一种环境响应型层层自组装纳米复合物及其制备方法与应用

本发明涉及一种药物制剂及其制法和应用，具体是涉及一种环境响应型层层自组装纳米复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、肥胖是一种常见的慢性代谢性流行性疾病，目前，除了饮食与运动为主的综合疗法外，临床上主要通过外科手术和药物进行治疗，但外科手术的侵入性与风险性高，药物的副作用严重，因此开发更为安全有效的新兴肥胖治疗手段十分迫切。纳米粒具有比表面积大、载药能力强、生物利用度高等优点，特别是具有良好的靶向性和可调的释放速率，在肥胖及肥胖相关代谢性疾病的诊断与治疗方面有很大的研究前景。

2、脂肪组织在肥胖的发生和进展过程中处于核心位置，其由成熟的脂肪细胞和脂肪前体细胞、成纤维细胞、内皮细胞、干细胞、免疫细胞及胶原纤维等构成，其中成熟脂肪细胞是脂肪组织中的主要细胞，它不仅可将机体内多余的能量以甘油三酯(triglyceride，tg)的形式存储起来，同时还具有内分泌功能，通过分泌多种细胞因子(瘦素、脂联素、抵抗素和血管紧张素等)和炎症因子(肿瘤坏死因子α和白介素-6)调节新陈代谢。过量的tg积累导致的脂肪细胞体积增加(肥大)与数量增多(增生)是肥胖发生发展过程中的典型标志。

3、此外，体内过量的脂肪积累将导致脂肪组织缺氧状态，扰乱正常代谢而造成脂肪组织炎症。当脂肪细胞储存的tg达到极限时，细胞启动凋亡并分泌大量趋化因子，诱导血液中的单核细胞趋化至脂肪组织内，并被激活toll样受体(t0ll-likereceptors，tlr)及下游nf-κb炎症通路，促使其向促炎m1型巨噬细胞极化并释放大量炎症因子，如肿瘤坏死因子α、白介素-6、单核细胞趋化蛋白-1及转化生长因子β1等，进一步加剧脂肪组织炎症，并可引发胰岛素抵抗等全身性炎症。

4、目前已有很多关于减脂的纳米治疗策略，常见为通过脂质体、聚合物胶束等载体将治疗药物递送至脂肪组织治疗肥胖。但是这些纳米载体的靶向能力有限，不能将治疗药物有效递送至脂肪细胞与巨噬细胞，并在靶点实现药物可控释放；靶向能力差也降低了纳米粒的体内安全性；这些纳米粒载药单一、治疗策略与方式简单，这也限制了纳米粒对肥胖的治疗效果。

技术实现思路

1、发明目的：本专利针对现有技术中存在纳米粒载体对于脂肪细胞与巨噬细胞靶向性差、安全性低以及治疗模式单一等问题，提供一种环境响应型层层自组装纳米复合物。本发明还有一个目的是提供所述环境响应型层层自组装纳米复合物的制备方法和在制备肥胖治疗药物中的应用。

2、技术方案：本发明所述的环境响应型层层自组装纳米复合物，包括黑磷纳米片(bp)、聚二甲双胍(pm)、透明质酸(ha)及p3肽修饰的ha(p3-ha)，所述纳米复合物为层包层结构，核心为黑磷纳米片，中间层为聚二甲双胍，外层为透明质酸、p3肽修饰的ha。

3、所述pm是由含伯氨基或仲胺基的盐酸化高分子与二氰二胺单体通过加成反应制得，所述含伯氨基或仲胺基的盐酸化高分子为壳聚糖、线性聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙烯胺或聚烯丙胺中的一种。

4、所述ha的平均分子量为20～235kda。

5、所述p3肽修饰的ha为p3肽通过mmp-2底物肽链修饰的ha，序列为ha-plglag-ckggrakdc；其中，mmp-2底物肽链为连接臂。

6、所述纳米复合物核心为带负电的具有良好光热转化能力的bp，中间层为带正电的pm，外层为带负电的具有靶向、治疗作用的ha及靶向、环境响应性的p3肽修饰的ha。所述pm为肥胖治疗药物。

7、所述的环境响应型层层自组装纳米复合物的制法，包括以下步骤：

8、(1)制备黑磷纳米片bp：将黑磷晶体粉末分散于丙酮溶液中，超声剥离，离心去除大块黑磷晶体沉淀，收集上层分散液再次离心，沉淀用水混悬，即得到水分散的bp；

9、(2)制备pm：将盐酸溶液加入含伯氨基或仲胺基的高分子粉末中，室温搅拌后，冷冻干燥得到盐酸化高分子；将盐酸化高分子与二氰二胺于油浴下反应，冷却至室温后收集产物溶液，透析，冷冻干燥，即得到pm：

