一种口服递送罗伊式乳杆菌微胶囊及其制备和应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及口服递送罗伊式乳杆菌微胶囊及其制备和应用。

背景技术：

1、人体肠道内存在大量的微生物，正常情况下，肠道内的不同菌群共同维持着肠道内微生态系统的平衡，提供人体所需营养，抵抗病原体入侵和调节肠道黏膜细胞的增殖，参与消化、分解代谢药物和毒物、以及免疫调节等功能。肠道微生物群是肠道微生态系统的主体部分，其中含量最多的是肠道细菌。肠道细菌主要分为三大类，即有益菌、有害菌和机会致病菌。有益菌主要指益生菌群，可以合成多种维生素和蛋白质，为机体提供营养，还能增强机体的免疫功能。有害菌能够释放毒素诱导基因突变而致癌。机会致病菌指的是在机体缺乏免疫力时，全身播散性感染或者移居到其他部位造成感染的病原体。肠道菌群的平衡在一定程度上决定机体的健康状况，肠道菌群失调会影响肠道内部微环境和肠道细胞功能，比如有益菌数量减少，使得肠道抗氧化性降低，粘膜层损伤加重，一些致病菌会破坏促炎和抗炎细胞因子之间的平衡、对黏膜屏障造成损伤等，有害菌持续增加，会提高癌细胞的增殖能力，进一步促进结直肠癌(colorectal cancer，crc)进展，并限制免疫治疗疗效。肠道微生物的种类和数量直接影响肠道微生态的平衡，关系着结直肠上皮细胞的代谢及功能。调控肠道微生态可通过调节多个信号通路，改变肿瘤微环境，从而起到crc治疗作用。因此，解码肠道菌群和crc之间的机制关联，通过调节肠道菌群来治疗结肠癌至关重要。

2、益生菌的作用包括抑制炎症、调节宿主免疫系统、维持肠上皮屏障、促进致癌物失活及癌组织凋亡，减缓或逆转肠道微生态失调带来的负面影响。近年来，许多学者的研究发现了益生菌在crc患者中的治疗作用，并认为，在临床治疗crc时，可合理使用益生菌，以恢复肠道菌群平衡，降低化疗副作用，达到抑制crc进展的效果。尽管益生菌的相关功效在实验室条件下已得到证实，但有些功效在人体中往往不能完全实现，因为要想获得确切的治疗功效，必须满足两个条件：1)益生菌在被人体摄入时必须保持一定活性；2)必须有足够数量的益生菌定植于肠道中。为了提供它们的健康作用，益生菌必须保持一定的活菌数。这就要求益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定，然而，在贮藏、运输、销售和消费过程中，益生菌受到诸如食品组分(酸、氧、添加剂等)、其它微生物、储存温度、ph、后酸化、h2o2和宿主消化系统(胃酸、胆盐、酶)等的影响，以致活菌数大幅下降，最终定植于肠道中的活菌数低于理论上能够发挥生理作用的最小值。

3、此外，随着现代医疗的不断发展，抗生素的种类越来越多，存在着一些抗生素的滥用情况，有些致病菌开始出现了抗药性，而益生菌、有益菌等基本都被抗生素杀死。其原因之一就是现在益生菌的耐药性较差。目前还没有发现哪种益生菌有着对抗生素的耐受性。也就是说，抗生素在杀害有害菌时，也对有益菌产生了致命的伤害。所以，通过一些方式方法来提高益生菌对抗生素的耐受性十分有必要。

4、微胶囊化技术是一项用途广泛而又发展迅速的新技术，利用微胶囊技术将益生菌包埋在肠溶性壁材中，理论上来讲，不仅可以增强菌体对不良环境的抵抗性，还能使微胶囊中的益生菌在肠道适宜条件下快速释放出来，显著提高菌体在肠道中的存活率，真正发挥益生菌的健康作用。但是，影响益生菌微胶囊活性的因素有很多，许多理论和实际问题需要更进一步深入探讨并逐步解决，如：在外界不良环境情况下和胃肠道中提高菌的存活率机理较为复杂，理论研究还需进一步深入；开发新型易降解的壁材，需要针对壁材、包埋方式以及包埋方法三者是否对益生菌微胶囊存活率存在协同作用等进行研究。

5、cn104911171a公开了以海藻酸钠、明胶复合凹土制备益生菌微胶囊的方法，该方法首先是纯化凹土，其次将凹土与海藻酸钠、明胶混合成复合壁材，接着将已制备好的益生菌菌悬液在一定的条件下与上述复合壁材混合均匀，然后缓慢滴入cacl2中固化成型，最后真空冷冻法干燥，获得益生菌微胶囊，此方法制备得到的益生菌微胶囊包埋物质的活性较低和存活率较低。

