一种靶向仿生外泌体囊泡、制备方法及应用

本发明属于纳米制剂，涉及一种靶向仿生的重组外泌体囊泡、制备方法及其应用。

背景技术：

1、免疫疗法已成为治疗恶性肿瘤的重要手段之一，正常情况下，人体内的t细胞可以监测并清除肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞通过上调程序性死亡配体1（pd-l1）的表达来逃避免疫监视，其与t细胞表面的程序性死亡受体1（pd-1）相互作用以引发免疫检查点的屏蔽。pd-1/pd-l1抗体作为肿瘤免疫治疗的代表药物，在治疗肿瘤方面显示出很好的前景，但是患者的反应率低，个体差异大，临床转化受到一定限制（padmanee sharma, et,al. primary,adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy[j]. cell. 2017, 168(4): 707-723.）。

2、肿瘤来源的外泌体携带有母族细胞的大量信息，通过转移其内含的 mirna、mrna和蛋白质来促进肿瘤发展、转移、血管生成和免疫逃逸。最新研究表明肿瘤细胞衍生的外泌体pd-l1（exopd-l1）能够远程使t细胞失活，阻止其确定肿瘤的位置以发起抗癌攻击（gangchen, et,al. exosomal pd-l1 contributes to immunosuppression and isassociated with anti-pd-1 response[j]. nature. 2018, 560(7718): 382-386.）。并且，抑制exopd-l1的分泌可以诱导全身性的抗肿瘤免疫反应和记忆(mauro poggio, et,al. suppression of exosomal pd-l1 induces systemic anti-tumor immunity andmemory[j]. cell. 2019, 177(2): 414-427.)。因此，exopd-l1成为一个潜在的免疫治疗靶点，通过抑制exopd-l1的分泌，可以解决目前pd-l1抗体治疗存在的抵抗性问题。

3、rna干扰具有选择性强、特异性好、作用迅速、基因沉默效率高等优点。。sirna入胞后与细胞中的蛋白质结合形成 rna 诱导沉默复合物，该复合物寻找并结合特定序列的mrna ,对 mrna 进行酶切。酶切后的 mrna 片段被胞质中的核酸酶非特异性降解, 结果使目标蛋白无法表达,实现基因沉默。肿瘤治疗需要将药物精确地递送至肿瘤细胞，但是裸露的sirna十分不稳定，易被核酸酶降解。此外，其分子量大、亲水性强且荷负电的特性，导致其无法直接穿过细胞膜，需要借助载体进行体内递送。病毒载体转染效率较高，但是制备工艺复杂难控，且存在潜在的安全性问题。阳离子纳米载体通常生物相容性差，不可降解，对重要器官存在潜在的毒性，并且由于阳离子载体对sirna的强吸附，难以实现sirna在细胞质中的有效解离（sei yonezawa, et,al. recent advances in sirna deliverymediated by lipid-based nanoparticles [j]. adv drug deliv rev. 2020,154:64-78）。由递送载体决定的sirna转染效率始终是限制此类药物临床转化的主要因素。

4、外泌体作为天然内源性的核酸转运载体，具有毒性低、无免疫原性、渗透性好等优势。并且，外泌体作为细胞内信使，通过与靶细胞膜融合，能够将功能rna分子、蛋白质、脂类等转移到位于肿瘤微环境或远端的受体细胞。同时，外泌体含特定的磷脂和功能性膜蛋白，当其作为药物载体时，可通过内吞、膜融合或间隙连接等途径向胞内递送内容物，使其避开内涵体-溶酶体途径，有利于提高递送效率（ginini lana, et,al. insight intoextracellular vesicle-cell communication: from cell recognition tointracellular fate[j]. cells. 2022,11(9):1375.）。但是天然来源的外泌体缺少特异性靶向能力，并且外泌体含有丰富的内含物，广泛参与外界的物质交流和信号传递，以目前的技术条件难以实现对其内含物的替换，一定程度上限制了其临床应用。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的缺陷与不足，提供一种具有良好的生物相容性、肿瘤靶向性和高效递送效率的重组囊泡，制备方法以及该重组囊泡在肿瘤治疗药物制剂领域的应用。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、本发明第一个方面公开了一种靶向仿生外泌体囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）得到纯化的外泌体膜；

5、（2）使磷脂、外泌体膜和靶向配体完全融合，得到空白的仿生外泌体囊泡；

6、（3）制备载基因囊泡、载药囊泡或共载药物和基因的囊泡；

7、其中，所述磷脂为dmpc、dppc、dspc、mppc、mspc、smpc中的至少一种；和/或

8、所述靶向配体为载脂蛋白apoa1、载脂蛋白apob100、靶向多肽crgdyk、靶向多肽crgdfc、靶向多肽crgdyk、单克隆抗体cd147中的至少一种；和/或

9、所述基因为hrs、alix、nsmase2、rab27a所对应的sirna中的至少一种。

10、优选的，所述载基因囊泡的制备方法包括：

11、将基因冻干粉加depc水溶解，加入到步骤（2）得到的空白的仿生外泌体囊泡中，使得基因的终浓度为25～400 μg.ml-1，在温度为25～37 ℃的条件下震荡孵育20～30 min，即得载基因囊泡。

