一种类病毒结构的核酸药物递送载体及其制备和应用

本发明属于属于生物医药，尤其涉及一种类病毒结构的核酸药物递送载体及其制备和应用。

背景技术：

1、据世界卫生组织(who)预计，在未来20年内，全球癌症例数可能会增加60％，攻克癌症难题已刻不容缓。临床上常见治疗方法包括肿瘤切除、消融治疗、tace、放射治疗、系统抗肿瘤治疗等多种手段，肿瘤早期(cnlcia、ib、iia期)的首选治疗方式是手术切除、消融治疗以及tace，但对于中晚期肿瘤(cnlciib、iiia、iiib期)手术等治疗手段的疗效总体差强人意，存在无法有效抑制肝癌复发和转移、病人预后差、五年生存率不高等问题。

2、肿瘤免疫监测是一种重要的免疫系统对新生肿瘤细胞进行识别和消除的过程。通常，免疫系统可根据肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞侵入健康组织时t细胞予以识别并消除。但是，肿瘤也存在“免疫逃逸”，例如，肿瘤细胞表面高表达免疫抑制分子pdl1，诱导t细胞功能缺失或呈现耗竭状态，阻碍其对肿瘤细胞的有效杀伤。pd1/pdl1信号通路是多种癌症中免疫应答的关键检查点，免疫检查点阻断疗法已被广泛应用于临床上一线抗肿瘤治疗。例如，阿替利珠单抗(pdl1)联合贝伐珠单抗(vegf)以及信迪利单抗(pd1)联合贝伐珠单抗类似物(达攸同)被批准用于既往未接受过全身系统性治疗的不可切除肝癌病人，降低了疾病进展风险和死亡风险。然而，由于个体差异大、总体响应率低，免疫检查点阻断疗法仍无法满足肿瘤病人免疫治疗的临床需求。

3、pbrm1基因在抵抗t细胞攻击中发挥了关键作用，pbrm1缺陷导致t细胞浸润增加和对免疫检查点抑制剂更敏感，因此，pbrm1基因成为增强肿瘤免疫检查点阻断治疗的潜在靶点。基因治疗是通过递送核酸序列编辑特定的基因异常或突变，常见的基因治疗方法包括：rna适配体、mrna、aso和rna干扰等。rna干扰(rnainterference，rnai)是由sirna形成的risc复合物可以靶向特定mrna，并对其进行剪切降解，从而产生基因沉默效果。但是，基因治疗的临床应用仍然面临着如下问题：1)稳定性：避免血清中多种核酸酶的降解、吞噬细胞的清除作用等才能到达靶细胞；2)靶向性：核酸药物的非特异性分布会降低靶组织的局部浓度；3)溶酶体逃逸：胞吞-溶酶体的递送途径，不可避免的导致蛋白酶体对核酸药物的过度降解。

4、因此，探索安全、高效的核酸药物胞质递送策略，成为减少肿瘤免疫逃逸，增加肿瘤免疫治疗响应率，提高免疫治疗效果的关键。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种类病毒结构的核酸药物递送载体及其制备和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种类病毒结构的核酸药物递送载体，所述核酸药物递送载体由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为过表达免疫检查点蛋白-mcherry红色荧光蛋白融合蛋白的细胞膜囊泡，所述内核为包埋有目标核酸药物的脂质磷酸钙纳米颗粒；

4、其中，所述免疫检查点蛋白为pd1蛋白、tigit蛋白、trail蛋白或pdl1蛋白；

5、其中，所述目标核酸药物为质粒、核酸适配体、信使rna、抗基因、核酶、反义寡核苷酸、小干扰rna、短发夹rna、小分子rna或疫苗免疫佐剂cpg。

6、上述一种核酸药物递送载体的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)将免疫检查点蛋白-mcherry红色荧光蛋白融合蛋白基因序列插入到pcdh-cmv-puro空载质粒中，获得重组质粒；重组质粒使用293ft细胞进行慢病毒包装，浓缩病毒液感染293ft细胞，加入polybrene增强感染效率，用抗性药物puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；稳转细胞株扩大培养，收集细胞，用细胞膜抽提试剂获取细胞膜，分散于pbs中，得到细胞膜悬液；

8、(2)以cacl2为钙源、na2hpo4为磷源、二油酰磷脂酸钠盐(dopa)为表面活性剂，利用微乳液法在环己烷/co-520体系中合成疏水性的包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒；利用超声法以二油酰基卵磷脂(dopc)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)作为外层脂质包覆所述包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒，形成亲水性的脂质磷酸钙纳米颗粒；

9、(3)细胞膜悬液通过超声使其分散均匀，再与脂质磷酸钙纳米颗粒混合，通过挤膜器梯度挤压得到粒径均一的类病毒结构的核酸药物递送载体；

10、步骤(1)中，所述免疫检查点蛋白-mcherry红色荧光蛋白融合蛋白基因序列如seqid no.1所示；

11、步骤(2)中，所述脂质磷酸钙纳米颗粒的制备具体为：将环己烷和co-520按照体积比7：3混合，得到环己烷/co-520混合液；向3ml环己烷/co-520混合液加入40μl 0.5m cacl2和10μl 100μm目标核酸药物，室温搅拌，得到混合液a；向3ml环己烷/co-520混合液加入74μl 0.1m na2hpo4和74μl 35mm dopa，室温搅拌，得到混合液b；将3.05ml混合液a加入至3.148ml混合液b中，室温搅拌，而后加入6.198ml无水乙醇，离心，所述沉淀用无水乙醇洗涤后重悬于400μl氯仿中，得到包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒悬液；将200μl包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒悬液与15μl 35mm dopc、5μl35mm dotap混合均匀，加入至1ml ddh2o中，在细胞超声破碎仪中冰浴超声5min，然后旋转蒸发去除多余氯仿，即得到亲水性的脂质磷酸钙纳米颗粒。

