一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统与流程

本发明属于基因检测，具体涉及一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统。

背景技术：

1、微小残留病灶（minimal residual disease，mrd）被认为是疾病复发的主要来源，目前临床常用的随访监测手段为血癌胚抗原和pet/ct等影像学手段，但往往不能灵敏地反映微小残留病灶，对于患者的复发监测效果灵敏度较低。因此，近年来出现了基于血浆中肿瘤游离核酸（circulating tumor dna，ctdna）为微小残留病灶的复发监测手段。

2、对于基于血浆中肿瘤游离核酸ctdna的mrd检测，主流的检测技术包括肿瘤知情分析（tumor-informed）和肿瘤不知情分析（tumor-agnostic）两种路线。肿瘤知情分析路线通常先进行组织全外显子wes检测，用配对血检测精准地排除非肿瘤来源的变异，然后针对组织检测结果定制个性化的基因组合（panel）进行超高深度测序进行肿瘤变异的监控；肿瘤不知情分析路线一般是对血液进行固定基因组合检测，仅凭血液检测获得最高的敏感性。其中肿瘤知情分析路线需要针对每个患者设计个性化的追踪基因组合，但难以解决肿瘤发生发展过程中的时空异质性问题，无法追踪新发突变，并且很难标准化，且成本较高。与之相对比的是，肿瘤不知情分析路线通常采用已经设计好的固定化基因组合来进行检测，可以获取更多变异信息，流程可标准化，同时可研究克隆演化。但固定化基因组合的难点在于靶标集合针对哪些位点，将直接影响到可追踪的患者比例，并且对检测技术灵敏度要求较高。

3、综上所述，提供一种能够将可追踪患者比例最大化的固定化基因组合用于结直肠癌样本的微小残留病灶mrd监测，同时控制基因组合大小，压缩测序量，降低患者的检测经济负担，并达到较高的灵敏度，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。

4、中国发明专利，公开号为cn113284554公开了一种筛查结直肠癌术后微小残留病灶及预测复发风险的循环肿瘤dna检测系统及应用，但它需要获取患者原发肿瘤组织先进行425基因组合检测，再对患者血浆进行监测。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法及其检测系统。所述靶标集合的筛选方法用于固定化基因组合检测mrd的策略，可用于超过99%的结直肠癌患者mrd检测，无须患者肿瘤组织，适用性广，且容易标准化。灵敏度高，单点突变检测灵敏度达0.05%，mrd检测灵敏度达0.005%，基因组合的数量小，仅291 kb，测序数据量要求较低，相应地，患者的经济负担较低。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

4、（1）收集结直肠癌相关的高频突变基因及相应的突变区域，记为起始靶标集合p0；

5、（2）分析公共数据库中结直肠癌肿瘤样本数据；过滤掉公共数据库中注释的所有的良性变异或疑似良性变异；统计起始靶标集合p0区域发生变异的患者集合记为pt0；

6、（3）统计公共数据库中结直肠癌样本中出现的所有突变对应的基因，计算每个基因的群体突变频率；

7、（4）筛选群体突变频率≥10%的基因，记为集合fg；计算集合fg中基因的每个外显子的突变指数mi；根据mi值进行判断，将对应的外显子纳入起始靶标集合p0；补充后的靶标集合为p1，在上述区域发生变异的患者集合为pt1；

8、（5）筛选群体突变频率<10%的基因，记为集合lfg；计算集合lfg中基因的每个外显子的突变指数mi；根据mi值进行判断，将对应的外显子纳入靶标集合p1；补充后的靶标集合为p2，在该区域发生变异的患者集合为pt2；

9、（6）计算潜在驱动基因的每个外显子的突变指数mi；挑选mi≥20的外显子，分别做以下判断：在靶标集合p2中加入所述外显子，重新统计相应的靶标集合区域发生变异的患者集合pt，若pt相对于pt2至少增加1个患者，则保留所述外显子，相应的靶标集合则更新为靶标集合p3，在所述靶标集合对应区域发生变异的患者集合为pt3；否则所述外显子不纳入靶标集合p2；

