一种新型的软骨基质仿生材料的制备方法

本发明涉及医学及生物医学工程领域，特别涉及一种新型的软骨基质仿生材料的制备方法。

背景技术：

1、关节软骨作为一种覆盖在关节骨骨骺表面的结缔组织，高度水化，血管和淋巴管，并且只有单一细胞类型，软骨细胞。关节软骨持续暴露在机械应力下，很容易产生软骨损伤或软骨退化，进而导致骨关节炎的产生。一旦产生软骨缺损，关节软骨几乎不可能自发修复和再生。甚至，由于软骨缺损和骨性关节炎之间存在的恶性循环,会引发软骨破坏加剧和骨性关节炎的长期发展。因此，治疗骨性关节炎的有效方法依赖于成功的软骨移植物的原位植入。

2、在组织工程领域，细胞外基质（ecm），被看作是一种理想生物支架，广泛地应用于组织修复和再生医学，包括软骨修复。ecm是由组织周围的细胞分泌，具有组织特异性的三维微结构和功能性生物活性分子。细胞外基质经过脱细胞处理，去除掉免疫原性的细胞组分，可以做成脱细胞的细胞外基质（decm）支架。支架可以为再生组织提供足够的机械支撑，释放生物信号，引导细胞增殖和组织重塑，最终完成受损组织的修复和替代。但是，传统的天然软骨来源的decm支架存在限制：高细胞量导致脱细胞试剂难以彻底清除且容易损伤ecm；ecm浓缩的硬组织使得与周围软骨的整合存在问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中天然软骨来源的脱细胞软骨移植物存在的细胞外基质（ecm）功能受损及其与周边软骨组织的整合能较差的问题，提供了一种新型的软骨基质仿生材料的制备方法。

2、本发明的目的是这样实现的，一种mwcnt/pcn/co3o4复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

3、（1）制备明胶微球造孔体系：使用双乳液法制备明胶微球，并筛选出直径在150-180 μm的明胶微球，使其均匀分散在含有10% ps的pbs溶液中灭菌待用；

4、（2）构建基质互穿网络：配置海藻酸钠水凝胶预聚液，将步骤（1）筛选出的明胶微球预处理，加入海藻酸钠水凝胶预聚液中，利用微孔水凝胶三维培养系统（ptcc）培养猪的软骨细胞，分泌软骨基质，形成基质互穿网络体系；

5、（3）制备软骨基材：将步骤（2）所构建的基质互穿网络体系，使用cc培养基体外培养30-35天以上，使用柠檬酸钠将海藻酸成分解离，得到载细胞活体透明软骨移植物（hclg）；

6、（4）将步骤（3）制备的透明软骨移植物再培养10-15天，利用脱细胞法获得脱细胞透明软骨移植物（hcmg）；

7、（5）使用硫酸软骨素（cs）与步骤（4）制备的脱细胞透明软骨移植物中的胶原纤维交联，得到加强的脱细胞透明软骨移植物（ehcmg）。

8、进一步的，步骤（1）中所述的双乳液法制备明胶微球，具体包括如下分步：

9、（1.1）将乙酸乙酯与明胶溶液进行混合，于600-800 rpm条件下搅拌1-3 min，得到明胶溶液/乙酸乙酯混合液，即混合乳液1；

10、（1.2）将混合乳液1与大豆油进行混合，于600-800 rpm条件下搅拌1-3 min，得到混合乳液2；

11、（1.3）将混合乳液2温度骤降至10 ℃以下，继续搅拌12-18 min，得到混合乳液3；过滤混合乳液3，移除油相，将过滤后的明胶微球放入-15 ℃至-22 ℃的乙醇之中迅速搅拌；去掉上层乙醇，将下层的明胶微球使用二氧六环及丙酮清洗一次，再使用无水乙醇清洗三次，于烘箱之中烘干过夜，即得明胶微球颗粒。

12、进一步的，所述明胶溶液浓度为0.08-0.12 g/ml，所述明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为1:2.2-2.8；步骤（1.2）中，所述混合乳液1与大豆油的体积比为1:1.3-1.6。

13、进一步的，所述明胶微球的预处理，具体为：将明胶微球颗粒于120-130 ℃加热1.5-2.5 h，再于-15至-23℃速冷0.5-0.8h，得到骤冷后的明胶微球颗粒；将盘尼西林/链霉素（ps）洗液加入骤冷后的明胶微球颗粒中，并使明胶微球颗粒分散开，于4 ℃静置过夜，得到基质互穿网络体系。

14、进一步的，所述ps洗液的制备方法为青霉素/链霉素与磷酸缓冲液（10 mm磷酸盐、150 mm氯化钠，ph值7.3至7.5）混合、过滤；该溶液内含 400-600单位/ml青霉素和 400-600µg/ml链霉素。

15、进一步的，步骤（2）中所述海藻酸基水凝胶预聚液的配置按照，海藻酸钠溶液浓度为1.4-1.7%（wt）；软骨细胞浓度为0.5-1.5*106个/ml，明胶微球造孔体系浓度为0.2-0.4g/ml。