12、优选的，所述载药囊泡的制备方法包括：

13、将疏水性药物用dmso溶液溶解，缓慢滴加到步骤（2）得到的空白的仿生外泌体囊泡中，药物的终浓度为0 .1～0 .3 mg.ml-1；水浴超声处理20～30 min , 磁力搅拌1～2 h后，置于截留分子量为3500～5000的透析袋中透析处理；透析液过滤后得到载药囊泡。

14、更优选的，所述共载药物和基因的囊泡的制备方法包括：

15、步骤（5）得到的载药囊泡加入含基因的depc水溶液，基因的终浓度为25～400 μg.ml-1，在温度为25～37 ℃的条件下震荡孵育20～30 min，即得共载药物和基因的囊泡。

16、优选的，所述疏水性药物为抗癌药物；优选的，所述抗癌药物包括阿霉素、蛇床子素、紫杉醇、去氢骆驼蓬碱、喜树碱、奥沙利铂、依托泊苷、西妥昔单抗和pd-l1抗体中的至少一种。

17、优选的，步骤（2）中所述外泌体膜、磷脂、靶向配体的质量比为（50:100）~（25:0.5）~2。

18、优选的，所述步骤（1）包括：

19、s11、将间充质干细胞培养后收集细胞培养液，过滤后取上清液，再过滤得到悬液，所得悬液中包含外泌体；

20、s12、将s11所得到的外泌体沉淀以500~2000倍超纯水重悬，反复吹打涡旋8~12min，使外泌体吸水破裂；离心后洗涤沉淀，所得沉淀即为纯化的外泌体膜。

21、优选的，所述步骤（2）包括：

22、s21、取磷脂溶于氯仿，制成磷脂溶液；将磷脂溶液置于圆底烧瓶，旋转蒸发除去氯仿形成磷脂薄膜；

23、s22、配制外泌体溶液和靶向配体溶液；将外泌体溶液、靶向配体溶液与磷脂溶液等体积的稀释液加入圆底烧瓶，40-50 ℃条件下水化30~60 min；

24、s23、待磷脂薄膜完全脱落后进行水浴超声15~30 min，使磷脂、外泌体膜和靶向配体完全融合得到融合液；

25、s24、然后将所述融合液以300w功率的探头超声2~5 min，过滤，即得到空白的仿生外泌体囊泡。

26、本发明第二个方面公开了上述方法制备得到的靶向仿生外泌体囊泡。

27、本发明第三个方面公开了一种药物，所述药物包括上述的靶向仿生外泌体囊泡。

28、在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的缩写如下：

29、（1）缩写“apoa1”全称为：血清载脂蛋白a1。

30、（2）缩写“apob100”全称为：血清载脂蛋白b100。

31、（3）缩写“dppc” 全称为：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱。

32、（4）缩写“mspc” 全称为：1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂。

33、（5）缩写“dmpc” 全称为：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。

34、（6）缩写“dspc” 全称为：二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

35、（7）缩写“mppc” 全称为：1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基卵磷脂。

36、（8）缩写“sppc” 全称为：1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂。

37、（9）缩写“smpc” 全称为：1-硬脂酰基-2-棕榈酰基卵磷脂。

38、本发明提供一种靶向仿生的外泌体囊泡。

39、（1）所述仿生囊泡承袭了天然外泌体膜，包含天然外泌体膜蛋白和磷脂，具备与外泌体类似的药物/基因递送行为和生物相容性。

40、（2）所述仿生囊泡的制备材料，在保留其特征膜蛋白的同时去除了基因、蛋白等外泌体内含物，扩大了载药空间，提高了安全性。

41、（3）所述的磷脂为dmpc、dppc、dspc、mppc、mspc、smpc中的一种或多种。

42、（4）所述的靶向配体包括载脂蛋白apoa1和apob100，靶向多肽crgdyk、crgdfc和crgdyk、以及单克隆抗体cd147中的一种。

43、（5）所述外泌体膜、磷脂、靶向配体的质量比为50:100~25:0.5~2。

44、本发明的一个优选实施例中提供了一种靶向仿生的重组外泌体囊泡的制备方法，包括以下步骤：

45、（1）将间充质干细胞（bmscs）置于含10%胎牛血清的完全培养基中，于37 ℃、5%co2的环境中培养至细胞覆盖度达50~80%，移去培养基，ph7.4 pbs轻轻冲洗3次，加入无血清的培养基继续培养，24~48 h后收集细胞培养液，置于4 ℃条件下保存待处理。将收集得到的细胞培养液经0.22 μm滤膜过滤后，于200～500 r·min-1离心8~12 min，离心后取上清液于1.8~2.2×103 r·min-1离心18~22 min，再取上清液于0.8~1.2×104 r·min-1离心28~32 min，最后将上清液以1~1.5×105 r·min-1离心65~75 min后，弃上清液，用100~300 μlph7.4 pbs重悬沉淀，0.22 μm滤膜过滤，所得悬液中包含外泌体，-80 ℃下保存。