10、（7）对靶标集合p3进行精简，精简后相应的靶标集合则更新为靶标集合p4，在靶标集合p4对应区域发生变异的患者集合为pt4；

11、（8）对于靶标集合p4中的克隆性造血基因突变进行过滤；过滤后相应的靶标集合则更新为靶标集合p5，在靶标集合p5对应区域发生变异的患者集合为pt5。

12、本发明中，对于群体突变频率≥10%的基因，通过分析每个外显子的突变指数mi的分布，对于mi值较突出的外显子纳入靶标集合，对于mi值分布较平缓，即基因可能无突变热点，则将该基因所有外显子均纳入靶标集合。

13、本发明中，对于群体突变率<10%的基因，则挑选mi≥20的外显子纳入靶标集合。当mi筛选标准更低，例如筛选mi≥10的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更多，会使得基因靶标集合范围更大，增加检测成本。当筛选标准更高，例如筛选mi≥30的外显子，筛选得到的靶标集合中的外显子区段的数目更少，会使得基因靶标集合范围更小，虽然检测成本会一定程度上降低，但是所得靶标集合对有的肿瘤患者可能无法覆盖其所含的突变，即该靶标集合覆盖的肿瘤患者比例可能降低，影响最终的临床使用。

14、进一步地，以mi为标准，对潜在的驱动基因部分外显子也纳入靶标集合，进一步扩大靶标集合覆盖的患者比例。同时对于长度较长的外显子，通过细分120bp区段，将其进行更细致的分析，仅纳入能够扩大覆盖患者数目的区段，将靶标集合进行精简。

15、本发明中，在筛选靶标集合时，还剔除了克隆性造血基因突变、已及良性变异，进一步精简了靶标集合中与结直肠癌微小残留病灶无关的基因突变位点，使得所述靶标集合更合理，增加其应用时的准确度。

16、本发明所述筛选方法可适用于任意癌种的微小残留病灶靶标集合的筛选，在覆盖患者变异数目最大化的同时压缩靶标集合的区域范围，以达到节约成本的目的，同时不牺牲检测性能。

17、优选地，步骤（1）中，所述靶标集合包括下表（表1）所示区域。

18、表1

19、

20、。

21、优选地，步骤（2）中，所述公共数据库为cosmic数据库和tcga数据库。

22、公共数据库中信息分析两个维度：1）相应结直肠癌患者的基因变异情况，包括具体的基因、变异位点等信息；2）对特定基因变异集合，分析具有至少一个集合内的变异位点的患者数目及对应的比例。通过分析维度1的数据确定待考量的外显子信息，再通过分析维度2的数据，计算出相应的外显子突变指数mi及患者集合的变化情况，判定是否纳入相应的外显子。

23、优选地，步骤（2）中，所述良性变异或疑似良性变异对应的数据库为clinvar数据库和cosmic数据库。

24、优选地，步骤（3）中，所述群体突变频率=在所述基因发生变异的患者样本数目/肿瘤患者样本总数。

25、优选地，步骤（4）中，所述突变指数mi为每个外显子每1000 bp区域上发生变异的结直肠癌患者数量。

26、优选地，步骤（4）中，所述根据mi值进行判断的标准为：

27、（a）若所述基因外显子的突变指数mi值集合中最大值>2*平均值，则将该集合中>2*平均值的mi对应的外显子纳入起始靶标集合p0；

28、（b）若所述基因外显子的突变指数mi值集合中最大值<2*平均值，则将该基因所有的外显子纳入起始靶标集合p0。

29、优选地，步骤（5）中，所述根据mi值进行判断的标准为：筛选突变指数mi≥20的外显子，将所述外显子纳入起始靶标集合p1。

30、优选地，步骤（6）中，所述潜在驱动基因包括：acvr2a、amer1、araf、b2m、ctnnb1、hras、map2k1、mdm2、mdm4、med12、msh6、myc、ncoa4、notch1、notch2、pms2、pole、prdm2、pten、ptpn11、ptprd、rnf43、sox9、stat3、tcf7l2、tgfbr2或znrf3中的一种或至少两种的组合。