16、进一步的，步骤（3）中，所述体外培养条件为，37 ℃、5% co2环境下培养30-35天，使用柠檬酸钠（浓度为50-58 mm）解离海藻酸钙8-12 min，得到载细胞活体透明软骨移植物（hclg）。

17、进一步的，步骤（3）中，所述cc培养基包括高糖dmem为基础培养基，20 %胎牛血清，1 mmol/l hepes，1 mmol/l丙酮酸钠，0.4 mmol/l脯氨酸，0.1 g/ml 维生素c。

18、进一步的，步骤（4）中，所述脱细胞法，可采用如下的方法之一去制备：

19、方法一、使用曲拉通x-100（triton x-100）法将制备的载细胞活体透明软骨移植物（hclg）进行脱细胞操作，具体步骤包括：

20、a)将制备的hclg浸泡入低渗溶液（0.1-0.3% edta的10-15 mm tris-hcl缓冲液，ph=8-9）24-36小时；

21、b)再使用3-5 %的triton x-100溶液浸泡24-36小时；

22、c)使用1×pbs（50-60 ml）溶液洗涤3-4次，每次3-4小时；

23、d)加入dna酶溶液（0.5-0.75 mg/ml）处理3-4小时；

24、e)使用1×pbs（50-60 ml）溶液洗涤过夜，再用去离子水水洗3-4次，每次3-4小时。

25、方法二、使用曲拉通氢氧化钠（naoh）+曲拉通x-100（triton x-100）法将制备的载细胞活体透明软骨移植物（hclg）进行脱细胞操作。具体步骤包括：

26、a)将制备的hclg浸泡入0.4-0.6 %的naoh溶液处理45-60分钟（2-8℃）;

27、b) 再用含有1% triton x-100的低渗溶液处理48-60小时；

28、c) 浸入pbs溶液洗涤3-4次，每次3-4小时；

29、d) 加入dna酶溶液（0.5 -0.75 mg/ml）处理3-4小时；

30、e) pbs溶液水洗过夜，再用去离子水水洗3-4次，每次3-4小时。

31、方法三、使用曲拉通x-100（triton x-100）+氢氧化钠（naoh）法将制备的载细胞活体透明软骨移植物（hclg）进行脱细胞操作。具体步骤包括：

32、将制备的hclg浸泡入含有1-1.2 % triton x-100的低渗溶液处理48-60小时；

33、再使用0.4-0.6 % 的naoh溶液浸泡45-60分钟（2-8℃）；

34、使用1× pbs（50-60 ml）溶液洗涤3-4次，每次3-4小时；

35、加入dna酶溶液（0.5-0.75 mg/ml）处理3-4小时；

36、使用1×pbs（50-60 ml）溶液洗涤过夜，再用去离子水水洗3-4次，每次3-4小时。

37、进一步的，步骤（5）中的化学加固方法，包括以下步骤：

38、（5.1）称取50-60 mg 脱细胞透明软骨移植物（hcmg），置于20-30 ml 含有40-50 %乙醇的50-60 mm 四吗啉乙磺酸（mes）缓冲液（ph=5.5-6.5）中预处理30-60分钟；

39、（5.2）将脱细胞透明软骨移植物（hcmg）取出，置入20-30 ml 40-50 %乙醇溶液中，其中含有50-60 mm mes，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（edc）与n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的摩尔比为1：1-1:1.2，edc的摩尔浓度分别为5-6 mm，10-12 mm，30-35 mm，50-55mm；

40、（5.3）向反应体系中添加2-3 %（w/v）的硫酸软骨素（cs），室温反应4-5小时，获得4种不同交联剂浓度条件下的加强的脱细胞透明软骨移植物（ehcmg）；

41、（5.4）四种材料都用pbs清洗6-7次，每次2-3小时，然后再用去离子水清洗3-4次，每次2-3小时，以洗去交联剂残留。

42、本发明使用双乳液法制备并筛选出需要的明胶微球，将制备的明胶微球与猪软骨细胞共同封装于海藻酸钠水凝胶中，将含有明胶微球与软细胞的凝胶在37 ℃，5% co2条件下培养35天，培养基为含20 %胎牛血清（fbs）的液体deme（dulbecco's modified eaglemedium）培养基，得到载细胞的活体透明软骨移植物（hclg），针对细胞组织残留会造成制备的透明软骨移植物生物活性降低的缺陷，利用脱细胞方法获得脱细胞透明软骨移植物（hcmg），针对部分活体透明软骨移植物存在的力学性能差这一问题，本发明制备的脱细胞活体透明软骨移植物（hcmg）进行了化学加固，使用硫酸软骨素（cs）脱细胞透明软骨移植物中的胶原纤维交联，对材料进行加固，弥补了过程中多糖的损失，得到加强的脱细胞透明软骨移植物（ehcmg）。