6、cn102228235a公开了一种益生菌微胶囊的制备方法及其应用，采用将海藻酸钠溶液与变性淀粉溶液等体积混合，再与益生菌混合，通过喷雾器喷嘴喷入cacl2溶液中，静置固化后生理盐水洗涤过滤，这种方法虽然在一定程度增强了胶囊壁的机械强度，但是所得到的胶囊大小难于控制，很难应用于食品以及药品当中工业生产，而且加入变性淀粉后，微胶囊的ph敏感释放的特性减弱，导致其在进入胃部后，部分微胶囊在胃部的酸性环境下表面无法变得致密，而在肠道的弱酸环境下又无法迅速崩解，释放出包埋的益生菌。

7、临床上，口服给菌被认为是一种无创且安全的方法，能实现自我给药且灵活处理药量，有助于更大的患者依从性。但是，益生菌通过口服的方式在宿主体内发挥其功能面对着很大的挑战，强酸性的胃液、各种消化酶和胆盐会导致大量的益生菌死亡，从而使益生菌在肠道中的应用受到限制。所以，要想实现口服益生菌功能的最大化，就需要设计能够保持细菌自主性和动态功能的递送系统，提高细菌在体内的活力，进而促进细菌递送系统的临床转化。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种口服递送罗伊氏乳杆菌(l.r)微胶囊及其制备和应用，所述微胶囊实现l.r功能的最大化，保护l.r免受胃液侵蚀顺利抵达肠道，通过调节肠道菌群来发挥抗肿瘤作用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一方面，在于提供一种罗伊氏乳杆菌(l.r)微胶囊，为l.r@(sa-cs)2微胶囊。

4、本发明的第二方面，在于提供上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)将光密度为1×106～1.2×108cfus/ml的益生菌l.r与浓度为1～5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第一悬液；将第一悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第二悬液；将第二悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)；其中，益生菌l.r与海藻酸钠水溶液的第一体积比、第一悬液与氯化钙水溶液的第二体积比、第二悬液与壳聚糖水溶液的第三体积比均为1:(35～50)；

6、(2)将l.r@(sa-cs)用生理盐水重悬，得到l.r@(sa-cs)悬液；将l.r@(sa-cs)悬液与浓度为1～5mg/ml的无菌海藻酸钠水溶液混合并搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第三悬液；将第三悬液加入到浓度为1～2mol/l的氯化钙水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，用生理盐水重悬得到第四悬液；将第四悬液加入到浓度为1～2mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌，离心分离沉淀、洗涤，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊；其中，l.r@(sa-cs)悬液与海藻酸钠水溶液的第四体积比、第三悬液与氯化钙水溶液的第五体积比、第四悬液与壳聚糖水溶液的第六体积比均为1:(35～50)。

7、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，第一体积比、第二体积比、第三体积比、第四体积比、第五体积比和第六体积比相同。

8、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

9、(1)将2ml光密度为1×108cfus/ml的益生菌l.r与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到中间产物，记为l.r@(sa-cs)。

10、(2)将l.r@(sa-cs)用2ml生理盐水重悬，得到2ml l.r@(sa-cs)悬液，将其与98ml浓度为5mg/ml的海藻酸钠水溶液混合并在室温搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；然后，转入98ml浓度为1.1mol/l的氯化钙水溶液中室温搅拌10～15min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，用2ml生理盐水重悬；最后，转入98ml浓度为1mg/ml的壳聚糖水溶液中搅拌20～30min，离心分离沉淀、用pbs洗涤后，得到产物，记为l.r@(sa-cs)2微胶囊。

11、本发明的第三方面，在于提供上述l.r@(sa-cs)2微胶囊的应用。

12、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备调节肠道菌群的口服益生菌制品中的应用。

13、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备耐胃酸的口服益生菌制品中的应用。

14、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备耐胆酸的口服益生菌制品中的应用。

15、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备改善抗生素引起的菌群失调症的口服益生菌制品中的应用。

16、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。

17、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊与gpr109a激动剂的联合在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。

18、在本发明的一具体实例中，上述l.r@(sa-cs)2微胶囊与mk-6892的联合在制备治疗结肠癌的口服制品中的应用。

19、本发明中，室温是指25-37℃。

20、相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

21、(1)本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊实现了l.r的缓慢释放而未影响l.r的活力，l.r@(sa-cs)2微胶囊减缓l.r的代谢过程而未影响l.r的代谢功能以及引起肿瘤细胞发生凋亡的功能。

22、(2)口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊能够保护l.r免受胃液侵蚀顺利抵达肠道，并通过产生某些代谢产物引起结肠癌细胞的大量凋亡。而且，在抗生素预处理的情况下，l.r@(sa-cs)2微胶囊仍然能进入肠道内代谢产生scfas，使肿瘤部分减小。

23、(3)口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊能明显调节肠道菌群，使有害菌减少和产丁酸的有益菌增多，进而通过菌群来发挥治疗结肠癌的作用。而且，相较于对照组，口服本发明的l.r@(sa-cs)2微胶囊和mk-6892的结肠癌小鼠的肿瘤抑制率为93％，肿瘤抑制效果显著，且具有很好的生物相容性。

24、(4)本发明制备过程简单，耗时短，且成本低。