31、优选地，步骤（7）中，所述精简的标准包括：

32、针对靶标集合p3中长度>2 kb的外显子，将所述外显子以120 bp为区段进行分割，将靶标集合p3中每个120 bp区段进行去除后，分析pt3中患者数目是否减少；若减少，则所述120 bp保留；若未减少，则所述120 bp区段从靶标集合p3中去除。

33、优选地，步骤（8）中，所述克隆性造血基因突变对应的基因包括：dnmt3a、tet2、asxl1、ppm1d、sf3b1、cbl、crebbp、tnr、tg、sphka、muc5b、herc2、dnah8或astn1中的任意一种或至少两种的组合。

34、第二方面，本发明提供一种用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合，所述靶标集合由第一方面所述的筛选方法筛选得到。

35、优选地，所述靶标集合包括177个基因中的426个外显子区段，所述靶标集合具体区域如下表（表2）所示；

36、表2

37、

38、

39、

40、

41、

42、。

43、本发明中，所述靶标集合包括177个基因，总共包括426个外显子区段，所述靶标集合的区域大小为291 kb。所述靶标集合的区域精简，所需测序数据量较少，成本低。检测灵敏度高，能准确反映微小残留病状态，对患者的分子缓解状态进行持续跟踪，从而对根治性治疗的疗效进行评估，提前预测复发，对结直肠癌患者的术后临床管理具有重大意义。

44、第三方面，本发明提供一种第二方面所述的靶标集合对应的检测结直肠癌微小残留病灶的探针，所述探针的长度为110-130 bp，并以头尾相接的形式覆盖第二方面所述的靶标集合。

45、本发明中，所述单个探针的长度为110-130 bp，优选为120 bp。本发明中的探针能够高效地捕获出靶标集合对应的分子片段，捕获效率＞70%。

46、第四方面，本发明提供一种检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒，所述试剂盒包括第三方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针。

47、优选地，所述试剂盒还包括：基因组预文库构建试剂、接头、杂交捕获试剂或杂交产物扩增试剂中的任意一种或至少两种的组合。

48、优选地，所述接头为带有分子标签的接头。

49、第五方面，本发明提供一种结直肠癌微小残留病灶mrd的检测系统，所述检测系统包括：

50、（1）血浆突变筛查模块：所述血浆突变筛查模块用于对血浆进行样本提取、建库、上机测序及突变分析；所述血浆包括基线血浆和监测血浆，所述基线血浆为结直肠癌患者根治性治疗前血浆，所述监测血浆为结直肠癌患者根治性治疗后血浆；所述血浆突变筛查模块包括如下单元：

51、（a）外周血样本核酸提取单元：收集外周血作为基线样本或监测样本，分别从样本中提取血细胞gdna及血浆样本中的cfdna；

52、（b）基因组预文库制备单元：利用所得dna样本制备基因组预文库，所述基因组预文库包括gdna预文库和cfdna预文库；

53、（c）杂交捕获单元：利用第三方面所述的探针与所述基因组预文库进行杂交捕获，得到靶标dna片段；

54、（d）扩增测序单元：以所述靶标dna片段为模板进行扩增得到靶向捕获文库，所述靶向捕获文库包括cfdna靶向捕获文库和gdna靶向捕获文库；对靶向捕获文库进行双端测序；

55、（e）分析单元：对测序序列进行质控评价，以白细胞dna文库测序数据作为对照，进行对比识别血浆cfdna杂交捕获文库中的基因突变；

56、（f）突变过滤单元：对于基线样本或监测样本中的基因突变进行过滤；基线血浆基因突变集合记为lp1；监测血浆基因突变集合记为lp2；

57、（2）结直肠癌患者微小残留病mrd状态判断模块：比较lp1及lp2，若lp1中任意一个突变存在于lp2，和/或lp2中突变数目≥5%*lp1中突变数目，则判定为mrd阳性；否则为mrd阴性。