10、(3)制备环境响应型层层自组装纳米复合物p3-ha/pm-bp：将黑磷纳米片bp逐滴加入pm溶液中，搅拌反应后离心，沉淀用水混悬，超声后得到pm-bp纳米粒溶液；将pm-bp纳米粒逐滴加入ha与p3肽修饰的ha混合溶液中，搅拌反应后离心，沉淀用水混悬，超声，即得。

11、所述的制法，步骤(1)中，所述黑磷晶体粉末超声剥离的功率为80～200w；步骤(2)中，所述盐酸化高分子与二氰二胺的投料质量比为1∶10～1∶20；步骤(3)中，所述bp、pm、ha与p3肽修饰的ha的投料质量比为1∶1∶1∶0.1～1∶4∶4∶0.4。

12、所述的环境响应型层层自组装纳米复合物在制备肥胖治疗药物中的应用。

13、所述的环境响应型层层自组装纳米复合物在制备降低脂肪组织脂肪含量和/或改善脂肪组织炎症的药物的应用。

14、所述的环境响应型层层自组装纳米复合物在制备光热联合靶向治疗肥胖药物中的应用。

15、优选的，步骤(1)具体为：将黑磷晶体粉末分散于丙酮溶液中，将分散液于冰浴冷却条件下置于超声探头细胞破碎仪中探头超声分散24h，功率为80～200w，待超声结束后，将分散液低速离心以除去未剥离的大块黑磷晶体沉淀，收集上层分散液高速离心以去除上层丙酮有机溶剂，沉淀用水混悬，即得到水分散的bp。

16、优选的，步骤(2)具体为：在磁力搅拌状态下将盐酸溶液滴加入含伯氨基或仲胺基的高分子粉末中，冷冻干燥后得到盐酸化高分子；将盐酸化高分子与二氰二胺按照质量比为1∶10～1∶20投料，于油浴搅拌条件下反应。随后将反应液晾至室温并收集产物溶液，透析约48h以完全除去过量二氰二胺，收集透析产物，冷冻干燥后，即得到pm。

17、优选的，步骤(3)具体为：移取pm溶液于西林瓶中，将黑磷纳米片bp分散液在搅拌条件下逐滴加入pm溶液中搅拌反应，然后高速离心以去除未结合的pm上清液，沉淀用水混悬并利用超声探头细胞破碎仪的探头超声分散后得到pm-bp纳米粒分散液。然后将pm-bp纳米粒分散液在搅拌条件下逐滴加入ha与p3-ha混合溶液中反应，随后再次高速离心以去除未结合的ha与p3-ha上清液，沉淀再次用水混悬并利用超声探头细胞破碎仪的探头超声分散后，即得到环境响应型层层自组装纳米复合物(p3-ha/pm-bp)。

18、本专利联合减脂与抗炎的治疗策略，结合脂肪组织的理化特点，将几种带有相反电荷的原料通过层层静电吸附与氢键结合制备一种环境响应型层层自组装纳米递药系统，实现多药、多模式、双重靶向治疗肥胖，为肥胖治疗提供新的方法与思路。

19、发明原理：发明人在研究过程中发现，肥胖是由于食物摄入过多或机体代谢改变而使体内脂肪积聚过多导致的慢性代谢性流行疾病，过量的脂肪积累导致的脂肪细胞肥大与增生是肥胖发生发展过程中的典型标志，此外过量的脂肪积累也将扰乱细胞正常代谢而造成脂肪组织炎症，进一步将导致ir、2型糖尿病、动脉粥样硬化等并发症，因此降低脂肪细胞脂肪积累、缓解脂肪组织炎症是肥胖治疗的重要策略。黑磷是一种具有优秀光热转化能力的二维材料，其比表面积大，药物结合与运载能力突出，且其仅由磷元素组成，在体内可被最终氧化降解为无毒的po43-而具有良好的生物相容性与生物安全性，因此黑磷有望作为安全高效的纳米药物载体进行光热治疗(photothermaltherapy，ptt)，促使脂肪细胞凋亡与脂肪分解而缓解肥胖。二甲双胍可通过短暂轻度地抑制线粒体呼吸链复合物i，破坏细胞atp合成，导致环磷酸腺苷和蛋白激酶a信号转导缺陷，最终激活amp依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate(amp)-activated protein kinase，ampk)信号通路。在脂肪组织中，二甲双胍可通过激活ampk而降低脂肪生成关键因子——过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor gama，pparγ)与ccaat/增强子结合蛋白α(ccaat/enhancer-binding protein alpha,c/ebpα)的水平，并降低脂肪生成、强化tg水解与游离脂肪酸(freefattyacid,ffa)氧化，从而减小脂肪团、降低血脂水平。此外二甲双胍可通过激活ampk信号通路促使促炎m1型巨噬细胞向抗炎m2型转变、并减少巨噬细胞炎症因子表达水平从而缓解脂肪组织炎症。因pm分子中接枝有大量双胍基团，我们经实验证明pm同样具有降低脂肪含量与缓解炎症的肥胖治疗作用。透明质酸(hyaluronicacid,ha)是天然存在于多种组织细胞外基质中的酸性多糖，具有良好的生物可降解性与生物相容性，其可与脂肪细胞与巨噬细胞表面的cd44受体特异性结合而具有脂肪组织靶向能力；此外研究发现ha纳米粒可以分别结合团聚脂肪细胞、巨噬细胞表面的多个cd44受体，阻断其下游信号通路，从而分别抑制脂肪细胞生脂基因表达而降低脂肪含量，降低巨噬细胞炎症因子表达水平而缓解炎症。p3肽(ckggrakdc)可与白色脂肪组织血管表面大量表达的抗增殖蛋白(prohibitin，phb)受体特异性结合，将其修饰在纳米粒表面，可实现对脂肪组织的良好靶向能力。