12、步骤(3)中，所述细胞膜悬液：脂质磷酸钙纳米颗粒的质量比为1：1，所述细胞膜悬液的浓度为10mg/ml(以膜蛋白计量)；

13、步骤(3)中，所述梯度挤压为依次通过孔径400nm、200nm的滤膜进行挤压。

14、上述一种核酸药物递送载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

15、本发明的显著优点在于：

16、(1)本发明中核酸药物递送载体的合成步骤条件温和，不影响蛋白质的活性，同时也避免了对药物分子结构的破坏；

17、(2)本发明中核酸药物递送载体具有溶酶体逃逸能力，可实现核酸药物的高效胞内递送，敲低细胞内特定基因表达水平；

18、(3)本发明中核酸药物递送载体具有免疫检查点抑制剂的功能，可与商业化单克隆抗体相媲美；

19、(4)本发明中核酸药物递送载体具有免疫佐剂的功能，可激活dc细胞；

20、(5)本发明中核酸药物递送载体可实现核酸药物、免疫佐剂(cap)和免疫检查点抑制剂的同时高效递送；

21、(6)本发明中核酸药物递送载体显著增强肿瘤免疫治疗效果。

技术特征：

1.一种类病毒结构的核酸药物递送载体，其特征在于：所述核酸药物递送载体由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为过表达免疫检查点蛋白-mcherry红色荧光蛋白融合蛋白的细胞膜囊泡，所述内核为包埋有目标核酸药物的脂质磷酸钙纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的核酸药物递送载体，其特征在于：所述免疫检查点蛋白为pd1蛋白、tigit蛋白、trail蛋白或pdl1蛋白。

3.根据权利要求1所述的核酸药物递送载体，其特征在于：所述目标核酸药物为质粒、核酸适配体、信使rna、抗基因、核酶、反义寡核苷酸、小干扰rna、短发夹rna、小分子rna或疫苗免疫佐剂cpg。

4.一种权利要求1所述的核酸药物递送载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述免疫检查点蛋白-mcherry红色荧光蛋白融合蛋白基因序列如seq id no.1所示。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述脂质磷酸钙纳米颗粒的制备具体为：将环己烷和co-520按照体积比7：3混合，得到环己烷/co-520混合液；向3ml环己烷/co-520混合液加入40μl 0.5m cacl2和10μl 100μm目标核酸药物，室温搅拌，得到混合液a；向3ml环己烷/co-520混合液加入74μl 0.1m na2hpo4和74μl 35mm二油酰磷脂酸钠盐，室温搅拌，得到混合液b；将3.05ml混合液a加入至3.148ml混合液b中，室温搅拌，而后加入6.198ml无水乙醇，离心，所述沉淀用无水乙醇洗涤后重悬于400μl氯仿中，得到包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒悬液；将200μl包埋有目标核酸药物的磷酸钙纳米颗粒悬液与15μl 35mm二油酰基卵磷脂、5μl 35mm (2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵混合均匀，加入至1ml ddh2o中，在细胞超声破碎仪中冰浴超声5min，然后旋转蒸发去除多余氯仿，即得到亲水性的脂质磷酸钙纳米颗粒。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述细胞膜悬液：脂质磷酸钙纳米颗粒的质量比为1：1；以膜蛋白计量，所述细胞膜悬液的浓度为10mg/ml。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述梯度挤压为依次通过孔径400nm、200nm的滤膜进行挤压。

9.如权利要求1所述的核酸药物递送载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种类病毒结构的核酸药物递送载体及其制备和应用。所述核酸药物递送载体由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为过表达免疫检查点蛋白‑mCherry红色荧光蛋白融合蛋白的细胞膜囊泡，所述内核为包埋有目标核酸药物的脂质磷酸钙纳米颗粒，所述免疫检查点蛋白为PD1蛋白、TIGIT蛋白、TRAIL蛋白或PDL1蛋白，所述目标核酸药物为质粒、核酸适配体、信使RNA、抗基因、核酶、反义寡核苷酸、小干扰RNA、短发夹RNA、小分子RNA或疫苗免疫佐剂CpG。所述核酸药物递送载体制备条件温和，其具有溶酶体逃逸能力，可实现核酸药物、免疫佐剂和免疫检查点抑制剂的同时高效递送，具有敲低肿瘤细胞PDL1/Pbrm1表达，促进DC细胞成熟和免疫检查点阻断的功能；可显著增强肿瘤免疫治疗效果。

技术研发人员：孙宇鹏,刘岩,刘小龙,曾永毅,李瑞
受保护的技术使用者：福建医科大学孟超肝胆医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14