一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒制备方法

本发明涉及免疫学及生物医药，特别涉及一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒制备方法。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，具有十分广阔的应用前景，但肿瘤免疫抑制微环境已成为掣肘肿瘤免疫疗法发挥功效的关键问题，利用纳米颗粒将免疫药物递送至肿瘤部位是改善肿瘤免疫抑制微环境的一种经典方法，但基于人工合成颗粒开发的免疫治疗体系仍存在着制备工艺复杂、药物装载率低、批次间重复性差等一系列难题。近些年，人们通过不断研究发现了细菌天然分泌的单纯细菌外膜囊泡(outermembrane vesicles，omvs)在调节肿瘤免疫抑制微环境中具有一定的潜力，细菌外膜囊泡(omvs)是一种由革兰氏阴性菌外膜向外凹陷分泌的囊泡状纳米颗粒，囊泡包含了革兰氏阴性菌的外膜的pamp分子(如脂多糖、外膜蛋白等)，能够通过免疫细胞的toll样受体(toll-like receptors，tlr)高效激活免疫细胞。此外，omvs直径在20～200nm之间，是纳米药物的理想尺寸，可以通过实体瘤的高通透和长滞留(enhancedpermeabilityandretention，epr)效应实现在肿瘤部位的有效累积。然而，直接静脉注射omvs毒副作用较强，会引起全身的细胞因子风暴、坏血等，极大地限制了其应用。

2、多巴胺是人体大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，有研究发现其能在微碱性环境下(ph为7.5～8.0)吸附在任何物质的表面，同时还可以调控中枢神经系统的多种生理功能，在临床上被广泛用于心肌梗死，肾功能衰竭，内毒素败血症等疾病的治疗。此外，其良好的生物相容性还作为一些材料、药物的涂层或表面修饰物用于肿瘤、心血管疾病的治疗中。

3、纳米酶是一种模拟天然酶活性的人工合成酶，由一些活性较强的贵金属(au、pt等)经过修饰制备，其催化活性与其粒径大小成反比。并且相比天然酶的蛋白成分而言，纳米酶与底物的反应受环境的约束力较小。在近些年的研究中，金纳米粒子表现出优异的模拟酶活性，类似于过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶或还原酶，而且与生物酶相比，金纳米酶具有易合成、可调性好、生物相容性好、成本低等优点，对于竞争肿瘤微环境营养成分(葡萄糖)、调控肿瘤糖代谢、产生过氧化氢、改变肿瘤组织氧化还原环境、肿瘤的治疗均具有重要意义，然而纳米酶的递送限制了其生物医学应用。如果能利用细菌外膜囊泡和纳米酶设计一种在肿瘤微环境下也能高效激活免疫细胞的纳米颗粒，则有利于纳米药物在医学上的应用。

技术实现思路

1、为了解决细菌外膜囊泡毒副作用以及纳米酶递送困难的问题，本发明设计了一种制备纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的方法，主要是将细菌外膜囊泡与五羟基多巴胺、硫酸亚铁通过一锅法得到聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡，再与haucl4孵育后还原后制得，制得的纳米颗粒可以通过免疫-饥饿-化学动力联合杀伤肿瘤。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供了一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：

4、s1、将大肠杆菌活化后连续传代培养，培养至对数期后再用iptg诱导其产生细菌外膜囊泡；

5、s2、将步骤s1提取的细菌外膜囊泡与多巴胺、硫酸亚铁、peg2000通过一锅法制得聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡omv-df；

6、s3、将步骤s2制得的聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡与haucl4避光孵育，再经还原得到纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒omv-dfa。

7、在其中一些实施例中，所述步骤s1具体为：将大肠杆菌通过培养基活化并培养至对数期后接种于新培养基中，100～300r/min、37℃下培养1～3h；再加入iptg诱导剂诱导3～5h，收集菌液后6000～8000r/min离心收集上清，抽滤、浓缩上清并去除细菌碎，最后130000～150000g超高速离心提取得到细菌外膜囊泡。

8、在其中一些实施例中，所述iptg诱导剂的终浓度为10～30μg/ml。

9、在其中一些实施例中，所述步骤s2具体为：先将步骤s1提取的细菌外膜囊泡重悬于tris-hcl-hepes缓冲液中至其终浓度为1～2mg/ml，然后依次加入多巴胺、硫酸亚铁、peg2000于20～30r/min反应1～2h，再14000～15000g离心10～15min得到沉淀为聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡omv-df。

