一种潜在抗结直肠癌药物、挖掘方法及应用

本发明属于生物医药，尤其涉及一种潜在抗结直肠癌药物、挖掘方法及应用。

背景技术：

1、据统计，在2020年，所有男性中结直肠癌(crc)是第三大流行癌症，无论是在新增病例还是死亡病例中。并且在所有癌症新增病例中有超过193万人被诊断患有结直肠癌。自2000年以来，结直肠癌的发病率逐步上升，而发病年龄却逐渐下降。低年龄段人数增加的原因未知，但可能与饮食变化，缺乏运动和肥胖症有关。而对于结直肠癌的治疗，主要有手术切除，放化疗和靶向药物或免疫治疗等。尽管诊断和治疗方法有了很大的改进，但结直肠癌的预后仍然不佳。研究报道发现，通过食用富含抗氧化剂的天然小分子化合物(食物/提取物)来管理炎症可能是一个潜在的策略，培养良好的饮食习惯有利于肠道健康，有利于对抗炎症状态，以降低炎症等级，从而预防crc的发病。而花青素因为其已知的抗氧化和抗炎特性被认为是有希望的潜在治疗化合物，它能够促进crc的相关健康益处。但其结构的不稳定与复杂、较低的生物利用率以及提取难度大价格高等原因，基于花青素筛选重新设计抑制crc细胞生长和侵袭的药物的研究是非常必要的。

2、当前，新药研发难度极高，包括各研发阶段周期长、成本高以及失败率高等原因。因此重新利用已开发的有对应适应症的药物来治疗其他类型的疾病正日益成为一个极具潜力的药物研发方式，称“药物再利用”。“药物再利用”与全新药物研发相比，具有以下优点：(1)较高的成功率，上市药物已进行系统的安全性评价；(2)研发周期短，上市药物具有全面的临床前药代动力学和毒理学参数，在前期研究基础上做新适应症的开发，研发周期会大大缩短；(3)开发成本较低，与同一适应症的新药开发相比，“老药新用”在临床前及临床i期和ii期中可大大节省研发成本。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

4、现有花青素存在结构不稳定与复杂、生物利用率较低以及提取难度大价格高等问题。虽然在细胞实验中具有良好的抗结直肠癌作用，但在动物实验中进入血液的量少，利用率低；

5、同时新药研发难度极高，包括各研发阶段周期长和成本高以及失败率高等问题。新药物研发从化合物分子到真正走上临床平均需8～10年的时间，且需要大量的人力物力支持，时间成本和经济成本消耗巨大。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种潜在抗结直肠癌药物、挖掘方法及应用，尤其涉及天然小分子化合物-花青素，cmap数据库和药物再利用。

2、本发明是这样实现的，通过分析花青素对于结直肠癌处理的转录组数据，寻找获得signature靶基因集；再利用cmap数据库，筛选出对应的潜在小分子药物，为拓宽crc的药物选择范围提供了新思路，大大缩短药物发现到临床转化的时间，具有重要的临床治疗意义。

3、本发明提供了一种抗结直肠癌药物，所述的抗结直肠癌药物如下表所示：

4、

5、潜在抗结直肠癌药物的挖掘方法包括：

6、通过分析花青素对于结直肠癌处理的转录组数据，获得signature靶基因集；再利用cmap数据库，筛选出对应的潜在抗结直肠癌小分子药物。

7、进一步，潜在抗结直肠癌药物的挖掘方法还包括：

8、通过调研得到具有抗结直肠癌的天然小分子化合物花青素，通过对ht29结直肠癌细胞系进行花青素处理后，cck8检测细胞活力，获得花青素的效应和最适作用条件；通过转录组测序进行高通量数据分析，并评估影响因素；通过时序性分析和差异基因分析，筛选出signature基因集，再利用cmap数据库，匹配筛选相应的潜在抗结直肠癌的小分子药物；最后通过细胞活力实验以及转录组测序验证小分子药物在结直肠癌中的实际作用效果。

9、进一步，潜在抗结直肠癌药物的挖掘方法包括以下步骤：

10、步骤一，寻找具有抗结直肠癌作用并与核受体相关的天然小分子化合物，验证抗癌效果，得到最适作用条件；

11、步骤二，通过转录组测序分析，系统评估花青的结构、浓度和时间对ht29细胞基因表达的影响；

12、步骤三，进行花青素特征基因集筛选及潜在功能通路的挖掘；

13、步骤四，通过时序分析与差异基因分析结果获得用于cmap分析的signature基因集，并进行花青素类似的潜在结直肠癌药物筛选。

14、进一步，步骤一中的寻找具有抗结直肠癌作用并与核受体相关的天然小分子化合物，验证抗癌效果，得到最适作用条件包括：

15、(1)背景和文献调研；

16、花青素是天然的黄酮类化合物并且具有抗结直肠癌作用，氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)是花青素的直接受体，具有抗氧化代谢脂质作用；

