体咀嚼、发音、美观等方面起着至关重要的作用，同时很容易受到创伤、感染和先天性疾病等的影响。颌面部软组织形态及容量的异常与不足所表现出的面部凹陷、不对称、衰老等表现在临床上十分常见，不仅给患者造成了功能性的问题，也严重影响着患者的形象和心理健康，给患者的生活带来诸多的困扰。现有的临床修复方法以自体软组织移植修复为主，会导致二次创伤且不利于塑形。近年来人们对美容修复方面的要求越来越高，如何在恢复缺损组织正常功能的情况下尽可能修复缺损组织的外形，对缺损组织进行功能重建并达到良好的美容修复效果，成为颌面软组织修复的重点。

2、软组织充填术是非手术美容治疗的一个主要项目，通过将软组织充填材料植入体内并占据组织损伤或者病变造成的空腔和缺损部位，替代并行使或增强其原有功能，从而达到组织修复、畸形矫正和面貌年轻化治疗的目的，是适应患者对微创外科技术的需要，也是目前整形外科临床技术发展的趋势之一。应用注射性软组织填充材料进行无创的面部填充成为最流行的操作手段，注射填充技术操作简单，仅几分钟的注射就能马上显出效果，没有痛苦、不影响工作、生活，非常方便，而且不留痕迹，秘密性好，保护了客户的隐私。但是理想的注射性软组织填充材料要同时具有生物相容性、安全性、易操作性、锚定性和持久性，这对于研究和开发整形美容产品的学者来说，一直是一个极具挑战性的课题。

3、而软组织缺损的临床修复效果与材料的来源和性能紧密相关，为实现缺损组织的功能重建和美学重建，不仅要求注射性充填材料具有良好的生物相容性和即刻填充效果，还要求植入材料具有良好的组织修复与再生功能，同时来源广泛、操作简便。虽然目前透明质酸、羧甲基纤维素等注射性软组织充填剂被广泛研发应用，但其缺乏细胞黏附、增殖和分化所需的各种生物信号分子，自身的抗酶解和自由基降解的能力有限，难以调控细胞行为并促进组织修复。例如，交联透明质酸及其衍生物作为物理体积充填剂，不利于细胞黏附，诱导组织再生的能力有限，在代谢速度快，效果维持有限；同时，交联透明质酸类产品植入后依赖于术者在术中进行塑形，对术者的解剖学理论知识和操作技术有较高的要求，同时充填材料可能会发生移位等并发症，严重影响植入满意度。

4、因此，目前的注射材料存在机械强度不够，注射效果维持的时间短，与人体组织的生物相容性差，注射后效果不自然等问题，已经难以满足实际应用环境的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶及其制备方法与用途，所述水凝胶具有良好的生物相容性，可以在注射后通过透皮光交联的方式原位固化成形，在实现组织填充目的的同时可以释放具有生物活性的重组胶原蛋白，达到促进组织修复的效果。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶，水凝胶合成原料包含辅料酸酐、天然多糖类物质、活化剂、氨基邻二醇、氧化剂；

4、所述重组胶原蛋白的氨基酸序列中，包括n个基本重复单元，所述基本重复单元中含有n1个如下特征氨基酸序列：“g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3”；基本重复单元的3’端和5’端连接形成上述特征氨基酸序列；

5、其中，n为4以上的整数；n1为3以上的整数。

6、进一步的，所以n值为4～300以上的整数，进一步为4～200以上的整数。

7、进一步的，特征氨基酸序列连续或间隔排列在基本重复单元中；

8、进一步的，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列呈现如下特征：

9、[-g-e-xaa3-yaa1-(g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3)n2-yaa2-(g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3)n3-yaa3-(g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3)n3-yaa4-(g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3)n4-…………-yaan-(g-xaa1-xaa2-g-e-xaa3)n-yaan+1-g-xaa1-xaa2-]n

10、其中，所述xaa1为非极性疏水氨基酸；所述xaa2为丝氨酸(s)、丙氨酸(a)、脯氨酸(p)、羟脯氨酸(o)中的一种；所述xaa3为碱性氨基酸；

11、yaa1，yaa2，yaa3，yaa4，………，yaan，yaan+1每次出现分别独立的选自无、一个或多个不同或相同的氨基酸；

12、n2、n3、n4、………、n为0以上的整数，两者不同时为0；

13、优选的，所述重组胶原蛋白序列不含蛋白标签。

14、优选的，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列为seq id no.1。

15、优选的，所述酸酐为环状不饱和酸酐或含羧基的不饱和酸酐或4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种；进一步地，所述的酸酐是顺丁烯二酸酐(又称马来酸酐)、柠康酸酐、顺-3-羧基戊烯二酸酐(顺式乌头酸酐)、4-戊烯酐、巴豆酸酐、甲基丙烯酸酐中的一种；更进一步为甲基丙烯酸酐。

16、优选的，所述天然多糖类物质选自透明质酸、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖或壳聚糖季铵盐；优选的，这种天然多糖类物质为羧甲基纤维素。

