一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法与流程

本技术涉及生物医药，具体是一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统及制备方法。

背景技术：

1、mrna是由dna的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，大小为300~5000kda，长度为1~15kb。与dna相比，mrna不进入细胞核，在细胞质中即可完成蛋白质的合成并发挥功能活性，而dna需要先进入细胞核，然后转录成mrna，使dna的效率低于mrna。另外mrna不会插入基因组，而只是瞬时表达编码蛋白，从而降低了插入基因组引起突变的风险，因此安全性较好，且mrna很容易通过体外转录过程合成，过程简单，工业化生产成本相对低，可以快速应用于各种疗法，应用潜力极其广泛。

2、mrna在理论上能够表达任何蛋白，通过体内表达功能蛋白，发挥多种疾病的治疗作用，但mrna的单链结构致使其极为不稳定，易被降解，而且自身携带负电荷，穿过表面同为负电荷的细胞膜递送亦是难题。因此，mrna递送到细胞内部共有两道屏障：一是递送途中的酶降解；二是静电排斥致使的膜屏障，因此在实际应用过程中，需要对mrna进行特殊修饰并与递送系统配合才能实现mrna的胞内表达。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，lnp）是目前最热门的递送技术，承载mrna的lnp载体除了含有带负电荷的mrna外，另有四种成分为可电离的阳离子磷脂（ionizable lipids）、中性辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂（pegylated lipid），可以保护mrna分子胞外降解，或者促进mrna分子与细胞膜融合提高转染。目前最常用的mrna疫苗递送手段除了脂质纳米粒（lipidnanoparticle，lnp），还有阳离子脂质复合物(lipoplex，lpx)、脂质多聚复合物(lipopolyplex，lpp)、聚合物纳米颗粒（polymer nanoparticles，pnp）、无机纳米颗粒（inorganic nanoparticles，inp）和阳离子纳米乳(cationic nanoemulsion，cne)等。

3、但是上述现有的mrna递送系统存在以下问题：一是这些纳米颗粒部分由外源性成分组成，lnps激活不同的炎症途径，这将导致炎症细胞因子的产生，如il-1和il-6，可以启动和维持局部和全身炎症和副作用，目前mrna疫苗的副作用多数来自于lnp的成分，比如peg、电离脂质等，会导致发生针对递送系统的天然免疫或适应性免疫；二是制备工艺复杂，mrna/lnp传统的制备方法是两相混合再经均质技术（高压均质机、高压微射流）或者挤出技术（聚碳酸酯膜过滤器）控制粒径，工艺要求高使得制备难度高；三是这类制剂都需要肌肉注射，使用不方便；四是脂质纳米颗粒需要低温保存，因此非常不稳定。

4、综上，亟需一种生物相容性好、易制备、可口服、易保存的mrna递药系统。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统及制备方法，该装载mrna的乳头瘤病毒样纳米颗粒稳定性好，可以确保载入mrna的乳头瘤病毒样颗粒完整地在体内运输，且具有良好的生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性，相较于现有技术，目的蛋白的表达量更高。

2、根据本技术的一个方面，提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下过程：将mrna装载于乳头瘤病毒样颗粒的内部，获得所述mrna递药系统。

3、可选地，所述过程具体包括以下步骤：

4、1）将所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液混合后解离，获得溶液a；

5、2）将mrna加入所述溶液a中混合后，获得溶液b；

6、3）将所述溶液b与终止缓冲液混合后进行重组装，获得含有所述mrna递药系统的溶液c。

7、可选地，所述解离缓冲液包含乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(egta)、二硫苏糖醇(dtt)、氯化钠(nacl)和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)；优选地，所述解离缓冲液中，所述乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(egta)浓度为20±1mm，所述二硫苏糖醇(dtt)浓度为40±2mm、所述氯化钠(nacl)浓度为300±10mm，所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)浓度为100±5mm；优选地，所述乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(egta)浓度为20mm，所述二硫苏糖醇(dtt)浓度为40mm、所述氯化钠(nacl)浓度为300mm，所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)浓度为100mm。

8、优选地，所述解离时间为50~70min，优选地，为60min。

9、优选地，所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液的体积比为1：0.9~1.1,优选地，为1：1。

10、可选地，所述终止缓冲液包含氯化钙(cacl2)和二甲基亚砜(dmso)；优选地，所述终止缓冲液中，所述氯化钙(cacl2)浓度为25±1mm，所述二甲基亚砜(dmso)的浓度为20±1vol％；优选地，所述终止缓冲液中，所述氯化钙(cacl2)浓度为25mm，所述二甲基亚砜(dmso)的浓度为20vol％。

11、优选地，所述重组装温度为2~6℃，优选地，为4℃。

12、可选地，所述步骤3）之后还包括步骤4）用于提纯所述mrna递药系统：

13、4）首先向蔗糖/pbs层上加入所述溶液c，一次离心后收集一次沉淀，然后加入pbs重悬后，将获得重悬液加入至cscl溶液中，二次离心收集二次沉淀，最后用滤膜过滤嵌合，获得所述提纯后的mrna递药系统；

14、优选地，所述一次离心条件为27000r/min 4℃离心3h；优选地，所述二次离心条件为35000r/min 4℃离心20h。

15、可选地，所述乳头瘤病毒样颗粒由乳头瘤病毒主要衣壳蛋白l1组成。

16、可选地，所述mrna为经过修饰的mrna，所述经过修饰的mrna具有5’帽子、5’和3’-非翻译区和3’-polya尾。

17、优选地，所述修饰还包括使用化学修饰的核苷酸代替常规核苷酸，用5-甲基胞苷（m5c）代替胞苷，和/或用5-甲基尿苷（m5u）代替尿苷，和/或用n1-甲基腺苷（m1a）、n6-甲基腺苷（m6a）、2-硫尿苷（s2u）、5-甲氧基尿苷（5mou）、假尿苷（ψ）或n1-甲基假尿苷（m1ψ）代替腺苷。

18、可选地，所述mrna可以编码抗体蛋白、肿瘤抗原和病原体蛋白中的一种或多种。

19、根据本技术的另一个方面，提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统，其特征在于，所述mrna递药系统根据上述任一种制备方法制备获得。

20、可选地，所述mrna递药系统注射或口服使用；优选地，所述mrna递药系统口服使用。

21、本技术的有益效果包括但不限于：

22、1. 本技术提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统的制备方法，制备获得了以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统，为mrna的递送提供了一种新的思路和方法，并且相较于脂质纳米颗粒（lnp）和多聚体方式，本技术提供的制备方法工艺简单，且该口服mrna递药系统具有非免疫原性，不易引起过敏反应等潜在不良事件。

23、2. 本技术提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统，具有良好的稳定性和生物相容性，可以确保该递药系统可以完整地在体内运输，并且具有可生物降解的特性，是理想的易降解药物的运载体。

24、3. 本技术提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mrna递药系统，通过口服的途径进入肠道，免疫细胞通过与乳头瘤病毒受体结合，以胞饮方式mrna可完整进入细胞内并表达相应蛋白质，表达的蛋白质为各类抗体和免疫调节因子等起到防病治病的作用，相比于现有的质粒递送技术方案，该mrna递药系统的目的蛋白表达量更高。