58、优选地，所述基因组预文库制备单元中，对所得样本dna进行酶切、末端修复、加腺嘌呤a，连接接头后，磁珠纯化，pcr扩增富集，通过qubit荧光计对文库进行定量和通过安捷伦2100生物分析仪进行质控检测后，得到血细胞gdna基因组预文库和cfdna预文库。

59、优选地，所述杂交捕获单元中，血细胞gdna预文库与cfdna预文库杂交投入量为1:(4-6)。

60、优选地，所述杂交捕获单元中，血细胞gdna预文库与cfdna预文库杂交投入量为1:5。

61、优选地，所述扩增测序单元中，cfdna靶向捕获文库的测序深度为30000~50000×，gdna靶向捕获文库的测序深度为5000~10000×。

62、优选地，所述突变过滤单元中，对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：

63、（i）在dbsnp、gnomead和1000genomes数据库中的出现频率大于1%的基因突变过滤掉；

64、（ii）对于在cosmic数据库中记录频数≥20次的常见基因突变，要求基因突变等位基因频率vaf≥0.1%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥2；对于在cosmic数据库中记录频数<20次的变异，要求基因突变等位基因频率vaf≥0.25%，支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥5；否则过滤掉所述基因突变；

65、（iii）以健康人的血浆游离dna进行建库测序作为背景，患者的基因突变频率高于背景中的最大突变频率的1.5倍，则认定所述基因突变为存在于所述患者的血浆游离dna中的真实基因突变，否则将其从患者基因突变列表中过滤掉；

66、经过（i）、（ii）和（iii）的过滤，最终所得基线血浆基因突变集合记为lp1。

67、优选地，所述突变过滤单元中，对监测血浆中的基因突变进行过滤的步骤包括：

68、对于存在于lp1集合中的基因突变，要求支持所述基因突变的带有独特分子标签的测序读数≥1即可保留；对于不在lp1集合中的突变，进行突变过滤，所述突变过滤的步骤参照对基线血浆中的基因突变进行过滤的步骤，最终所得监测血浆突变集合记为lp2。

69、第六方面，本发明提供第一方面所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合的筛选方法、第二方面所述的用于检测结直肠癌微小残留病灶的靶标集合、第三方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的探针、第四方面所述的检测结直肠癌微小残留病灶的试剂盒或第五方面所述的结直肠癌微小残留病灶mrd的检测系统在制备结直肠癌微小残留病灶检测产品中的应用，和/或在制备结直肠癌患者复发预测产品中的应用。

70、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

71、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

72、（1）本发明所述靶标集合在数据模拟中能够覆盖99%患者（≥1个突变），对于超90%结直肠癌患者组织样本能覆盖4个以上突变。

73、（2）可以采用固定化基因组合实现对不同结直肠癌患者的微小残留病状态进行监测，毋需对每个患者进行定制，容易标准化。

74、（3）本发明所述靶标集合及其试剂盒能够覆盖结直肠癌患者根治性治疗前血浆平均6个突变，通过监测突变数量的增加，能够显著提高mrd检测灵敏度。

75、（4）本发明所述检测系统无须对肿瘤组织进行检测，对于肿瘤组织无法获得的患者也具有适用性，应用范围更广。

76、（5）由于治疗后ctdna含量极低，因此在ctdna-mrd检测场景下通常需要30000×~100000×测序深度。本发明所述靶标集合的区域精简，仅291 kb，所需测序数据量较少，成本低，具有经济性。

77、（6）本发明所述试剂盒检测灵敏度高，对单个点突变的检测灵敏度达0.05%，在样本层面微小残留病灶状态的检测灵敏度高达0.005%，能够准确反映微小残留病状态，应用前景广阔。