一种复合ROS响应型水凝胶及其制备方法与应用

本技术涉及水凝胶，尤其涉及一种复合ros响应型水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、当恒牙牙髓受到细菌、机械、化学等刺激出现感染和炎症反应时，最常用的治疗方案是根管治疗，但该种治疗方案未能保留具有营养、感知、免疫和修复功能的牙髓，且技术敏感性和治疗费用较高。近年来，随着牙髓微创治疗理念的发展和治疗手段的更新，活髓保存治疗逐渐成为牙髓炎的又一可行治疗方案。恒牙活髓保存治疗通过去除感染硬组织及受累牙髓，在近髓牙本质表面或已暴露的牙髓创面覆盖生物活性盖髓材料，以消除病变、促进受损牙髓的愈合。然而，目前的盖髓制剂主要适用于健康牙髓创面，对于炎性牙髓疗效不佳。研发新型盖髓材料用于炎症牙髓活髓保存，有望改善活髓保存治疗的临床疗效，最大化保存健康牙髓，对提高患者生活质量、降低牙髓疾病治疗成本具有重要意义。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够缓释小细胞外囊泡的复合ros响应型水凝胶及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种复合ros响应型水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：

4、(1)在d-甘露醇溶液中加入海藻酸钠、小细胞外囊泡，得到含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液；所述小细胞外囊泡来源于牙囊干细胞；

5、(2)将步骤(1)的含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、rhb-ac单体、ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂混合进行交联反应，得到复合ros响应型水凝胶；所述rhb-ac单体溶液中rhb-ac单体的质量百分比为8.5-10％；所述rhb-ac单体的结构式如下式所示：

6、

7、本技术通过将含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液与rhb-ac单体、助剂混合进行交联反应，得到一种操作性和生物相容性良好、能够缓释小细胞外囊泡的复合ros响应型水凝胶。

8、本技术的小细胞外囊泡(sev)来源于牙囊干细胞(dfscs)，牙囊干细胞是一类易于获取的牙源性间充质干细胞，具有促进炎性牙髓修复的作用，sev是干细胞发挥旁分泌作用的重要效应分子，因此通过多步分离提取dfscs中的sev，通过体外实验验证发现来源于dfscs的sev具有缓解h2o2诱导的牙髓干细胞(dpscs)氧化应激反应、减少细胞凋亡、促进细胞增殖以及修复dpscs成牙本质向分化的能力；以dfsc-sev作为盖髓材料盖髓至大鼠实验性牙髓炎模型中，实验结果表明dfsc-sev能够缓解牙髓氧化应激损伤，促进创面牙本质桥形成，上述结果均表明dfsc-sev可作为新型盖髓材料用于促进炎症牙髓的修复。然而，在实验的过程中，申请人发现sev在体内应用时易被巨噬细胞清除，具有疗效不稳定的缺陷。在此基础上，申请人通过将sev负载至具有ros响应特性的水凝胶中，使水凝胶在浓度较高ros水平的环境中“按需”释放sev，克服了sev在体内应用的不稳定性缺陷。

9、本技术的rhb-ac单体是一种含有聚合双键的化合物，能够响应所处环境中的hclo/clo-，而hclo/clo-属于ros中的一种，当所处环境中的ros水平到达一定的阈值(如hclo/clo-浓度为50μm)时，rhb-ac单体中的聚合双键被解离，实现响应ros的效果。

10、作为本技术所述制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述海藻酸钠、小细胞外囊泡、d-甘露醇溶液中d-甘露醇的质量比为海藻酸钠：小细胞外囊泡：d-甘露醇＝2:0.0003:1；

11、在步骤(2)中，所述ca2+缓释剂、交联剂、引发剂和催化剂体积之和与含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液、rhb-ac单体溶液的体积比为ca2+缓释剂+交联剂+引发剂+催化剂：含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液：rhb-ac单体溶液＝317.5:2700:25。

12、在优选配比条件下，本技术的复合ros响应型水凝胶的成胶时间相对较长，可在4min内成胶，赋予了水凝胶良好的可注射性，并且得到的水凝胶形状均一、呈白色半透明状，内部结构为多孔、网络状结构，有利于负载sev。本技术选用ca2+缓释剂能够促进海藻酸钠凝结成网络，加入交联剂、引发剂和催化剂有助于产生自由基引发rhb-ac单体聚合形成网络状结构，再与海藻酸钠网络聚合可得到本技术的复合ros响应型水凝胶。

