枸杞细胞外囊泡在促进组织修复或生长中的应用

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及枸杞细胞外囊泡在促进组织修复或生长中的应用。

背景技术：

1、枸杞是一种传统中草药，在《本草纲目》中，就记载了枸杞具有强健筋骨、抗疲劳、抗衰老的作用。目前已有研究报道，从枸杞中提取的主要活性成分枸杞多糖具有滋补肝肾、明目、延缓衰老、增强免疫力、降低血糖等生物活性作用。枸杞多糖是枸杞的主要活性成分之一，一般由六种单糖(半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和木糖)和抗氧化剂组成。枸杞提取物的制备过程如下：将枸杞干果(200g)在2升水中煮沸3小时，用滤纸过滤后，置于真空旋转蒸发器，温度60℃。然后在冷冻干燥机中干燥，温度为-80℃，压力为500mtorr。得到的枸杞提取物用pbs溶解后保存于4℃。枸杞提取物与枸杞多糖的制备方法相似。目前对于枸杞的应用多为直接口服或制成水煎液服用。另有研究通过蒸馏和冷冻干燥制成枸杞提取物或枸杞多糖，通过小鼠及细胞实验探究其有效作用。例如：枸杞提取物及其生物活性成分甜菜碱可通过提高amp活化蛋白激酶和乙酰辅酶a羧化酶的磷酸化水平，促进c2c12细胞的分化和能量代谢，提示其有助于预防骨骼肌功能障碍；同时，枸杞多糖被证明能够通过改善亚健康小鼠的骨骼肌组织脂质过氧化水平，增加骨骼肌组织抗氧化酶活性，发挥抗疲劳作用；枸杞水煎液提取物也能增加小鼠腓肠肌和胫骨前肌质量，通过提高小鼠iia型氧化肌纤维的比例增加小鼠平均跑步距离。

2、细胞外囊泡是指从细胞膜剥离或细胞分泌的具有膜结构的囊泡，存在于细胞外，它们具有转移封装的生物活性分子(包括dna、rna、蛋白质和脂质)，促进细胞间通信和调节病理过程的作用。因细胞外囊泡具有已证实的药理活性、满意的生物相容性、特异性的组织靶向性和良好的载药能力，被认为是一种很有前途的治疗活性物质和药物传递载体。与来源于动物的细胞外囊泡，植物来源的细胞外囊泡因分离简单、收率高、来源广泛、活性明显，近年来受到广泛关注。植物细胞外囊泡的形态和组成均与动物细胞外囊泡相似，且具有与来源植物相似的功能，在非细胞自主方式甚至物种间交换信息方面同样发挥着重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种枸杞细胞外囊泡的应用，枸杞细胞外囊泡生物利用度高，可通过肌注等方式提高组织的吸收利用程度，将其应用于骨骼肌的修复中可以促进骨骼肌肌肉增长，具有良好的医学应用前景。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种枸杞细胞外囊泡在制备促进组织修复或生长的药物中的应用；所述枸杞细胞外囊泡的内容物包含糖类。

4、优选地，所述组织为骨骼肌；所述组织修复或生长表现为握力提高或骨骼肌纤维横截面积增长。

5、枸杞是一种传统的中草药，于1987年被中国卫生部将枸杞列为药食同源物种。在李时珍的《本草纲目》中记载，枸杞可以强韧筋骨，有抗疲劳、抗衰老的作用。枸杞水煎液及枸杞多糖也被证明在促进小鼠骨骼肌损伤恢复及骨骼肌生长过程中发挥作用。但目前枸杞及其提取产物多用于口服，生物利用度较低，应用范围较小。因此，我们希望从枸杞中提取出细胞外囊泡(gqdnv)，在使枸杞果实中生物活性成分的更容易被组织细胞吸收利用的同时，探索枸杞更为广泛的用途。

6、本发明提取的gqdnv具有改善肌肉萎缩小鼠骨骼肌肌肉功能，促进骨骼肌生长的作用，但进一步的作用机制还在研究中。与枸杞果实与枸杞多糖等提取物相比，gqdnv的生物利用度高，可通过肌注等方式提高组织的吸收利用程度，具有良好的医学应用前景。同时，作为植物来源的细胞外囊泡，gqdnv同样具有来源广泛、提取率高的优点，易于被细胞吸收，具有作为药物载体的潜力。

7、优选地，所述糖类包括蔗糖、葡萄糖、d-果糖、d-纤维二糖、麦芽糖、d-甘露糖、1，6-脱水-β-d-葡萄糖、海藻糖、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、d-阿拉伯糖、d-半乳糖醛酸、l-鼠李糖、d-木酮糖和阿拉伯糖醇中的至少一种。

8、gqdnv多糖类靶向代谢组结果表明，gqdnv含有的糖类有蔗糖、葡萄糖、d-果糖、d-纤维二糖、麦芽糖、d-甘露糖、1，6-脱水-β-d-葡萄糖、海藻糖、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、d-阿拉伯糖、d-半乳糖醛酸、l-鼠李糖、d-木酮糖、阿拉伯糖醇。

