一种用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法与流程

本发明涉及牙龈充填和再生凝胶，特别涉及一种用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法。

背景技术：

1、随着生活水平的提高，人们对口腔美观的要求越来越高，因此近年来牙齿美白以及牙龈萎缩为题逐渐被人们重视起来。牙龈萎缩不仅影响美观还会加重牙槽嵴的吸收从而导致牙齿的松动和掉落。因此完整的牙龈组织对口腔健康和美观是具有重要意义的。

2、现有的牙龈充填和再生技术主要包括自体组织移植手术、补缀治疗等，但是自体移植手术不仅成功率不高而且必须由技术熟练的医生执刀。而补缀治疗方法往往也是不美观且患者的满意度不高。所以这些方法均未达到真正意义上的牙龈组织再生。而借助组织工程学原理重建稳定的牙龈组织也是目前的难点。

3、目前，透明质酸和胶原蛋白作为填充物已经被广泛用于面部组织，但是口腔内部环境完全不同于其他脸部组织，由于唾液、食物而始终处于湿润状态，更容易滋生细菌、霉菌等微生物，导致填充物过早降解。另外，不同于其他脸部组织，为了抵抗因说话、咀嚼、吞咽过程等多样活动导致的应力，口腔软组织具有有别于其他人体组织的独特性质。因此，用于牙龈组织充填和再生的凝胶至少要包括：良好的抗压和支撑能力来抵抗说话、咀嚼、吞咽过程等多样活动导致的应力；良好的抑菌功效来抵抗口腔细菌过多的环境以及良好的组织再生诱导能力。

4、另外，还存在诸如填充物的丁达尔效应导致填充物呈现蓝色，影响美观；填充物的排斥反应，导致机体出现急慢性的过敏反应；单一的填充作用，填充物降解后需要反复多次的填充，增加患者痛苦和经济压力；为此，提供一种含有胶原蛋白和有道牙龈组织再生的生长因子的牙龈再生凝胶的制备方法，用于牙龈萎缩后的充填以及诱导牙龈组织的再生。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、本发明可以解决现有的凝胶，容易被分解，抗压、支撑和抑菌能力差，影响美观，容易出现过敏反应和填充次数多的难题。

3、(二)技术方案

4、为了实现上述目的，一方面，本发明采用以下技术方案，一种用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，具体包括以下步骤：

5、s1、脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白的提取：取新生牛的牛跟腱，经磨碎牛跟腱、研磨完成的牛跟腱用胰蛋白酶进行消化及脱杂蛋白处理、离心、盐析、透析和添加mg+，获得脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白；

6、s2、制备交联透明质酸；

7、s3、将s1中提取的脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白与s2中的透明质酸交联，获得胶原蛋白-透明质酸缓冲液；

8、s4、添加牙龈效果的色素：交联后的胶原蛋白-透明质酸缓冲液中添加牙龈用淡粉色效果色素，搅拌均匀，获得初始凝胶：胶原蛋白-透明质酸凝胶；

9、s5、添加生长因子：将生长因子添加到胶原蛋白-透明质酸凝胶中，搅拌后获得成品凝胶。

10、作为本发明的一种优选技术方案，所述s1中，脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白的提取的具体步骤为：

11、s11、抗原:取新生牛的牛跟腱，切成5mm左右的块状，静置浸泡于5％-10％浓度范围的过氧化氢溶液中，块状牛跟腱与过氧化氢的比例为1g：5-10ml；浸泡时间为5-10h，浸泡完成后使用超声波清洗机清洗，清洗参数：500-800w，4-8h，清洗用水量1g:20-50ml水，换水频率55-65min/次；

12、s12、磨碎牛跟腱：清洗完的牛跟腱在液氮中冷冻30min-2h,冷冻完成后使用研磨机磨碎，研磨条件：-45℃--35℃，转速：1500-4500r/min，研磨时间：20-40min；

13、s13、研磨完成的牛跟腱用胰蛋白酶进行消化及脱杂蛋白：按每kg胶原样品加5g-15g胃蛋白酶的比例称取胃蛋白酶，用0.9-1.1l的2％-5％透明质酸c溶液溶解后加进胶原样品中，搅拌均匀，获得消化后的胶原；

14、s14、离心：将消化后的胶原装进离心瓶，9000-11000rpm持续40-60min分钟，离心后取上清；

15、s15、盐析：离心后胶原样品中滴加naoh溶液调节胶原液的ph至4.6±0.5，按m/v＝146.5(g/l)的比例加入氯化钠粉末，搅拌均匀按m/v＝146.5(g/l)的比例加入氯化钠粉末，同时搅拌均匀，待下层液澄清，取出上层沉淀，按v/m＝30(l/kg)的比例加入0.9-1.1％的透明质酸c溶液溶胀，放于2～8℃冰箱46-50小时；

16、s16、透析：使用纯化水透析48-80h，15-17h换液一次；

17、s17、添加mg+：将0.5-1mol/l的氯化镁添加到透析后的胶原蛋白溶液中，添加比例氯化镁：胶原蛋白溶液＝1ml：85-100ml，添加后搅拌均匀，即获得脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白。

18、作为本发明的一种优选技术方案，所述s2中，制备交联透明质酸的具体步骤为：770kd 0.9-1.1g的透明质酸溶解在氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液参数为：0.2mol/l-0.5mol/l，4-10ml，搅拌均匀；加入二甲基亚砜作为交联剂，重量比例为：透明质酸：交联剂＝7-15:1，混合后静置55-65min，即获得交联透明质酸。

19、作为本发明的一种优选技术方案，所述s3中，脱杂蛋白和去抗原的胶原蛋白与透明质酸交联的具体步骤为：

20、s31、取添加完氯化镁的胶原蛋白溶液和交联透明质酸溶液混合，比例为1：2-3，混合后将混合溶液添加到交联液中交联5-8h，交联液中包括50mmol/l的1，4丁二醇二缩水甘油醚、20mmol/lnhs和90％乙醇；

21、s32、交联后使用磷酸盐缓冲液清洗，清洗后离心去除交联剂残留。

22、作为本发明的一种优选技术方案，所述s5中，添加生长因子的具体步骤为：先将0.01g生长因子溶于1ml纯化水中，然后将1ml生长因子溶液添加到1l胶原蛋白-透明质酸凝胶，机械搅拌25-35min得到注射用成品凝胶。

23、作为本发明的一种优选技术方案，所述s5中，生产因子设置为：具有软组织再生作用的碱性成纤维细胞生长因子或转化生长因子-β。

24、(三)有益效果

25、1.本发明提供的用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，其添加抑菌成分mg+，抵抗口腔的复杂环境；

26、2.本发明提供的用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，其整体具有良好的抗压能力，抵抗说话、咀嚼、吞咽过程等多样活动导致的应力；

27、3.本发明提供的用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，其采用透明质酸和胶原蛋白复合物并添加色素，避免单一的透明质酸填充带来的丁达尔效应；

28、4.本发明提供的用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，其采用胎牛的牛跟腱，相对于成年牛，本身的免疫原物质较少。同时在胶原蛋白制备过程中添加去抗原工艺，使产品具有良好的生物相容性，避免填充后的排斥反应；

29、5.本发明提供的用于牙龈充填和再生的凝胶制备方法，添加可诱导软组织再生的生长因子，填充的同时诱导自身牙龈组织的再生与重建，避免患者反复填充带来的痛苦和经济压力。