17、优选的，所述活化剂为nhs和edc；进一步的，所述氨基邻二醇为3-氨基-1，2丙二醇，通过引入含有邻二醇的侧链基团，可以特异性的氧化生成醛基，有效避免天然多糖主链结构的破坏。

18、进一步的，所述氧化剂选自高碘酸盐、次氯酸盐；优选的，所述氧化剂为高碘酸钠。

19、第二方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶的制备方法，所述水凝胶是采用透皮光固化得到的；

20、进一步的，具体步骤如下：

21、s1.用酸酐对天然多糖类物质进行适度化学改性，得到具有光交联性能的天然多糖衍生物；

22、s2.将上述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活性剂混合反应，反应溶液的ph值为4.65-5.2；

23、s3.在s2的反应体系中加入氨基邻二醇进行侧链羧基活化反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含邻二醇侧链的天然多糖衍生物；

24、s4.将上述含邻二醇侧链的天然多糖衍生物溶解后与氧化剂反应并通过透析纯化，透析结束后冷冻干燥，得到含醛侧链的天然多糖衍生物；

25、s5.将上述含醛侧链的天然多糖衍生物溶解后与前述的重组胶原蛋白、光引发剂混合得到修复基质前驱液，经透皮光照交联后得到水凝胶。

26、本发明通过适度的化学改性和合理的材料复配调节天然多糖类物质组成与结构，经过化学改性后的天然多糖类物质，使其含有光引发基团，能通过体内皮下注射，透皮光照成型的效果，其力学和降解性能也得到显著改善，这种特殊的结构还可以支持细胞的生存和增殖，最终得到的组织充填剂(水凝胶)具有良好的热稳定性、机械强度、抗酶解性能，且体内维持时间更长。

27、在软组织填充领域，羧甲基纤维素和其他多糖类高分子化合物一样缺乏细胞粘附位点，细胞难以在水凝胶中粘附铺展，导致细胞难以在水凝胶中迁移生长，只能在原位增殖、聚集生长。本发明充分利用重组胶原蛋白的生物安全性，高黏附活性和生物学效应，有利于细胞在复合水凝胶上粘附生长，并随着羧甲基纤维素的降解持续缓释重组胶原蛋白，调控细胞的生物学行为并诱导细胞外基质的表达，从而达到早期形态维持，后期诱导软组织基质再生的修复效果。

28、本发明所述水凝胶可以用于改善软组织轮廓缺陷，适用于在真皮层(如中层、深层)、皮下浅层至深层的填充，如皱纹、疤痕、凹陷性缺失或损伤等皮肤下陷区域的恢复方面。

29、优选的，所述步骤s1中天然多糖类物质的光交联改性程度为30～60％；所述具有光交联性能的天然多糖衍生物与活化剂中的nhs、edc的摩尔比1：(1～3)：(2～5)；

30、进一步的，所述步骤s2中具有光交联性能的天然多糖衍生物：nhs：edc的摩尔比1：2：3；

31、优选的，所述步骤s3中加入氨基邻二醇进行活化反应的溶液ph值为7～7.7，氨基邻二醇：具有光交联性能的天然多糖衍生物的摩尔比为(1～10):1；所述s3、s4中的透析时间为20～72h，透析截留的分子量为8000～14000kda。

32、本发明所述天然多糖衍生物含有醛基，可以通过希弗碱反应结合重组胶原蛋白并在水凝胶中逐渐释放。优选的，所述步骤s5中含醛侧链的天然多糖衍生物的质量体积比为1～5％；所述重组胶原蛋白的质量体积比为0.5～2％；所述光引发剂的质量体积比为0.01～0.05％。

33、第三方面，本发明提供一种具有生物活性的可透皮光固化成形水凝胶在软组织填充与修复中的应用。

34、本发明所述水凝胶还可以根据需要与其他功能性材料配合使用，比如具有抗菌抑菌作用的成分、抗衰老成分、抗凝血成分、抗氧化成分、生长因子等。

35、本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

36、当质量体积比或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

37、本发明具有如下有益效果：

38、(1)本发明首先用不饱和酸酐对天然多糖类物质进行适度的化学改性引入不饱和碳碳双键，然后通过edc/nhs活化改性后的天然多糖类物质中的羧基，随后加入氨基邻二醇引入相邻羟基，在氧化剂的氧化下获得醛基，最后醛基与重组胶原蛋白中的氨基进行希弗碱反应，通过透皮光照交联获得重组胶原蛋白活化的软组织充填水凝胶；本发明得到的水凝胶具有良好的生物相容性，操作简便，同时具有的可注射、原位固化成型的特性也满足了临床上对不规则缺损组织的填充。

39、(2)本发明以羧甲基纤维素等天然多糖材料为基础，只需材料预混合、局部注入和光固化三个步骤即可完成构建新型复合组织充填剂，制备方法操作简单，改性反应程度可控，同时克服了羧甲基纤维素等天然多糖类物质缺乏细胞粘附位点的缺陷。

40、(2)本发明光引发手段操作简单、反应温和，透皮光交联，无需破坏性手术，术中塑形，术后成型。