20、纳米粒具有比表面积大、吸附能力强、生物利用度高等优点，特别是具有良好的靶向性和可调的释放速率，有利于肥胖及肥胖相关代谢性疾病的诊断和治疗。而基于逐层结合的纳米粒自组装是一种新兴的、强大的纳米粒制备构建方法，能够将带电粒子通过静电结合与氢键等作用交替沉积在带电核心上实现纳米粒的模块化、通用性与灵活性制备。这种纳米粒具有多种优越性，每层材料既可作为载体又可作为药物，可进行多药协同递送，实现药物环境响应性可控释放。

21、因此，本专利采用液相剥离制备黑磷纳米片bp，由含伯氨基或仲胺基的高分子与二氰二胺在酸性高温条件下制备pm，并构建p3肽通过mmp-2底物肽链(连接臂)修饰的ha(p3-ha)，然后以bp(-)为核心，通过逐层自组装技术将带有相反电荷的pm(+)、ha与p3-ha(-)交替结合于纳米粒表面，制备得到p3-ha/pm-bp纳米复合物。该纳米复合物具有层包层结构，核心为带负电的具有良好光热转化能力的纳米载体bp，中间层为带正电的治疗药物pm，外层为带负电的具有靶向、治疗作用的ha以及靶向、环境响应性的p3-ha。

22、该纳米复合物经静脉注射进入体内，在p3肽与ha的双重靶向作用下到达脂肪组织，p3-ha可响应脂肪组织mmp-2酶降解而完全暴露内部ha，ha可特异性结合团聚脂肪细胞、巨噬细胞表面的多个cd44受体，从而抑制脂肪细胞生脂基因表达从而降低脂肪含量、降低巨噬细胞炎症因子表达水平从而缓解炎症；此外酶响应性降解也促使纳米粒解离和内部药物pm释放，pm可激活ampk信号通路发挥降脂与抗炎的作用，而bp可将808nm激光转化为热能，破坏脂肪细胞与巨噬细胞的膜蛋白，提高细胞膜的通透性，致使脂肪细胞内脂滴流出而降低脂肪含量，最终导致脂肪细胞与巨噬细胞死亡。该递药系统采用多药联合(bp、pm、ha)，多种治疗模式(化学药物治疗、光热治疗)协同治疗肥胖，具有环境响应性(mmp-2酶)和双重靶向能力(p3肽与ha)，可表现出优良的抗肥胖效果。

23、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明创造性地将bp的光热转化能力应用于肥胖的治疗，bp不仅作为优秀的药物载体，还可在靶向部位进行光热转化，破坏脂肪细胞膜并导致胞内脂滴泄露，实现降低脂肪含量的目的。(2)本发明创造性地将pm应用于肥胖的治疗，pm分子中接枝有大量双胍基团，可降低脂肪含量、缓解炎症而发挥与二甲双胍相似的抗肥胖作用。(3)本发明采用多种治疗模式协同治疗多种对象，将bp介导的光热治疗与pm、ha介导的化学药物治疗联合应用，通过不同机制共同降低脂肪细胞的脂肪积累，缓解巨噬细胞导致的炎症。(4)本发明将mmp-2酶底物肽链作为连接臂连接ha与p3肽，赋予了纳米粒脂肪组织环境响应性，提高了纳米粒的可控释药与抗肥胖效果。