13、作为本技术所述制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述交联剂、引发剂和催化剂的质量分数比为交联剂：引发剂：催化剂＝0.164：0.164：0.008；所述交联剂为n,n’-亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为过硫酸铵；所述催化剂为四甲基乙二胺。过硫酸铵在四甲基乙二胺的作用下产生自由基，引发rhb-ac单体聚合，并在n,n’-亚甲基双丙烯酰胺的作用下rhb-ac聚合物与海藻酸钠交联，形成复合ros响应型水凝胶。

14、作为本技术所述制备方法的优选实施方式，所述ca2+缓释剂包括可溶性钙盐和磷酸氢二钠，所述可溶性钙盐中的ca2+与磷酸氢二钠的摩尔浓度比为ca2+：磷酸氢二钠＝0.08:0.0537。在优选配比条件下，可溶性钙盐和磷酸氢二钠组合为ca2+缓释剂能够使海藻酸钠溶液与ca2+发生离子交换反应的速度放缓，使复合ros响应型水凝胶的形成速度控制在4min左右，使复合ros响应型水凝胶在使用的过程中可以通过注射的方式施用至创面中，无需长时间等待即可成胶。

15、作为本技术所述制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述小细胞外囊泡根据以下方法提取得到：

16、s1、将牙囊干细胞接种至无血清培养基中培养，去除细胞碎片，离心，得到上清液a；

17、s2、将步骤s1的上清液a进行超速离心，得到沉淀a；所述超速离心的转速为100000-120000g；

18、s3、采用pbs重悬步骤s2的沉淀a，洗涤、离心，得到沉淀b，所得沉淀b为小细胞外囊泡。

19、本技术通过多步离心从牙囊干细胞中提取得到sev，通过一系列的鉴定小细胞外囊泡的标志物确定上述提取方法得到的沉淀物为小细胞外囊泡。此外，申请人还通过生物学实验确定牙囊干细胞提取得到的sev能够改善h2o2介导的dpscs氧化与抗氧化失衡，减少细胞凋亡和增殖抑制，修复氧化应激环境dpscs的成牙本质向分化能力，提示sev具有缓解h2o2诱导的牙髓干细胞氧化应激损伤。

20、作为本技术所述制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述交联反应为在20-30℃下搅拌30-40min。本技术复合ros响应型水凝胶的制备方法快速便捷，只需在室温条件下通过搅拌即可实现交联反应，无需苛刻的反应条件以及较长的等待时间。

21、第二方面，本技术提供了一种复合ros响应型水凝胶，根据上述制备方法制备得到。

22、第三方面，本技术提供了上述复合ros响应型水凝胶在制备治疗牙髓炎或促进创面修复的材料中的应用。

23、申请人将复合ros响应型水凝胶作为修复材料应用在治疗牙髓炎中，能够根据炎性牙髓中的ros水平智能缓释sev，起到保护氧化应激受损dpscs、促进dpscs成牙本质细胞向分化，在牙髓创面形成牙本质样屏障，实现炎症牙髓的保存和修复。

24、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述材料为创面敷料、填充料、盖髓材料中的一种。

25、第四方面，本技术提供了一种生物盖髓材料，其包括上述复合ros响应型水凝胶。

26、与现有技术相比，本技术的有益效果为：

27、(1)本技术通过将小细胞外囊泡(sev)负载至能够响应ros的水凝胶中制备为复合ros响应型水凝胶，当复合ros响应型水凝胶所处环境的ros水平升高后，复合ros响应型水凝胶能够快速、敏感地响应ros，并发生降解，使sev从水凝胶中被释放至所处环境中，实现缓释sev的效果，具有促进炎症牙髓修复与保存的效果。

28、(2)本技术的复合ros响应型水凝胶通过含小细胞外囊泡的海藻酸钠溶液与rhb-ac单体和交联剂发生交联反应得到，海藻酸钠和小细胞外囊泡在交联剂的作用下交联为一层网络，再通过交联剂与rhb-ac聚合为第二层网络，能够使小细胞外囊泡均匀分布，避免sev在体内被巨噬细胞清楚，同时根据所处环境的ros水平，智能缓释sev，增强sev对炎症牙髓的保护和修复作用。