9、优选地，所述糖类在枸杞外囊泡的内容物中的质量百分比为30-40％。

10、植物细胞外囊泡通常拥有与植物相似的生物作用。作为来源于枸杞的细胞外囊泡，我们通过非靶向代谢组测序发现，gqdnv的内容物以多糖和脂类为主。

11、优选地，所述枸杞细胞外囊泡的内容物还包括脂类、萜类、核苷酸及其衍生物、有机酸、酚酸类、生物碱、醌类、内酯类化合物、氨基酸及其衍生物、黄酮、芪类、维生素、木脂类和香豆素。

12、优选地，所述枸杞细胞外囊泡的内容物包括以下重量百分比的组分：35.47％糖类、33.05％脂类、8.02％萜类、6.99％核苷酸及其衍生物、6.27％有机酸、5.06％酚酸类、1.69％生物碱、1.06％醌类、0.70％内酯类化合物、0.57％氨基酸及其衍生物、0.56％黄酮、0.24％芪类、0.20％维生素、0.07％木脂类和0.05％香豆素。

13、第二方面，本发明提供所述枸杞细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

14、(1)取新鲜枸杞进行研磨，得到枸杞原液；

15、(2)将所述枸杞原液进行离心处理，弃去沉淀，取上清液，得到含有枸杞细胞外囊泡的粗悬液；

16、(3)利用超速离心机，将上述含枸杞细胞外囊泡的粗悬液进行离心处理，弃去上清液，取沉淀；

17、(4)用磷酸盐缓冲液重悬沉淀后，加至蔗糖密度梯度溶液最上层，离心；取中部密度层间溶液，以提取特定密度区的枸杞细胞外囊泡；

18、(5)将所述溶液用pbs稀释，再次离心，取沉淀，所得沉淀用pbs重悬后，过滤膜，排除残留的非囊泡大粒径颗粒得到枸杞细胞外囊泡。

19、优选地，步骤(2)-((5)均在4℃下进行。

20、优选地，步骤(2)中所述的离心处理，离心力与离心时间依次为1000g离心10min，2000g离心20min；10000g离心60min。

21、优选地，步骤(3)中所述的离心处理为150,000g离心90min。

22、优选地，步骤(4)中所述蔗糖密度梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液浓度范围为8％-60％；所述蔗糖梯度浓度由上至下浓度分别为8％、30％、45％、60％；所述离心为150,000g离心90min。

23、优选地，所述中部密度层为30-45％密度层；所述特定密度区的密度为1.13-1.19g/ml。

24、优选地，步骤(5)中所述离心为150,000g离心90min。

25、优选地，步骤(5)中过的滤膜分别为0.44μm和0.22μm的滤膜，以排除残留的非囊泡大粒径颗粒，得到含有gqdnv的溶液。

26、超速离心法是分离植物细胞外囊泡的金标准，具有低成本和低污染率，适用范围广的特点。一般情况下，植物在被打碎制成液体后，先于低速(离心力：500-10,000g)离心去除死细胞和细胞碎片，然后以高速(离心力：40,000-100,000g)离心将细胞外囊泡富集于沉淀中。在实际操作中，常根据样品的性质设置具体的离心条件和次数。由于植物成分和结构的差异，用同一种分离方法从不同来源获得的细胞外囊泡可能存在较大差异，反映在颗粒大小、产量或纯度上。

27、在密度梯度离心法中，比溶剂密度大的颗粒会沉淀，而密度小的颗粒会漂浮。因此，悬液离心后在8-30％密度层、30-45％密度层和45-60％密度层间均出现半透明带。取30-45％密度层间溶液，以提取特定在其特征密度区(1.13-1.19g/ml)的细胞外囊泡。

28、本技术方案利用超速离心与密度梯度分离相结合的方法，相较于市面上已有通用的植物细胞外囊泡试剂盒(共沉淀法)和超滤法，具有成本低，污染风险小，样本容量大的优点。目前尚未有从枸杞中成功提取细胞外囊泡的方法及方法。

29、优选地，所述枸杞细胞外囊泡的粒径为113.4-124.6nm。

30、优选地，每1kg枸杞可提取1×1012个所述枸杞细胞外囊泡。

31、第三方面，本发明提供一种药物制剂，其特征在于，包含枸杞细胞外囊泡和药学上可接受的载体。

32、优选地，所述药物制剂的服用方法为注射、灌胃或口服。

33、优选地，所述注射用量为7.5mg/kg·bw。

34、本发明的有益效果在于：

35、(1)利用超速离心法和蔗糖密度梯度离心法相结合，成功从新鲜枸杞中分离得到gqdnv，总结出了一种能够稳定且高效地从新鲜枸杞中分离得到gqdnv的方法。

36、(2)证明了gqdnv富含枸杞多糖等生物活性物质。

37、(3)提供了gqdnv的应用，如以gqdnv作为干预物从而达到促进组织修复/生长等作用、以gqdnv作为药物载体应用于医疗领域等。已证明了能够改善肌肉萎缩小鼠的运动功能，促进骨骼肌生长。虽然相关研究仍在进行中，但gqdnv在具有多种生物学活性物质的同时有更好的生物利用度，能够通过肌注等方式直接被组织细胞吸收，具有良好的医学应用前景。