46、（2）将步骤（1）所得到的外泌体沉淀以500~2000倍超纯水重悬，反复吹打涡旋8~12min，使外泌体吸水破裂。1~1.5×105 r·min-1离心10~20 min，弃上清液，以超纯水洗涤沉淀3~5次，所得沉淀即为纯化的外泌体膜，-80 ℃保存备用。

47、（3）取适量磷脂溶于氯仿，配成浓度为1~3mg·ml-1的溶液。将磷脂溶液置于圆底烧瓶，旋转蒸发除去氯仿形成磷脂薄膜。取适量步骤（2）得到的外泌体膜和靶向配体，以纯水稀释，配成浓度为1~3mg·ml-1的外泌体溶液和10~50μg·ml的靶向配体溶液，将与磷脂溶液等体积的稀释液加入圆底烧瓶，45 ℃条件下水化30~60 min，待磷脂薄膜完全脱落后进行水浴超声15~30 min，使磷脂、外泌体膜和靶向配体完全融合。然后将上述体系以300w功率的探头超声3~5 min（工作2s，停2s），0.22 μm滤膜过滤，即得到空白的仿生外泌体载体。

48、（4）将基因冻干粉加适量depc水溶解，加入到步骤（3）得到的空白的仿生外泌体载体溶液中，基因的终浓度为25～400 μg.ml-1，在温度为25～37 ℃的条件下震荡孵育20～30min，即得载基因囊泡。

49、（5）将疏水性药物用适量 dmso溶液溶解，缓慢滴加到步骤（3）得到的空白的仿生外泌体载体溶液中，药物的终浓度为0 .1～0.3 mg.ml-1；水浴超声处理20～30 min , 磁力搅拌1～2 h后，置于截留分子量为3500～5000的透析袋中透析处理；透析液用0.45 μm微孔滤膜过滤, 得到载药囊泡。

50、（6）将步骤（5）得到的载药囊泡加入基因水溶液，基因的终浓度为25～400 μg.ml-1，在温度为25～37 ℃的条件下震荡孵育20～30 min，即得共载药物和基因的囊泡。

51、本发明第四个方面公开了按上述制备方法得到的靶向仿生的重组外泌体囊泡的应用，能够将其用作携载抗癌药物和基因的抗肿瘤靶向药物制剂。

52、（1）本发明技术方案中，所述的抗癌药物为阿霉素、蛇床子素、紫杉醇、去氢骆驼蓬碱、喜树碱、奥沙利铂、依托泊苷、西妥昔单抗和pd-l1抗体中的一种。

53、（2）所述的基因为肝细胞生长因子调控酪氨酸激酶底物（hepatocyte growthfactor-regulated tyrosine kinase substrate，hrs）、凋亡连接基因2相互作用蛋白x（apoptosis-linked gene 2-interacting protein x，alix）、中性鞘磷脂酶-2（neutralsphingomyelinase type 2，nsmase2）和rab家族的小gtp酶rab27a（a member of rabfamily gtpases，rab27a）及所述基因所对应的sirna中的一种。

54、（3）进一步的，所述基因与所述空白的仿生外泌体载体的质量比为0.01~0.4:1。

55、（4）进一步的，所述抗癌药物与所述空白的仿生外泌体载体的质量比为0.03~0.3:1。

56、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

57、本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

58、（1）本发明制备的靶向仿生外泌体囊泡承袭了外泌体膜，因而具有较好的生物相容性、低免疫原性、低毒性，能避免吞噬、产生免疫逃逸、循环时间长、能穿透深层组织等优点，而人工合成的纳米载体在多次给药后可诱发机体免疫反应，导致其在体内被快速清除。

59、（2）本发明采用不同细胞来源的外泌体膜所制备的靶向仿生外泌体囊泡具有固有的“归巢”能力，借助特异性的膜表面受体或细胞外基质结合蛋白，可定向趋向性迁移，快速被特定的受体细胞识别、摄取并发挥作用。

60、（3）本发明制备的靶向仿生外泌体囊泡为脂质小囊泡，能够有效地穿过包括细胞质膜、血脑屏障在内的主要生物屏障，在被用于中枢神经系统疾病治疗中有重要的优势。

61、（4）本发明制备的靶向仿生外泌体囊泡具有脂质双分子层结构，可以同时装载亲水和疏水性药物，用以递送核酸、蛋白质和小分子药物。

62、（5）本发明制备的靶向仿生外泌体囊泡能够通过内吞和选择性摄取两种途径递送sirna，这两个过程均能直接避开溶酶体的降解，一定程度上提高胞内有效sirna浓度。

63、（6）本发明采用仿生外泌体载体递送sirna来抑制exopd-l1分泌，解除对t细胞活性的远程屏蔽，进而联合pd-l1抗体发挥协同抗肿瘤的作用，该方向是抗肿瘤免疫治疗研究的一个新思路。