17、(2)花青素处理结直肠癌细胞系抑制增殖；

18、与对照组相比，处理组的生长抑制作用随时间的增加先增加后降低，随浓度的增加而增加；且实验证明浓度为0.1μm、1μm、10μm&100μm，时间为12h、24h、48h&72h的条件下，生长抑制效应最大的条件为采用100μm作用12h。

19、进一步，花青素的直接核受体为ppar，结直肠癌细胞系为ht29。

20、进一步，步骤二中的通过转录组测序分析，系统评估花青素的结构、浓度和时间对ht29细胞基因表达的影响包括：

21、(1)对浓度、时间和结构处理组与对照组ht29细胞进行转录组测序，上游质控后对三个重复数据进行合并；

22、(2)计算tpm值进行聚类分析基因在不同结构、浓度和时间下的全表达谱情况；

23、(3)秩-秩超几何重叠分析不同结构、浓度和时间之间表达模式相同/相反；

24、(4)将三种花青素在不同浓度下的数据进行均值整合并进行gsea分析，获得富集的功能通路。

25、进一步，步骤二中的处理组浓度为1μm、100μm，时间为12h、24h，结构为无糖基、单糖基和双糖基。

26、进一步，步骤三中的花青素特征基因集筛选及潜在功能通路挖掘包括：

27、(1)对三种花青素进行时间序列分析，每组分析8种模式，选取12h具有显著变化的模式；

28、(2)选取花青素12h显著变化的基因集进行kegg通路富集分析，挖掘潜在的功能通路；

29、(3)通过分析已有文献中的ppar chip数据集，与基因集取重叠基因集进行假设检验和kegg分析，确定花青素效应的潜在作用通路。

30、进一步，步骤四中的通过时序分析与差异基因分析结果获得用于cmap分析的signature基因集，并进行花青素类似的潜在结直肠癌药物筛选包括：

31、(1)选取花青素12h处理的数据进行差异基因分析，与时序分析基因集取重叠，作为cmap匹配分析的signature基因集；

32、(2)在线网站clue进行cmap分析；点击tools-query，queryparameters选择geneexpression、touchstone、latest；按照上下调输入signature基因集，点击submit开始匹配分析；

33、(3)下载compound结果表格，通过筛选crc细胞系，norm_cs分数≥1.5，得到小分子药物集合；通过匹配药物target_name与ppar chip基因集和文献调研药物抗癌类型和作用，筛选出潜在的抗结直肠癌药物；

34、(4)下载shrna和overexpression结果表格，通过步骤(3)中的条件，得到相应的基因集；对两种基因集进行kegg分析，与ppar chip基因集kegg结果匹配，验证signature基因高度代表花青素抑制癌症功能的分子机制。

35、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

36、第一，本发明通过体外细胞活力实验验证花青素在crc中的实际作用效果，并探究其最适作用条件。本发明转录组测序分析了花青素抗结直肠癌效应的功能通路，与花青素受体ppar chip基因集结合，表明signature基因在很大程度上是花青素效应的关键靶基因。本发明通过cmap匹配的compound、shrna和overexpression基因集，从文献调研和与ppar chip基因集kegg结果匹配体现了候选药物重新定位的有效性。

37、本发明通过调研得到具有抗结直肠癌的天然小分子化合物花青素，通过对ht29结直肠癌细胞系进行花青素处理后，cck8检测细胞活力，获得花青素的效应和最适作用条件；而后通过转录组测序(rna-seq)进行高通量数据分析，并评估影响因素。本发明通过时序性分析和差异基因分析，筛选出signature基因集，再利用cmap数据库，匹配筛选相应的小分子药物；应用cmap匹配敲除和过度表达的基因集，kegg富集通路与花青素靶基因相关基因的kegg富集通路基本重叠或相似，表明这些基因特征高度代表了花青素抑制癌症的分子机制，从而体现了对筛选得到的候选药物的重新定位的功效支持。

38、第二，本发明提供的潜在抗结直肠癌药物的挖掘方法，通过分析天然小分子化合物花青素对于结直肠癌处理的转录组数据，寻找获得signature靶基因集；再利用cmap数据库，筛选出对应的潜在小分子药物，为拓宽crc的药物选择范围提供了新思路，大大缩短药物发现到临床转化的时间，具有重要的临床治疗意义。

39、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

40、本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

41、筛选潜在抗结直肠癌药物，为治疗结直肠癌的拓宽药物选择。应用已知的抗结直肠癌天然小分子花青素进行类似小分子药物筛选，体现“药食同源”的概念，筛选得到的药物也更加安全。

42、本发明也可用作其他癌症药物筛选应用，并根据使用的天然小分子种类和匹配化合物种类，获得具有抗癌作用的预防保健类小分子。保健类小分子无需临床试验即可上市。