10、在其中一些实施例中，所述细菌外膜囊泡与多巴胺、硫酸亚铁、peg2000的质量比为1～3：0.2～0.6：0.01～0.03：0.001～0.002。

11、在其中一些实施例中，所述细菌外膜囊泡与多巴胺、硫酸亚铁、peg2000的质量比为2：0.5：0.01：0.001。

12、在其中一些实施例中，所述步骤s3具体为：将步骤s2的沉淀omv-df重悬于pbs缓冲液中并冰水浴超声5～15min，再加入浓度为130～160μm/ml的haucl4溶液避光4℃孵育1～3h，之后用碱性溶液调节其ph为8～9，最后加入nabh4快速搅拌5min后得到纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒omv-dfa。

13、本发明第二方面提供了采用第一方面所述的制备方法所制得的纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒。

14、本发明第三方面提供了第二方面所述的纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

15、在其中一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。

16、相比现有技术，本发明所取得的有益效果如下：

17、本发明公开了一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒及其制备方法，先将大肠杆菌活化后连续传代培养，培养至对数期后用iptg诱导其产生细菌外膜囊泡，然后将细菌外膜囊泡与五羟基多巴胺、硫酸亚铁通过一锅法制备得到聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡omv-df，最后将聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡与haucl4避光孵育，再经还原得到纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒omv-dfa。本发明制得的纳米颗粒omv-dfa具有epr效应，并在肿瘤部位蓄积，而且多巴胺外壳可屏蔽细菌外膜囊泡毒性，使得纳米颗粒omv-dfa对血液、脏器等正常组织无毒；该纳米颗粒omv-dfa还可以在肿瘤微酸环境下解聚表面的多巴胺层，这时，暴露在肿瘤微环境下的omvs可高效激活免疫细胞，诱导自身免疫反应杀伤肿瘤；同时金纳米酶可消耗肿瘤微环境葡萄糖产生过氧化氢，与铁离子通过类芬顿反应产生羟基自由基杀伤肿瘤，从而达到免疫-饥饿-化学动力联合杀伤肿瘤的目的。

技术特征：

1.一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：将大肠杆菌通过培养基活化并培养至对数期后接种于新培养基中，100～300r/min、37℃下培养1～3h；再加入iptg诱导剂诱导3～5h，收集菌液后6000～8000r/min离心收集上清，抽滤、浓缩上清并去除细菌碎，最后130000～150000g超高速离心提取得到细菌外膜囊泡。

3.根据权利要求2所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述iptg诱导剂的终浓度为10～30μg/ml。

4.根据权利要求1所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：先将步骤s1提取的细菌外膜囊泡重悬于tris-hcl-hepes缓冲液中至其终浓度为1～2mg/ml，然后依次加入多巴胺、硫酸亚铁、peg2000于20～30r/min反应1～2h，再14000～15000g离心10～15min得到沉淀为聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡omv-df。

5.根据权利要求4所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述细菌外膜囊泡与多巴胺、硫酸亚铁、peg2000的质量比为1～3：0.2～0.6：0.01～0.03：0.001～0.002。

6.根据权利要求5所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述细菌外膜囊泡与多巴胺、硫酸亚铁、peg2000的质量比为2：0.5：0.01：0.001。

7.根据权利要求1所述一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：将步骤s2的沉淀omv-df重悬于pbs缓冲液中并冰水浴超声5～15min，再加入浓度为130～160μm/ml的haucl4溶液避光4℃孵育1～3h，之后用碱性溶液调节其ph为8～9，最后加入nabh4快速搅拌5min后得到纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒omv-dfa。

8.采用权利要求1～7任意一项所述制备方法制得的纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒。

9.权利要求8所述的纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及免疫学及生物医药技术领域，特别涉及一种纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒制备方法。所述制备方法具体包括：先将大肠杆菌连续传代培养至生长稳定，再将活化后培养至对数期的大肠杆菌用IPTG诱导其产生细菌外膜囊泡；然后将细菌外膜囊泡与五羟基多巴胺、硫酸亚铁通过一锅法得到聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡(OMV‑DF)；最后将聚多巴胺铁包覆的细菌外膜囊泡与HAuCl<subgt;4</subgt;避光孵育，再还原得到纳米金@聚多巴胺铁包覆细菌外膜囊泡的纳米颗粒(OMV‑DFA)。制备的纳米颗粒兼具葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶活性、无毒性、激活自身免疫等优点。

技术研发人员：张帆,梅林,李倩倩,张锦勰,欧美彤,余永康,曾伟伟
受保护的技术使用者：中山大学·深圳
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15